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专利名称：无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测 定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡， 血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆 中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积 为35——40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时， 可发生转移性钙化。当乘积<35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶 解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受维生 素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐 阴离子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合 法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定 性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是 比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离 子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定 的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nrn或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物， 方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做 标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性 范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法 (Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本 发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试 剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸 根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水
二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢丙酮酸氧化酶磷酸根+丙酮酸
+氧+水
丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A十
还原型辅酶
这种方法应用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase;EC4丄1.31)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3)、丙酮酸脱氢 酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反应连续监测法。磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸根)酶解产生二氧化碳。丙酮酸 氧化酶作为循环酶，它的酶促作用将二氧化碳等再次变回无机磷(磷酸根)，使 无机磷(磷酸根)不断地被重复循环利用，同时不断地循环重复产生丙酮酸。丙 酮酸脱氢酶作为显色酶，在丙酮酸等反应下，将辅酶(在340nm处没有吸收峰) 还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算出无机 磷(磷酸根)的浓度。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试
剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
草酰乙酸 15 mmol/L
乙酰磷酸 12 mmol/L
过氧化氢 9 mmol/L
辅酶A 9 mmol/L本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮 酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸
脱氢酶。
辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、
乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可 以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试 剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接 使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，其 辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酉每 3 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
草酰乙酸 15 mmol/L
乙酰磷酸 12mmol/L
过氧化氢 9 mmol/L
辅酶A 9 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体 积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检 测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大
实施例二
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
草酰乙酸 乙酰磷酸 过氧化氢
辅酶A
试剂2
稳定剂
磷酸烯醇式丙酮酸羧化
丙酮酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 15 mmol/L 12 mmol/L 9 mmol/L 9 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
50 mmol/L 10000 U/L 12000 U/L 12000U/L
10试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定:温度37°C ，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1 ， 测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
草酰乙酸 15mmol/L
乙酰磷酸 12mmol/L
过氧化氢 9 mmol/L
辅酶A 9 mmol/L 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定无机磷(磷酸根)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37x:，反
应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm,测试副波长405nm， 被测无机磷(磷酸根)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反 应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得
出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0004;吸光度时间 反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达18 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4%;试剂测试的精密度(重 复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.025 ± 0.013 AA/mmol/L; 试剂在2—8"下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好， 线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的无机磷(磷酸根)的浓度测定方法，其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢 丙酮酸氧化酶 磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸+辅酶A+辅酶 丙酮酸脱氢酶 二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小测定结果。
2. —种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液 稳定剂 辅酶磷酸烯醇式丙酮l丙酮酸氧化酶丙酮酸脱氢酶草酰乙酸乙酰磷酸过氧化氢20"-500 mmol/L4000 mmol/L6 mmol/L〖羧化fiooo-1000--80000 U/L80000 U/L1000——80000 U/L50 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L辅酶A 1——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围夕卜，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮 酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A组成双剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成。辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A组成多剂试剂；试剂l， 由缓冲液、稳定剂、辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A组成； 试剂`2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯 式丙酮酸羧化酶组成。辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包 括稳定剂1一4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、草酰乙酸、乙酰磷酸、过氧化氢、辅酶A、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620100SQ20081012293
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司