专利名称：以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明属于医用试剂盒领域，特别涉及一种用于检测妊娠期妇女胎膜早破 (PrematureRupture of Fetal Membrane，简称PROM)的夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其 制备方法。
背景技术：
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane，简称ROM)可能在孕期随时发生，在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周)PROM发生率约为10%;足月前 (37孕周前)PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要 因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在 延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的 管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注 入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标准 检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患 者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物PH值变为偏碱性(正常阴道分泌物pH为4. 5 5. 5)、 显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准确性、 敏感性均较低。细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1，简称 ICAM-1，权利要 求书和说明书中，以“ICAM-1”表示细胞间黏附分子-1)属于黏附分子的免疫球蛋白超家 族，是分子量76kD 114kD的单链糖蛋白。ICAM-I广泛表达在机体的血管内皮细胞、胸腺 上皮细胞和其他种类的上皮细胞等非血源性细胞的表面，T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状 细胞等血源性细胞的表面，以及成纤维细胞的表面，与淋巴细胞的浸润有关。虽然在妊娠晚 期(孕周28-40)，受胎膜和羊水中的单核细胞上ICAM-I的表达和中性粒细胞活化的影响， 妊娠妇女的羊水中ICAM-I水平升高，但目前尚未发现以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检 测试剂盒及其制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其制 备方法，以提高胎膜早破检测的准确性，减轻患者的痛苦。本专利申请的发明人通过实验发现=ICAM-I是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋 白质之一，含量为13. 08士6. llng/mL。胎膜早破时将有羊水从羊膜腔中渗漏至阴道，羊水中 的ICAM-I则会出现在阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid,CVF)中。蛋白芯 片筛选实验发现确诊的PROM产妇与确诊的非PROM产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周 龄匹配，无基础疾�。奕焉锖喜⒅�)，阴道分泌物/宫颈黏液样本中ICAM-I的浓度具有明 显差异。因此，可将ICAM-I作为胎膜早破的检测指标。
本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有ICAM-1单 克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)检测液、与生物 素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底 物3'，3' ,5,5'-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。实验表明，上述试剂盒所含包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板，优选每孔包被 ICAM-1单克隆抗体0. 9 ii g 1 ii g。上述试剂盒中，所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)检测液 主要由生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)、牛血清白蛋白、甘油和磷酸 盐缓冲液组成，生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)的浓度为24mg/ml，牛 血清白蛋白的浓度为1. 5g 3g/100ml，甘油的浓度为50ml/100ml。所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)由生物素酰-N羟基丁 二酰亚胺酯和ICAM-1单克隆抗体耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-1单克隆抗体 的质量比为0. 5 1 7。为了方便用户使用，本发明所述试剂盒还可配备样本稀释液，所述样本稀释液是 在浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋 白的浓度为lg 2g/100ml。本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，工艺步骤 如下(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板用pH = 8 10的碳酸盐缓冲液将ICAM-1单克隆抗体稀释为浓度10 u g/ml的稀 释液，然后将所述ICAM-1单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4°C包被至少12小时； 包被时间届满后，将浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C 进行封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH = 7. 2的磷酸盐缓冲液洗涤 多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板，其保 存温度为4°C ；(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)检测液①以N，N- 二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度 为50 y g/ yl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸盐缓冲液为溶剂，ICAM-1 单克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-1单克隆抗体溶液，将所述酰_N羟基丁二 酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时， 即获得生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)；反应结束后，将含生物素标 记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)的反应液装入透析袋中，用pH = 9. 2的磷酸 盐缓冲液在4°C进行透析，透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透 析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g 6g/100ml 为限；②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)和牛 血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1 1计量，在室温下混合均勻即形成生物素 标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)检测液，其保存温度为_20°C ；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基联苯胺和 ICAM-I蛋白标准品。所述亲和素-辣根过氧化物酶、3' ,3' ,5,5'-四甲基联苯胺和 ICAM-I蛋白标准品均为市售商品，可直接从市场购买。本发明所述方法中，制备包被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板时，所述ICAM-I单克 隆抗体稀释液的加入量优选100 μ 1/孔，所述浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入 量为120 μ 1/孔。本发明所述方法中，制备生物素标记的ICAM-I单克隆抗体(Biotin-ICAM-IAb) 时，优选按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-I单克隆抗体的质量比=0.5 1 7量取所 述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-I单克隆抗体溶液形成混合液。为方便用户，本发明所述方法还配备了样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度 0. Olmol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羟甲 基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白 的加入量以其浓度达到Ig 2g/100ml为限。本发明具有以下有益效果(1)本发明为胎膜早破的检测提供了一种采用新检测指标的试剂盒及其制备方法。(2)使用本发明所述试剂盒，可定量检测出妊娠妇女阴道分泌物/宫颈粘液 (Cervical-Vaginal Fluid, CVF)中 ICAM-I 的准确含量。(3)使用本发明所述试剂盒对确诊胎膜破裂组和确诊胎膜未破组妊娠妇女进行采 样检测(见实施例2)，检测结果表明该试剂盒的敏感性为100%，特异性为90%左右，因 而可提高胎膜早破检测的准确性。(4)由于检测样品是妊娠妇女的阴道分泌物，因而是一种无创检测。本发明所述试剂盒适用于所有妊娠期妇女，尤其是存在早产风险、腹部受到损伤 的妊娠期妇女。
图1是本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒中多孔板的一种 形状构造示意图。图2为A450值-ICAM-1浓度标准曲线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明所述以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其 制备方法和使用方法作进一步说明。下述实施例中涉及的材料来源如下ICAM-I单克隆抗体，购自美国R&D公司；I CAM-1蛋白标准品，购自美国R&D公司；碳酸盐缓冲液(CB)，购自美国sigma公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自美国sigma公司；三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)，购自美国sigma公司；
牛血清白蛋白，购自美国sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺，购自美国sigma公司；酰-N羟基丁二酰亚胺酯，购自美国sigma公司；甘油的规格是分析醇，购自美国sigma公司；辣根过氧化物酶，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
3'，3' ,5,5'-四甲基联苯胺，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；多孔板为96孔的多孔板，其形状和构造如图1所示。实施例1本实施例中，采用以下工艺步骤制备以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂
ιπτ.(1)制备包被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板用ρΗ = 9的碳酸盐缓冲液将ICAM-I单克隆抗体稀释为浓度10 μ g/ml的稀释液， 然后将所述ICAM-I单克隆抗体稀释液按100 μ 1/孔的量加入96孔板的各孔内，在4°C包被 12小时；包被时间届满后，将浓度lg/100ml的牛血清白蛋白溶液按120 μ 1/孔的量加入多 孔板上的各孔并在37°C进行封闭反应，反应时间为1小时；封闭反应结束后，用ρΗ = 7. 2、 浓度为0. 05mol/l的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包 被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板，然后将其置于4°C冰箱中保存备用；(2)制备生物素标记的ICAM-I单克隆抗体(Biotin-ICAM-IAb)检测液①以N，N- 二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度 为50 μ g/ μ 1的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以PH = 9. 6、浓度为lmol/1的碳酸盐缓冲液 为溶剂、ICAM-I单克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-I单克隆抗体溶液，按酰-N 羟基丁二酰亚胺酯与与ICAM-I单克隆抗体的质量比=1 7量取所述酰-N羟基丁二酰亚 胺酯溶液和所述ICAM-I单克隆抗体溶液形成混合液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液 和所述ICAM-I单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下(磁力搅拌器，搅拌速度200转/分)于 室温反应4小时，即获得生物素标记的ICAM-I单克隆抗体(Biotin-ICAM-IAb)；反应结束 后，将含生物素标记的ICAM-I单克隆抗体(Biotin-ICAM-IAb)的反应液装入透析袋中，用 PH = 9. 2、浓度为0. 05mol/l的磷酸盐缓冲液在4°C进行透析，透析时间为12小时，其间更 换透析液3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加 入量以其浓度达到4g/100ml为限；②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-I单克隆抗体(Biotin-ICAM-IAb)和牛 血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1 1计量，在室温下混合均勻即形成生物素 标记的ICAM-I单克隆抗体(BiOtin-ICAM-IAb)检测液，其保存温度为_20°C ；(3)每个试剂盒配备亲和素-辣根过氧化物酶12ml、显色底物3' ,3' ,5,5'-四 甲基联苯胺12ml、ICAM-l蛋白标准品(ICAM-1的浓度为lOng/ml) Iml和样本稀释液30ml， 样本稀释液是在浓度浓度0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加 入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到2g/100ml为限；所述 亲和素-辣根过氧化物酶与生物素标记的ICAM-I单克隆抗体检测液的体积比为1 1。实施例2本实施例以实施例1制备的胎膜早破检测试剂盒对待侧样本进行检测。
1、待测样本(1)标样准备 将实施例1所述试剂盒中配备的ICAM-I蛋白标准品设为含ICAM-I浓度最高的标 样，命名为标样1，其ICAM-I的浓度为lOng/ml，然后用实施例1所述试剂盒中配备的样本 稀释液将所述ICAM-I蛋白标准品分别稀释成ICAM-I浓度为5ng/ml、2. 5ng/ml、l. 25ng/ml、 0. 63ng/ml、0. 32ng/ml、0. 16ng/ml的标样，依次命名为标样2、标样3、标样4、标样5、标样6 和标样7，共计有7个标样。(2)试样以四川大学华西第二医院门诊及住院的产妇为实验对象，根据现有检测方法的检 测结果将实验对象分为破膜组和未破膜组，收集两组产妇临产发动时的阴道分泌物/宫颈 粘液(Cervical-Vaginal Fluid, CVF)作为试样，共计40个试样，其中，试样1_20取自于破 膜组，试样21-40取自于未破膜组。(3)空白对照实施例1所述试剂盒中配备的样本稀释液——为空白对照。2、样本检测(1)检测前将试剂盒的所有试剂、待测样本缓慢均衡至室温(18°C 25°C )；(2)将步骤1所准备的标样、空白对照、试样分别加入包被有ICAM-I单克隆抗体 的96孔板上的相应加样孔中，各标样、空白对照、试样均设复孔对照；各加样孔中的加样量 为100 μ 1。用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵 育2. 5小时，振摇速度为100转/分。(3)孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，在自动洗板机上设置清洗程序，以 400 μ 1/孔洗液(浓度0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓度为0. 02mol/L的Tris缓冲液)将 每个加样孔清洗两次，每次清洗时，洗液需在孔中停留10秒 15秒；清洗完毕后，将96孔 板翻转，使各加样孔孔口向下，在吸水滤纸上轻拍使各加样孔中残留的洗液完全去除。(4)向96孔板上的各加样孔中分别加入100 μ 1生物素标记的ICAM-I单克隆抗体 (Biotin-ICAM-IAb)检测液，然后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上 在振摇状态下室温孵育1. 5小时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔 中的液体，按步骤(3)所述方法清洗所述96孔板。(5)向所述96孔板上的各加样孔中分别加入100 μ 1亲和素-辣根过氧化物酶，然 后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育1. 5小 时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤(3)所述方法 清洗所述96孔板。(6)向所述96孔板上的各加样孔中分别加入ΙΟΟμΙ 3,3,5,5'-四甲基联苯 胺，然后在室温避光孵育10分钟，孵育时间届满后，向各加样孔中分别加入100μ 1终止 液，所述终止液为硫酸和亚硫酸钠配制的水溶液，硫酸的浓度为2mol/L，亚硫酸钠的浓度为 0.lmol/L0(7)将所述96孔板放置在酶标仪中，用酶标仪测各孔的A450值(光密度值或吸光 度值)，所测结果见下表(表中的A450值为两孔的加权平均值)。表1:标样的A450值
表2 试样1 20的Α450值 表3 试样21 40的Α450值 空白对照的Α450值为0. 11045。(8)根据各标样的Α450值与各标样中ICAM-I的浓度，制作Α450值-ICAM-I浓度 标准曲线(见图2)，并得到计算公式y = 0. 2863X-0. 3038，式中，y为被测样品的A450值， X为被测样品中ICAM-I的含量。(9)根据所测各试样的A450值，用公式y = 0. 2863χ-0. 3038计算各试样中ICAM-I 的浓度，计算结果见下表表4 试样1 20的计算结果(ICAM-1浓度单位ng/ml) 表5 试样21 40的计算结果(ICAM-1浓度单位ng/ml) 计算表4中试样1 20的ICAM-I平均浓度，其计算结果为5. 06士4. 17ng/ml。计 算表5中试样21-40的ICAM-I平均浓度，其计算结果为1. 34士0. 20ng/mL·从计算结果可 以看出，取自于破膜组的试样1 20中的ICAM-I平均浓度与取自于未破膜组的试样21 40中的ICAM-I平均浓度的差异具有统计学意义。根据未破膜组的均数士2*标准差的计算结果设为检测限，因此，本发明所述试剂 盒设置的ICAM-I检测限为1. 8ng/ml,即待测样本中ICAM-I浓度高于1. 8ng/ml判定为阳性 (即发生胎膜早破)，ICAM-I浓度低于1. 8ng/ml判定为阴性(即未发生胎膜早破)。
权利要求
一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液、与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。
2.根据权利要求1所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所 述多孔板每孔包被ICAM-I单克隆抗体0. 9 μ g 1 μ g。
3.根据权利要求1或2所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征 在于所述生物素标记的ICAM-I单克隆抗体检测液主要由生物素标记的ICAM-I单克隆抗 体、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成，生物素标记的ICAM-I单克隆抗体的浓度为 24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度为1. 5g 3g/100ml，甘油的浓度为50ml/100ml。
4.根据权利要求3所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所 述生物素标记的ICAM-I单克隆抗体由生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯和ICAM-I单克隆抗 体耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-I单克隆抗体的质量比为0.5 1 7。
5.根据权利要求1或2所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征 在于还包括样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲 液或浓度O.Olmol/L 0. 02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配制而 成，牛血清白蛋白的浓度为Ig 2g/100ml。
6.根据权利要求3所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于还 包括样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓 度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛 血清白蛋白的浓度为Ig 2g/100ml。
7.根据权利要求4所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于还 包括样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓 度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛 血清白蛋白的浓度为Ig 2g/100ml。
8.—种以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步 骤如下(1)制备包被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板用PH = 8 10的碳酸盐缓冲液将ICAM-I单克隆抗体稀释为浓度10 μ g/ml的稀释液， 然后将所述ICAM-I单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4°C包被至少12小时；包被 时间届满后，将浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C进行 封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH = 7. 2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔 板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板；(2)制备生物素标记的ICAM-I单克隆抗体检测液①以N，N- 二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为 50 μ g/ μ 1的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸盐缓冲液为溶剂，ICAM-I单 克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-I单克隆抗体溶液，将所述酰-N羟基丁二酰 亚胺酯溶液和所述ICAM-I单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获 得生物素标记的ICAM-I单克隆抗体；反应结束后，将含生物素标记的ICAM-I单克隆抗体的反应液装入透析袋中，用PH = 9. 2的磷酸盐缓冲液在4°C进行透析，透析时间至少为12小 时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血 清白蛋白的加入量以其浓度达到3g 6g/100ml为限；②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-I单克隆抗体和牛血清白蛋白的透析后反应 液与甘油按体积比1 1计量，在室温下混合均勻即形成生物素标记的ICAM-I单克隆抗体 检测液；(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基联苯胺和ICAM-I 蛋白标准品。
9.根据权利要求8所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其 特征在于还配备样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸盐 缓冲液或浓度0. Olmol/L 0. 02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配 制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到Ig 2g/100ml为限。
10.根据权利要求8或9所述的以ICAM-I为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方 法，其特征在于(1)制备包被有ICAM-I单克隆抗体的多孔板时，所述ICAM-I单克隆抗体稀释液的加入 量为100μ 1/孔，所述浓度为lg/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入量为120μ 1/孔；(2)制备生物素标记的ICAM-I单克隆抗体时，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-I单 克隆抗体的质量比=0.5 1 7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-I单 克隆抗体溶液形成混合液。
全文摘要
一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液、与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板；(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液；(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。
文档编号G01N33/531GK101871942SQ20101018966
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者关祥乾, 向洪发, 周容, 胡怀忠 申请人:成都创宜生物科技有限公司
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