专利名称：一种水飞蓟宾的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种治疗肝病的药物水飞蓟宾的检测方法。
背景技术：
水飞蓟宾是菊科植物水飞蓟中提取分离得到的黄酮类化合物，具有保肝、护肝等功效。近年来药效学研究表明，水飞蓟宾还具有较强的抗炎，抗肿瘤活性。定天明等采用胶束电泳毛细管色谱法对水飞蓟宾的非对映体(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)进行了分离，从而证明了水飞蓟宾为两个非对映体的混合物，其化学结构见图1。目前，已有多篇文献报道了水飞蓟宾在动物和人体内的定量分析研究，但有关水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学研究报道极少。Rickling等采用高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)测定人血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的浓度，但该方法的灵敏度低，且样品预处理较为繁琐，不能满足药动学研究需要。本实验建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS方法，同时测定大鼠血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度，并成功用于水飞蓟宾A和水飞蓟宾B各自的药动学及生物利用度研究。
发明内容
本发明建立一种简单、快速、灵敏的液-质联用法(LC-MS/MS)，该方法用于测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。本发明的方法，包括以下步骤步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用仪，测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B 浓度。优选的本发明的方法如下0. ImL血浆样品经沉淀蛋白预处理后，以甲醇-0. 1% 甲酸 08 52，ν/ν)为流动相，采Eclipse XDB-C18 色谱柱(150X2. 1 匪，5 μ m) 分离，以ESI源负离子模式、选择反应监测(SRM)方式进行定量分析。本发明的检测方法，其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中的线性范围为 2.0-500001^.111171,最低定量限(LLOQ)为Z.Ong.mr1。药物的日内、日间精密度在9. 1 % 以内，准确度(相对误差)小于士5.7%。
图1水飞蓟宾A (a)和水飞蓟宾B (b)的化学结构图2水飞蓟宾A(a)、水飞蓟宾B(b)和柚皮苷(c)的质谱3血浆样品色谱4水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在大鼠体内的平均药-时曲线
a-水飞蓟宾A，静脉注射13. 3mg/kg;b-水飞蓟宾A，灌胃给药13. 3，26.6 and 53. 2mg/kg ；C-水飞蓟宾B，静脉注射14. 7mg/kg;d-水飞蓟宾B，灌胃给药14. 7，29. 4 and 58. 8mg/kg.
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域等同替换， 均属于本发明的保护范围。实施例11材料与方法1. 1药品与试剂水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准品(天津天士力集团研究院自制，纯度>98. 5%)； 内标柚皮苷(中国药品生物制品检定所，纯度> 99.0%，批号110722-200610)；水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司，规格35mg水飞蓟宾/粒，批号090509)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；其余试剂均为分析纯。1. 2 仪器Finnigan TSQ Quantum三重四极杆液-质联用仪(美国Finigan公司)；XW-80A 微型漩涡混合仪(上海卢西分析仪器厂有限公司)；TG 16W微量高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)。1. 3色谱条件色谱柱ZorbaxEclipse XDB-C18 柱(150X 2. 1mm，5 μ m)，美国 Agilent 公司；流动相甲醇-0. 甲酸(48 52，ν/ν)；流速0. 25mL · min—1 ；柱温:30°C ；进样量=IOyL01. 4质谱条件离子源为电喷雾离子源，负离子方式检测；喷雾电压3800v ；毛细管温度390°C ；鞘气(N2)压力25Psi ；辅助气(N2)压力3psi ；碰撞气(Ar)压力为1. 4mTorr ；扫描方式为选择性反应监测(SRM)；碰撞能量(CE)分别为20eV(水飞蓟宾A和水飞蓟宾B)和34eV(柚皮苷)，用于定量分析的离子反应分别为m/z481. 1 — m/z 300. 9 (水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B)和m/z 579.2 —m/z 271.1(柚皮苷)。水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标柚皮苷的二级全扫描质谱图见图2。1. 5实验动物与实验方案1. 5. 1实验动物Wistar大鼠，雄性，体重Q20 士 20) g(北京维通利华实验动物中心)。1. 5. 2静注、灌胃用水飞蓟宾溶液的配置精密称取水飞蓟宾140mg，溶于25mL聚乙二醇200 乙醇二纯水(5:2: 3,v/v/v)混合溶液中，即得水飞蓟宾静注溶液；分别取4，8和16粒水飞蓟宾胶囊，去壳，混悬于70mL 二纯水中，配置成水飞蓟宾低、中、高3个剂量的灌胃液。上述给药溶液均需现用现配。1.5.3给药及血样采集5只大鼠按^mg ^kg4静脉注射给予水飞蓟宾静注溶液(相当于水飞蓟宾A13. 3mg · kg—1，水飞蓟宾B14. 7mg · kg—1) ；15只大鼠分别按沘，56和lUmg^g—1灌胃给予低、中、高3个剂浓度的水飞蓟宾混悬液(相当于水飞蓟宾A13. 3，26. 6 和 53. 2mg · kg、水飞蓟宾 B14. 7，29. 4 和 58. 8mg · kg-1)。大鼠给药后 0,0. 17,0. 33，0. 67， 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12. Oh,经大鼠眼球后静脉丛采集静脉血约0. 3mL,置肝素化试管中，3500r · miiT1离心lOmin，分离血浆，置_20°C冰箱中冷冻保存待测。1. 6血浆样品预处理取血浆样品100 μ L置于1. 5mL Eppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，内标溶液 (200ng · mL-1柚皮苷溶液，乙腈配置)100 μ L，旋涡Imin,然后于12000r · mirT1离心8min, 取上清液 ο μ L进行LC-MS/MS分析。2 结果2. 1专属性考察由图3可见，在“1. 3”所述条件下，水飞蓟宾Α、水飞蓟宾B和内标的保留时间分别为6. 45，7. 35和2. 55min，且血浆中的内源性物质不干扰待测物与内标的测定。2. 2线性范围及灵敏度取大鼠空白血浆，加入水飞蓟宾A、水飞蓟宾B标准溶液，配制成含水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B2，5，20，50，500，2000，20000 和 50000ng · ml/1 的血浆样品，按 “ 1. 6 ” 项操作， 记录色谱图；以血浆样品中待测物的浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W = 1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得水飞蓟宾A的回归方程为Y = 0. 00125Χ+0. 00063 (r = 0. 9981)，水飞蓟宾 B 的回归方程为Y = 0. 00122Χ+0. 00096 (r =0. 9959)，本法水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的线性范围均为2 50000ng · mL"1, LLOQ为 2ng · mL-1 (S/N > 10)。2. 3精密度与准确度取大鼠空白血浆若干份，分别加入水飞蓟宾A和水飞蓟宾B标准溶液，配置成水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度为20，500，20000ng -πιΓ1的血浆样品，按“1. 6”项操作，每个浓度进行6样本分析，连续测定3天，计算精密度(日内、日间RSD)与(RE)结果见表1。2.4提取回收率取空白血浆100 μ L，制备水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度为20，500，20000ng · mL-1 的血浆样品，按“1. 6”项操作，每个浓度进行3样本分析，记录色谱峰。同时，另取纯水 IOOy L代替空白血浆，同法操作，获得相应峰面积，以二者色谱图的峰面积之比考察样品的提取回收率。结果表明，在上述3个浓度下水飞蓟宾A的提取回收率分别为95. 2士2. 2%, 93. 2士 1. 7%和95. 4士4. 5%，水飞蓟宾B的提取回收率分别为94. 3士5. 1%,94. 7士4. 1% 禾口 96. 1 士 1. 9%，内标的提取回收率为93. 8士5. 4%。2. 5稳定性考察本实验分别考察了血浆样品-20°C冻存2个月，冻-融3个循环及血浆样品处理后室温放置Mh的稳定性。结果表明，水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在上述3个条件下稳定性良好。2. 6药动学及生物利用度研究水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在大鼠体内的药-时曲线图见图4，Topfit 2.0软件用于计算其主要药动学参数，见表2和表3。经统计分析，水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的主要药动学参数Cmax，AUCchJP AUCchoo与给药剂量呈线性关系。由公式F = (AUCi. g./AUCi. J X 100%,计算得到水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的绝对生物利用度分别为2. 86%和1. 93%。本实验对正离子和负离子两种电离模式进行了比较，结果显示负离子模式下水飞蓟宾A和水飞蓟宾B的响应值远高于正离子模式，故选负离子模式检测。水飞蓟宾和内标的分子离子峰[Μ-ΗΓ分别为m/z 481. 1和579. 2，由图2可见，水飞蓟宾和内标分别在m/z 300. 9和271. 1的子离子峰强度最大，故分别选择m/z 481. 1 — m/z 300. 9和m/z 579. 2 -m/z 271. 1检测水飞蓟宾和内标。尽管水飞蓟宾A和水飞蓟宾B定量分析的离子反应均为为m/z 481. 1-m/z 300. 9，但本实验通过比较所选定的色谱条件保证水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B具有良好的分离度，从而确保了方法具有良好的专属性。本实验建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS方法，同时测定大鼠血浆中水飞蓟宾A和水飞蓟宾B浓度，并首次报道了水飞蓟宾A和水飞蓟宾B在动物体内的药动学及生物利用度研究数据，为水飞蓟宾及其制剂的深入研究奠定基础。以下为附表表1精密度与准确度实验结果Tab. 1 Precision and accuracy of the method
权利要求
1.一种水飞蓟宾的检测方法，包括以下步骤步骤1、采集含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆，经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用色谱仪，测定血浆中水飞蓟宾A与水飞蓟宾 B浓度。
2.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为色谱柱=ZortaxEclipse XDB-C18柱体积为150 X 2. Imm,粒径为5 μ m，美国Agilent公司；流动相甲醇-0. 1 %甲酸为 48 52 ；流速0. 25mL · mirT1 ；柱温:30°C ；进样量10μ L。
3.权利要求1的检测方法，其特征在于，其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B在血浆中浓度的线性范围为2. 0-50000ng · mL—1，最低定量限为2. Ong · mL—1，药物的日内、日间精密度在 9. 以内，相对误差小于士5. 7%。
4.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述预处理包括取血浆样品100μ L置于 1. 5mLEppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，内标溶液为200ng · mL—1柚皮苷溶液，乙腈配置，用量100 μ L，旋涡lmin，然后于12000r · mirT1离心8min，取上清液10 μ L进行LC-MS/ MS测定。
5.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述血浆来源于动物，是动物经过服用水飞蓟宾A和水飞蓟宾B药物后经过取血后处理得到的。
6.权利要求5的检测方法，其特征在于，所述服用包括静注和口服。
7.权利要求5的检测方法，其特征在于，所述水飞蓟宾A和水飞蓟宾B药物用以下方法得到称取水飞蓟宾140mg，溶于25mL聚乙二醇200 乙醇二纯水为5 2 3混合溶液中，即得水飞蓟宾静注溶液；取水飞蓟宾胶囊，去壳，混悬于70mL 二纯水中，配置成水飞蓟宾的口服液。
8.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述液-质联用色谱仪器为FirmiganTSQ Quantum三重四极杆液-质联用仪。
9.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为离子源为电喷雾离子源， 负离子方式检测；喷雾电压3800v ；毛细管温度390°C ；鞘气队压力25Psi ；辅助气队压力 3psi ；碰撞气Ar压力为1. 4mTorr ；扫描方式为选择性反应监测SRM ；碰撞能量CE分别为水飞蓟宾A和水飞蓟宾B20eV、柚皮苷34eV，用于定量分析的离子反应分别为水飞蓟宾A和水飞蓟宾 B m/z481. 1 — m/z 300. 9、柚皮苷 m/z 579. 2 — m/z 271.1。
10.权利要求1的检测方法，其特征在于，所述采集血浆方法如下静脉注射给予水飞蓟宾静注溶液，灌胃给予水飞蓟宾混悬液，给药后经静脉采集静脉血，置肝素化试管中，离心，分离血浆待测。
全文摘要
本发明属于医药领域，具体涉及一种水飞蓟宾的检测方法，本发明的方法，包括以下步骤步骤1、含有水飞蓟宾A与水飞蓟宾B的血浆经沉淀蛋白预处理；步骤2、将经过预处理的血浆，经液-质联用仪，测定其中水飞蓟宾A与水飞蓟宾B浓度。
文档编号G01N30/02GK102478553SQ201010556030
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者万梅绪, 周水平, 李伟, 栗志文, 褚扬, 郭嘉华, 马晓慧 申请人:天津天士力制药股份有限公司
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