专利名称：微藻油脂的检测方法
微藻油脂的检测方法技术领域
本发明属于油脂检测领域。
技术背景
微藻能源是近年来兴起的一种新能源，其中利用微藻油脂生产生物柴油更是得到 了人们的广泛关注。生物柴油具有“碳平衡”的特性，因此能够缓解全球温室效应，而且其 污染物排放水平较石化柴油要低。近年来生物柴油的产量出现了大幅提高，然而生物柴油 高昂的成本和不足的原料供应，阻碍了生物柴油的进一步推广应用。微藻油脂作为生物柴 油的原料，已被提出并经过实验验证，不过受限于培养和收集等成本，还无法与石化能源等 进行竞争。
降低微藻生物柴油成本的方法之一就是提高采收藻细胞的脂含量，从而降低后续 油脂提取成本。由于藻细胞在不同的生长条件下或不同的生长阶段时，其细胞内的脂含量 相差很大，为了优化藻细胞的培养条件，确定合理的采收时间，以得到具有最高脂含量的藻 细胞，需要经常对藻细胞的脂含量进行检测。
称重法是最常用的微藻油脂测定方法，该方法一般是通过高速离心或过滤分离含 微藻的溶液，得到微藻生物质后，将其冻干或烘干，然后再以有机溶剂将细胞所含的油脂提 取出来，称重，并与微藻生物质的干重相除，以得到藻细胞的脂含量。该方法准确度高，但是 所需样品量大，否则准确度会明显下降，并且整个测定过程所需时间较长，若采取烘干，则 干藻粉的制备约需数小时，如果采取冻干，则干藻粉的制备需要数天，油脂的提取过程也需 消耗数小时，测量成本也很高。因此目前迫切需要一种稳定可靠的微藻油脂快速检测方法。发明内容
本发明要解决称重法所需样品大、耗费时间长的技术问题；而提供了微藻油脂的 检测方法。
本发明微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的一、将微藻培养液稀释至 0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一的稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶 液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧 光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下 离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色， 选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度 记为X2 ；四、取步骤一的稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3;五、按公式X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差 值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
本发明微藻油脂的检测方法还可以按下述步骤进行的一、将微藻培养液预处理， 然后稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一的稀释液，然后加入100 μ L 尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温度为4°c、转速为lOOOOr/min的 条件下离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光 下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度， 荧光强度记为X2 ；四、取步骤一的稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波 长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3 ；五、按公式X1_(X2+X3)计算出最大荧 光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂 的检测。
本发明利用尼罗红与脂类物质结合后能够发出荧光信号的特性，能够快速、敏感、 可靠地检测藻类细胞内的脂含量。本发明减少了总消耗时间，降低了成本，所需样品少。本 发明方法适用对小球藻、栅藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、轮藻等单细胞藻类进行检 测，也可对细胞破碎预处理后的大型藻类进行检测。
图1是具体实施方式
二十五发射波长530nm 650nm之间的荧光强度， 表示染 色稀释液，□表示染色上清液；Δ表示稀释液；图2是具体实施方式
二十五的荧光强度-脂 含量标准曲线。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的一、 将微藻培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一的稀释液，然后 加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长 450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为 10000r/min的条件下离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼 罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之 间的荧光强度，荧光强度记为X2 ；四、取步骤一的稀释液，选择400 600nm作为激发波长， 测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3 ；五、按公式Xl-(X2+X3)计 算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成 了微藻油脂的检测。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中稀释含微藻 的溶液用的溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水。其它步骤和参数与具体实 施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二所述尼罗 红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具体实 施方式一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二所述 尼罗红溶液的浓度为0. 001g/L 0. 5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至三之一相 同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二所述 尼罗红溶液的浓度为0. 01g/L 0. 5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二所述 尼罗红溶液的浓度为0. 05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤三所述 尼罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具 体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤三所述 尼罗红溶液的浓度为0. 01g/L 0. 5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至七之一相 同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤三所述 尼罗红溶液的浓度为0. 01g/L 0. 2g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至七之一相 同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤三所述 尼罗红溶液的浓度为0. 05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至十一之一不同的是步骤所 述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不同生 长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心 IOmin,并用蒸馏水清洗3 5次后，取离心所得的微藻生物质，并在_70度条件下冻干获 得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. 8mL蒸馏水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振荡2min后， 超声破碎lmin，再加入Iml氯仿振荡lmin，再加入Iml蒸馏水，再振荡lmin，然后在4000r/ min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提�。� 复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的 培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液，取IOmL稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶 液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧 光强度，荧光强度记为XI，将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心 IOmin,取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择 400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为 X2，取稀释液，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧 光强度记为X3，按公式X1_(X2+X3)计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微 藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度_脂含 量标准曲线。
具体实施方式
十二 本实施方式中微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的 一、将微藻培养液预处理，然后稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一 的稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测 定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温 度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然 后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波 长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2 ；四、取步骤一的稀释液，选择500nm作 为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3 ；五、按公式CN 102033059 A说明书4/7页X1-(X2+X3)计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂 含量；即完成了微藻油脂的检测。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
十二不同的是所述微藻培养液 的预处理采用蒸馏水清洗预处理、二甲基亚砜预处理、超声预处理、冻融预处理、高温预处 理或酸热预处理进行的。其它步骤和参数与具体实施方式
十二相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
十三不同的是蒸馏水清洗预处 理是按下述步骤进行的将微藻培养液离心，弃去上清液后，加入同等体积的蒸馏水(与弃 去上清液的体积相等)，混勻后，再次离心，重复三次后，加入同等体积的蒸馏水后混勻。其 它步骤和参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
十三不同的是二甲基亚砜预处 理是按下述步骤进行的取50mL微藻培养液，加入5mL 二甲基亚砜溶液，振荡IOmin后，离 心，加入50mL蒸馏水使其重新悬浮。其它步骤和参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
十三不同的是是按下述步骤进行 的超声预处理微藻培养液用超声破碎lOmin。其它步骤和参数与具体实施方式
十三相 同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
十三不同的是是按下述步骤进行 的冻融预处理将微藻培养液在-20°C冰冻后在煮沸5min，反复上述操作3次。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
十三不同的是高温预处理是按 下述步骤进行的将微藻培养液在121°C条件下加热20min。其它步骤和参数与具体实施方 式十三相同。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
十三不同的是酸热预处理取 50mL小球藻培养液，高速离心后，向浓缩的培养液中加入10mL，4mol/L HC1，浸泡lh，离心 后，加入50mL蒸馏水，煮沸5min。其它步骤和参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
十二至十九之一不同的是所述尼 罗红溶液的溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。其它步骤和参数与具体 实施方式十二至十九之一相同。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
十二至二十之一不同的是所 述尼罗红溶液的浓度为0. 001g/L 0. 5g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
十二至二十 之一相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
十二至二十之一不同的是所 述尼罗红溶液的浓度为0. 01g/L 0. 2g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
十二至二十之 一相同。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施十二至二十之一不同的是所述尼 罗红溶液的浓度为0. 05g/L。其它步骤和参数与具体实施方式
十二至二十之一相同。
具体实施方式
二十四本实施方式与具体实施方式
十二至二十三之一不同的是 步骤五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下步骤a、从同一藻种的培养液中取处 于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条 件下离心lOmin，并用蒸馏水清洗3 5次后，取离心所得的微藻生物质，并在_70度条件 下冻干获得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸馏水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振荡anin后，超声破碎lmin，再加入Iml氯仿振荡lmin，再加入Iml蒸馏水，再振荡lmin，然后 在4000r/min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯 仿提�。馗慈�。将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤C、 将所取的培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液，取IOmL稀释液，然后加入IOOyL 尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm 之间的荧光强度，荧光强度记为XI，将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条 件下离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下 染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧 光强度记为X2，取稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm 之间的荧光强度，荧光强度记为X3，按X1-(X2+X;3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、 以步骤b所测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标， 绘制荧光强度-脂含量标准曲线。其它步骤和参数与具体实施方式
十二至二十之一相同。
具体实施方式
二十五本实施方式中对小球藻(Chlorella vulgaris)中的油脂 进行检测，具体方法的是按下述步骤进行的
一、将含小球藻(Chlorella vulgaris)的溶液稀释至0. lg/L，得到稀释液；二、 取IOmL步骤一的稀释液，然后加入100 μ L浓度为0. 05g/L的尼罗红溶液，避光，快速混勻 10s,静置15min后，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530 650nm之间的荧光 强度；三、将步骤一稀释后的含微藻的溶液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心 IOmin,取上清液作为空白，然后用尼罗红染色，然后选择500nm作为激发波长，测定在发射 波长530 650nm之间的荧光强度值；四、取步骤一的稀释液，选择500nm作为激发波长， 测定在发射波长530nm 650nm之间的荧光强度(见图1)；五、计算尼罗红染色后的稀释 液与染色后的上清液和未染色稀释液在发射波长530 650nm之间的最大荧光强度差值 (56.幻，将上述最大荧光强度差值根据荧光强度-脂含量标准曲线(Y = 0. 0927*X-0. 5144， R2 = 0. 9964，Y-溶液脂含量，mg/L, X-荧光强度差值)，计算微藻油脂含量(4.7%)0
本实施方式中的标准曲线的测定步骤a、从Chlorella vulgaris的纯培养物中 取处于不同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min 的条件下离心lOmin，并用蒸馏水清洗3 5次后，取离心所得的微藻生物质，并在_70度 条件下冻干为干藻粉。取0. Ig冻干藻粉，加入0. SmL蒸馏水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇， 振荡anin后，超声破碎lmin，再加入Iml氯仿振荡lmin，再加入Iml蒸馏水，再振荡lmin， 4000rpm离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提�。馗� 三次。将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量。步骤以c将所取的 培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液，取IOmL稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶 液，避光下染色，选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530 650nm之间的荧光强度， 荧光强度记为XI，将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心lOmin， 取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择500nm 作为激发波长，测定在发射波长530 650nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2，取稀释液， 选择500nm作为激发波长，测定在发射波长530nm 650nm之间的荧光强度，荧光强度记为 X3，按X1-(X2+X;3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所测得的微藻脂含量为 坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光强度-脂含量标准曲线(图2)
以丙酮作为溶剂，配制尼罗红染色液。通过对预处理方法、尼罗红浓度、染色时 间等条件的优化，建立了微藻油脂含量的快速检测方法。与直接染色、冻融、高温等预处 理方法相比，超声预处理进行染色培养液的荧光强度最大，灵敏度最高；当尼罗红浓度在 0. 05g/L 1. Og/L时，随着尼罗红浓度的增加，培养液的荧光强度有所下降，实验结果显 示0.05g/L的尼罗红溶液效果最好。染色时间和光照的实验结果表明，在避光、染色时间 15min时，培养液的荧光强度最大，灵敏度最高。该方法适于小球藻脂含量的快速检测，应用 该方法测定藻细胞脂含量，可在Ih内完成，并且所需样品量不超过40mL，可以直接用于藻 类培养液脂含量的测定，与称重法、核磁共振法相比，由于省略了干燥步骤，因此减少了总 消耗时间，降低了成本。而且尼罗红法所需样品量少，因此还适用于科研或小批量微藻油脂 生产时的测定。尽管尼罗红法的脂含量测定范围与相对偏差与称重法和核磁共振法相比较 差，但是已经可以满足生产过程中的需要。三种方法的具体性能比较见表1。
表1.不同油脂测定方法比较表
权利要求
1.微藻油脂的检测方法，其特征在于微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的一、 将微藻培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一的稀释液，然后 加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长 450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为 10000r/min的条件下离心lOmin，取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼 罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之 间的荧光强度，荧光强度记为X2 ；四、取步骤一的稀释液，选择400 600nm作为激发波长， 测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X3 ；五、按X1_(X2+X3)公式 计算出最大荧光强度差值，然后根据荧光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完 成了微藻油脂的检测。
2.根据权利要求1所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤一中稀释微藻培养液 用的溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水。
3.根据权利要求2所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的 溶剂为丙酮、乙醇、丙醇、二氧六环、四氢呋喃或甲乙酮。
4.根据权利要求3所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的 浓度为 0. 01g/L 0. 5g/L。
5.根据权利要求3所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤二所述尼罗红溶液的 浓度为0. 05g/L。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤 五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不 同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下 离心lOmin，并用蒸馏水清洗3 5次后，取离心所得的微藻生物质，并在_70度条件下冻干 获得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸馏水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振荡^iin后， 超声破碎lmin，再加入Iml氯仿振荡lmin，再加入Iml蒸馏水，再振荡lmin，然后在4000r/ min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提取，重 复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的 培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液，取IOmL稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶 液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧 光强度，荧光强度记为XI，将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心 IOmin,取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择 400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为 X2，取稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光 强度，荧光强度记为X3，按Xl- (X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所 测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光 强度-脂含量标准曲线。
7.微藻油脂的检测方法，其特征在于微藻油脂的检测方法是按下述步骤进行的微藻 油脂的检测方法是按下述步骤进行的一、将微藻培养液预处理，然后稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液；二、取IOmL步骤一的稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染 色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为Xl ；三、将步骤一稀释液在温度为4°c、转速为lOOOOr/min的条件下离心lOmin， 取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为X2 ；四、 取步骤一的稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的 荧光强度，荧光强度记为X3 ；五、按X1-(X2+X;3)公式计算出最大荧光强度差值，然后根据荧 光强度-脂含量标准曲线计算微藻油脂含量；即完成了微藻油脂的检测。
8.根据权利要求7所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于所述微藻培养液的预处理 采用蒸馏水清洗预处理、二甲基亚砜预处理、超声预处理、冻融预处理、高温预处理或酸热 预处理进行的。
9.根据权利要求7或8所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于所述尼罗红溶液的浓 度为 0. 01g/L 0. 5g/L。
10.根据权利要求9中任一项权利要求所述的微藻油脂的检测方法，其特征在于步骤 五所述荧光强度-脂含量标准曲线测定方法如下步骤a、从同一藻种的培养液中取处于不 同生长阶段的培养液；步骤b、将所取的培养液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下 离心lOmin，并用蒸馏水清洗3 5次后，取离心所得的微藻生物质，并在_70度条件下冻干 获得干藻粉，取0. Ig干藻粉，加入0. SmL蒸馏水，再加入ImL氯仿和2mL甲醇，振荡^iin后， 超声破碎lmin，再加入Iml氯仿振荡lmin，再加入Iml蒸馏水，再振荡lmin，然后在4000r/ min条件下离心5min，离心后，取氯仿相转移到另一试管，再向原管中加入2mL氯仿提�。� 复三次，将得到的氯仿相氮吹干到质量恒定，称重计算得到微藻脂含量；步骤c、将所取的 培养液稀释至0. 05g/L 0. 5g/L，得到稀释液，取IOmL稀释液，然后加入100 μ L尼罗红溶 液，避光下染色，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧 光强度，荧光强度记为XI，将步骤一稀释液在温度为4°C、转速为lOOOOr/min的条件下离心 IOmin,取上清液作为空白，取IOmL上清液，然后加入100 μ L尼罗红溶液，避光下染色，选择 400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光强度，荧光强度记为 X2，取稀释液，选择400 600nm作为激发波长，测定在发射波长450 700nm之间的荧光 强度，荧光强度记为X3，按Xl- (X2+X3)公式计算出最大荧光强度差值；步骤d、以步骤b所 测得的微藻脂含量为坐标，以步骤c尼罗红染色的最大荧光强度差值为横坐标，绘制荧光 强度-脂含量标准曲线。
全文摘要
微藻油脂的检测方法，它属于油脂检测领域。本发明解决了称重法所需样品大、耗费时间长的技术问题。本发明方法一、将微藻培养液稀释，得到稀释液；二、测定稀释液染色后的荧光强度；三、将稀释液离心，取上清液测定染色后的荧光强度；四、取稀释液，测定未染色时的荧光强度；五、计算最大荧光强度差值，根据荧光强度-脂含量标准曲线，计算微藻油脂含量。本发明方法适用对小球藻、栅藻、螺旋藻、硅藻、甲藻、金藻、裸藻、轮藻等单细胞藻类进行检测，也可对细胞破碎预处理后的大型藻类进行检测。
文档编号G01N21/64GK102033059SQ20101056397
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者冯玉杰, 刘佳, 张大伟, 李超 申请人:哈尔滨工业大学
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