亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种ctcf蛋白的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种CTCF蛋白的新用途。
背景技术：
CCCTC-结合因子(CCCTC-binding factor, CTCF) (Genbank 登录号是 NM_006565) 是一个重要的多功能转录因子，通过形成不同的蛋白质复合物，可以分别表现出转录激活 因子(transcription activator)、转录才屯 因子(transcription repressor)禾口绝缘 子(insulator)等活性，并且在印记基因(imprinting gene)状态的维持、X染色体失活 (X-inactivation)等方面都有着重要作用。已经发现CTCF与肿瘤发生、阿尔兹海默症、冠心病等多种疾病过程相关。但是目 前还没有任何CTCF与癌症转移相关的报道。

发明内容
本发明的目的是提供抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒 中的应用。本发明提供了 CTCF蛋白在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用。上述应用中，所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。所述宫颈癌细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为HepG2细胞，所述乳腺癌细胞为 MDA157细胞、MDA231细胞或81^474细胞。所述试剂盒为免疫荧光试剂盒或免疫组化试剂盒。所述抗CTCF的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗CTCF的抗体具体为多克隆抗体，可以为CTCF C-20X，购自Santa Cruz公 司，产品目录号为sc-15914X。本发明的实验证明，用免疫组织化学或免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，如果 CTCF主要分布在癌细胞的细胞核内，说明该癌症转移的风险低；如果CTCF大量分布在癌细 胞的细胞质内，说明该癌症转移的风险高。表明CTCF可以快速、准确检测癌症转移。


图1为细胞免疫荧光法分析人乳腺癌细胞中CTCF的细胞内定位情况图2为宫颈癌细胞株HeLa和CTCF敲降的HeLa细胞株HeLa-CTCF-II-Il之间CTCF 细胞内定位和细胞侵袭性的比较图3为肝癌细胞株!fepG2转染CTCF的小干扰RNA和阴性对照荧光素酶的小干扰 RNA后，免疫印迹法检测HepG2细胞中CTCF的敲降效果图4为肝癌细胞株H印G2用CTCF的小干扰RNA敲降CTCF表达和用荧光素酶的小 干扰RNA转染作为阴性对照后，CTCF细胞内定位的比较图5为肝癌细胞株ItepG2用CTCF的小干扰RNA敲降CTCF表达和用荧光素酶的小干扰RNA转染作为阴性对照后细胞侵袭性的比较图6为人肝癌组织芯片不同病理分级样本的CTCF免疫组化分析
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、CTCF的细胞内定位与癌细胞转移能力的关系1、CTCF在乳腺癌细胞中的定位MDA157(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)和MDA231(购 自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)细胞是高转移性的乳腺癌细胞， BT474(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是低转移性的乳腺癌细胞。用细胞免疫荧光法检测CTCF在MDA157、MDA231和BT474细胞中的定位，具体如 下培养生长增殖处于稳定正常状态的细胞，然后将细胞消化到载玻片上，载玻片放 入培养皿中培养至贴壁。然后加入L-15细胞培养基(Invitrogen公司，目录号41300039) 培养过夜。第二天进行免疫荧光实验。将细胞培养皿中的培养基倒掉，用PBS洗3次，彻底 洗净。在玻璃瓶中配置固定液(甲醇丙酮=1:1)。将长有细胞的载玻片放入固定液 中，孵育3分钟。然后，将固定液去除并用PBS清洗3次载玻片。在3%的BSA溶液中按比 例配置一抗稀释液，然后将一抗加到细胞上常温孵育2小时以上。用PBS清洗载玻片三次 后加入二抗，常温孵育1小时。最后在细胞上加入稀释好的核染料DAPI或PI孵育5分钟。 用PBS清洗载玻片三次之后用封片剂封住细胞并盖上盖玻片，在显微镜下观察CTCF分布。上述一抗为CTCF 抗体 C-20X，Santa Cruz 公司 sc_15914X，1 200 稀释；二抗 为FITC标记兔抗羊IgG，中杉公司ZDR-5211，1 50稀释。结果如图1所示，A为MDA157细胞的CTCF免疫荧光检测；B为MDA157细胞的DAPI 染色；C为A和B图的叠加；D为MDA231细胞的CTCF免疫荧光检测；E为MDA231细胞的DAPI 染色；F为D和E图的叠加；G为Β ~474细胞的CTCF免疫荧光检测；H为Β ~474细胞的DAPI 染色；I为G和H图的叠加；从图中看出，MDA157和MDA231细胞中CTCF主要分布于细胞质 中，ΒΤ474细胞中CTCF主要分布于细胞核中。这结果表明CTCF主要分布在细胞质中的乳腺癌细胞的转移性高，CTCF主要分布 在细胞核中的乳腺癌细胞的转移性低。2、CTCF的细胞内定位与宫颈癌细胞转移能力的关系HeLa细胞(购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是宫颈癌细 胞。用HeLa细胞建立的CTCF敲降(Knockdown)稳定细胞株HeLa-CTCF-II-ll记载在 郭威威，朱旭东，刘党生，黄培堂.腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表 达.生物技术通讯，2006，17 ) :503-505，中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生 物工程研究所获得。采用上述1中细胞免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，一抗为CTCF抗体C-20X， 购自Santa Cruz公司，目录号sc_15914X，1 200稀释；二抗为FITC标记兔抗羊IgG，购自中杉公司，目录号ZDR-5211，1 50稀释。以HeLa细胞为对照(即为CTCF敲降以前)。用Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭性，具体如下用IOOul lmg/ml的 Matrigel (BD 公司，目录号；354234)在 Transwell (Millipore 公司，目录号 PIEP12R48)上铺 胶，2xl05细胞HeLa-CTCF-II-Il种在"Transwell上室，48小时后结晶紫染色观察细胞的侵 袭结果。以HeLa细胞为对照(即为CTCF敲降以前)。结果如图2所示，A为HeLa-CTCF-II-Il细胞的CTCF免疫荧光检测；B为HeLa细 胞的CTCF免疫荧光检测；C为HeLa-CTCF-II-Il细胞的DAPI染色；D为HeLa细胞的DAPI 染色；E为HeLa-CTCF-II-Il细胞的侵袭实验结果；F为HeLa细胞的侵袭实验结果。CTCF 敲降以前，CTCF主要分布于HeLa细胞的细胞核，HeLa细胞的Matrigel侵袭性很低；CTCF 敲降以后，CTCF主要分布于HeLa-CTCF-II-Il细胞的细胞质(敲降指的是使CTCF在细胞 中的表达降低，而不是彻底敲除。)，同时细胞的Matrigel侵袭性显著增高。侵袭是癌细胞突破肿瘤基底膜向远端转移的关键步骤，侵袭性高的癌细胞转移能 力强。这个结果表明在宫颈癌细胞中，CTCF的细胞内分布与癌细胞的转移能力具有相关性， CTCF主要分布在细胞质中的癌细胞转移能力强。3、CTCF的细胞内定位与肝癌细胞转移能力的关系HepG2 (购自协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)是肝癌细胞株。用CTCF的小干扰RNA (小干扰RNA的序列正义链为 5，-GGAAAGGAGAGAAAGACUUUU-3，，反义链为 5，-AA⑶CUUUCUCUCCUUUCCUU-3，)转染!fepG2 细 胞，得到H印G2/CTCF-siRNA(转染了 CTCF小干扰RNA的细胞)。用荧光素酶(Iuciferase)的小干扰RNA (小干扰RNA的序列正义链为 5，-CUUACGCUGAGUACUUCGAUU-3，，反义链为 5，-UCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3，。转染！fepG2 细胞，得到H印G2/Luciferase_siRNA作为阴性对照(转染了 Iuciferase小干扰RNA的细 胞)。HepG2细胞中CTCF敲降的结果如图3所示，A为!fepG2细胞分别转染阴性对照荧 光素酶的小干扰RNA和CTCF的小干扰RNA后，CTCF的免疫印迹结果；B为!fepG2细胞分 别转染阴性对照荧光素酶的小干扰RNA和CTCF的小干扰RNA后，内参beta-actin的免疫 印迹结果。在内参beta-actin的量一致的情况下，转染CTCF小干扰RNA的细胞0fepG2/ CTCF-siRNA)中CTCF的表达量显著下降，说明!fepG2细胞中的CTCF得到很好的敲降效果。用上述1中的细胞免疫荧光法检测CTCF的细胞内分布，一抗为CTCF抗体C-20X， 购自Santa Cruz公司，目录号sc_15914X，1 200稀释；二抗为FITC标记兔抗羊IgG，购 自中杉公司，目录号ZDR-5211，1 50稀释。结果如图4所示，A为H印G2/Luciferase-siRNA细胞的CTCF免疫荧光检测；B为 H印G2/Luciferase-siRNA 细胞的 PI 染色；C 为 A 和 B 图的叠力Π ;D 为 H印G2/CTCF_siRNA 细胞的CTCF免疫荧光检测；E为H印G2/CTCF-siRNA细胞的PI染色；F为D和E图的叠加。 可以看出，CTCF敲降的H印G2细胞0fepG2/CTCF-siRNA，转染了 CTCF小干扰RNA的细胞) 中CTCF主要分布在细胞质，CTCF未敲降的!fepG2细胞0fepG2/Luciferase-siRNA，转染了 Iuciferase小干扰RNA的细胞)中CTCF主要分布在细胞核中。用Matrigel侵袭实验检测细胞的侵袭性，具体如下用IOOul lmg/ml的 Matrigel (BD 公司，目录号；354234)在 Transwell (Millipore 公司，目录号 PIEP12R48)上铺胶，2xl05细胞种在Transwell上室，48小时后结晶紫染色观察细胞的侵袭结果。实验重复 三次，结果取平均值。结果如图5所示，HepG2/luc-siRNA的侵染细胞的相对比例设定为100 (是!fepG2/luc-siRNA和 HepG2/CTCF-siRNA的细胞之间进行比较，H印G2/luc_siRNA作为对照)。HepG2/CTCF-siRNA的侵染细胞的相对比例为188士 16 (是H印G2/luc_siRNA和 HepG2/CTCF-siRNA的细胞之间进行比较，H印G2/luc_siRNA作为对照，即未敲降CTCF的细 胞)。CTCF 敲降的！fepG2 细胞(!fepG2/CTCF-siRNA)比 CTCF 未敲降的！fepG2 细胞 (HepG2/luc-siRNA)侵袭性显著增高，表示转移能力增强。这结果表明在肝癌细胞中，CTCF 的细胞内分布与癌细胞的转移能力具有相关性，CTCF主要分布在细胞质中的肝癌细胞转移 能力强。在乳腺癌、宫颈癌、肝癌中，CTCF有明显细胞质分布的癌细胞转移能力相对较高。 总之，CTCF的细胞内定位与癌细胞转移能力这两者之间存在相关性，CTCF主要分布在细胞 质中的癌细胞转移能力强，CTCF主要分布在细胞核中的癌细胞转移能力弱。实施例2、肝癌组织芯片的CTCF免疫组化实验(1)脱蜡和水化脱蜡前分别将3种病例分级样本的人肝癌组织芯片(均购自桂 林泛谱生物技术公司)在60°C恒温箱中烘烤20分钟。a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；b无水乙醇中浸泡五分钟；c 95%乙醇中浸泡五分钟；d 75%乙醇中浸泡五分钟。(2)PBS(中杉公司，目录号ZLI-9063)洗2次各5分钟。(3)用去离子水或PBS配制新鲜的3% (体积百分含量)H202，25°C封闭5-10分钟， 用去离子水洗3次。(4)抗原修复预先烧开水浴锅，用微波炉煮沸枸橼酸盐缓冲液(博士德公司，目 录号AR0024)，放入组织芯片，置于水浴锅内20分钟。(5) PBS 洗 5 分钟。(6)滴加正常山羊血清封闭液，25°C 20分钟，甩去多余液体。(7)滴加 1/100 稀释的一抗(CTCF C-20X，Santa Cruz 公司 sc_15914X)，25°C静置 2小时或4°C过夜。(8) PBS洗3次各2分钟。(9)滴加生物素化兔抗山羊二抗(购自博士德公司，目录号SA1023)，20°C_37°C孵 育20分钟。(IO)PBS 洗 3 次各 2 分钟。(11)滴加试剂 SABC，20°C _30°C孵育 20 分钟。(12) PBS 洗 4 次各 5 分钟。(13) DAB显色用SABC试剂盒的显色剂显色(Iml去离子水中加入试剂A、B、C各 1滴)，在显微镜下观察，及时终止反应，一般10-30分钟。
(14)去离子水冲洗5分钟。(15)苏木素轻度染色2分钟。(16)去离子水冲洗5分钟。(17) PBS 返蓝 5 分钟。(18)脱水、透明、封片、镜检。a 75%乙醇中浸泡五分钟；b 95%乙醇中浸泡五分钟；c无水乙醇中浸泡五分钟；d 二甲苯中浸泡10分钟透明；e中性树脂封片。实验重复三次。结果如图6所示，图6a为病理I级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司) 的CTCF免疫组化分析；图6b为病理II级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司)的 CTCF免疫组化分析；图6c为病理III级肝癌组织样本(购自桂林泛谱生物技术公司)的 CTCF免疫组化分析；从图中看出，在病理I级和II级的肝癌组织中，CTCF主要分布于细胞 核；在病理III级的肝癌组织，大部分病例中CTCF有明显的细胞质分布。通常情况下，病理分级高的癌症转移风险高，病理分级低的癌症转移风险低。根据 本方法测试，结果如表1所示，在病理分级I和II级的患者中，分别有90. 9%和93. 的 患者CTCF无细胞质内分布，说明转移的风险低，这与病理分级低的癌症转移风险低是一致 的；在病理III级的患者中，90%的患者CTCF都有细胞质内分布，说明转移的风险高，这与 病理分级高的癌症转移风险高是一致的。表1、人肝癌组织芯片中CTCF的细胞质内定位分析
权利要求
1.抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于 所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述宫颈癌细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为H印G2细胞，所述乳腺癌细胞为MDA157 细胞、MDA231细胞或BT474细胞。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于 所述试剂盒为免疫荧光试剂盒或免疫组化试剂盒。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于 所述抗CTCF的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种CTCF蛋白的新用途。本发明提供了抗CTCF的抗体在制备辅助检测肿瘤细胞转移能力的试剂盒中的应用，所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。所述宫颈癌细胞为HeLa细胞，所述肝癌细胞为HepG2细胞，所述乳腺癌细胞为MDA157细胞、MDA231细胞或BT474细胞。本发明的实验证明，用免疫组织化学或免疫荧光法检测CTCF的细胞内定位，如果CTCF主要分布在癌细胞的细胞核内，说明该癌症转移的风险低；如果CTCF大量分布在癌细胞的细胞质内，说明该癌症转移的风险高。
文档编号G01N33/574GK102095854SQ20101056571
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者何莉, 朱旭东, 沈晶晶, 王荣, 郭威威, 黄培堂 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所