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专利名称：Psmd4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种PSMD4蛋白的应用，具体地说，涉及PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
背景技术：
肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。我国是世界上肝癌发病最多的国家，每年新发病例约占全球50%。统计资料表明，肝癌术后高转移复发率(5年复发率达70%，小肝癌也达50%)已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，肝癌预后判断指标匮乏。肝癌转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，即关乎癌细胞本身、又与癌细胞同癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用有关。目前至少有20余种基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中异常表达率并不高，这些指标的敏感性及特异性尚难以满足临床预测要求。本领域迫切需要寻找能预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肿瘤复发具有重要意义。PSMD4蛋白(蛋白酶体26S非ATP酶亚基4，GeneID:5710)。PSMD4的功能目前仍不十分清楚。有研究显示，PSMD4可能与细胞分化和机体发育有关(参见文献:Smalle，J.，etal., The pleiotropic role of the26S proteasome subunit RPNlOin Arabidopsisgrowth and development supports a substrate-specific function in abscisicacid signaling.Plant Cell, 2003.15(4):p.965-80.；Szlanka, T., et al., Deletion ofproteasomal subunit S5a/Rpnl0/p54causes lethality, multiple mitotic defectsand overexpression of proteasomal genes in Drosophila melanogaster.J CellSci, 2003.116(Pt6):p.1023-33.；Hamazaki, J.,et al.，RpnlO-mediated degradationof ubiquitinated proteins is essential for mouse development.Mol CellBiol, 2007.27(19):p.6629-38)目前为止，肝癌的发生的分子机制仍不清楚，有效的治疗靶点和诊断标志物也十分有限。目前尚无文献报道PSMD4与肝癌复发或预后判定相关。

发明内容
本发明的目的在于提供PSMD4蛋白的新应用，特别是在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测PSMD4蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现复发的风险及术后状况。基于PSMD4蛋白的相对表达量与肝细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。
本发明提供了 PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，该应用是指将PSMD4蛋白作为分子标记，利用PSMD4单克隆抗体或多克隆抗体， 以及免疫组化实验试剂，分析PSMD4蛋白在肝癌组织中的相对表达量。利用特异性抗PSMD4蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备确定肝癌手术预后的制剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。所述的PSMD4多克隆抗体为商品化抗体，制备方法参见文献Yokoyama, W.M.，Christensen, Μ.，Santos,G.D.and Miller, D.2006.Production of MonoclonalAntibodies.Current Protocols in Immunology.74:2.5.1 - 2.5.25。本发明还提供了使用上述试剂盒用于体外检测PSMD4蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，该方法包括以下步骤:Ca)利用本试剂盒中的免疫组化实验试剂(二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；(b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；(c)利用生物图像处理软件分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分；(d)根据评分计算肿瘤组织中PSMD4蛋白分子表达量。所述的该方法具体步骤如下:(I)制备肝癌组织石蜡切`片，60°C烤箱过夜；(2)切片脱腊至水；(二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —双蒸水 5min)(3) 3%H202 甲醇液，室温放置 20min ；(4)双蒸水洗 5min X 3 ；(5)抗原修复:切片放入0.0IM柠檬酸盐缓冲液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；(6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3 ;(7) 1%BSA 封闭 30min，37 °C ；(8)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔PSMD4多克隆抗体，购自ProteintechGroup公司，稀释比例1:2000)。置入湿盒中30min，37°C，然后4°C冰箱过夜16小时；(9)4°〇取出，室温复温151^11，然后0.0謹PBS洗5minX4;(10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释)45min，37°C ；(11)0.0lM PBS 洗 5minX4，DAB 显色 2-10min，镜下观察；(12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；(13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；(14)脱水透明，盖玻片覆盖；(15)显微镜下观察阳性染色，分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野，拍照；(16)采用Image Scope (Aperio公司)软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms (Positive Pixel Count)程序对每个样本进行“阳性Pixel ”计算,获得计算数据如下表:
权利要求
1.SMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是指将PSMD4蛋白作为分子标记，利用PSMD4单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，分析PSMD4蛋白在肝癌组织中的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，其中的免疫组化实验试剂是指二甲苯、乙醇、3%H202甲醇液、1%BSA封闭液、DAB显色试齐U、苏木素和辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1或2所述的PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，该应用是使用所述的试剂盒在体外检测PSMD4蛋白在肝癌组织中的表达量，其检测方法包括以下步骤: Ca)利用本试剂盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色； (b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片； (c)利用生物图像处理软件分析肿瘤和瘤旁组织阳性信号强度，给出评分； Cd)根据评分计算肿瘤组织中PSMD4蛋白分子表达量。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种PSMD4蛋白的应用，具体地说，涉及PSMD4蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和计算机图像处理软件测定肿瘤组织相对瘤旁组织中PSMD4蛋白相对表达量，并结合术后随访信息，确定PSMD4蛋白相对表达量与手术后肝细胞癌患者预后存在相关性，PSMD4蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
文档编号G01N33/577GK103091493SQ20131000549
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者王红阳, 丁劲, 孙文, 李恒宇, 王雪, 向代民 申请人:中国人民解放军第二军医大学