专利名称：骨质疏松相关骨密度基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
[0001]本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测骨质疏松相关骨密度基因位点是否发生突变的试剂盒，通过同时检测与骨质疏松密切相关的低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (LRP5)和Jagged I蛋白(JAGl)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体患骨质疏松症的风险。
背景技术：
骨骼是一直处于降解和重建的动态过程的器官，即由成骨细胞引起的骨化和破骨细胞引起的骨吸收相伴行。骨密度和骨结构的异常会导致如骨质疏松症、骨硬化、硬化性狭窄等。众多研究表明骨密度的变化很大程度上受遗传因素的影响。低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (LRP5)基因近来被确认是影响骨密度的几个候选基因之一，LRP5基因的异常可导致骨密度的异常降低或升高。LRP5基因定位于染色体llql3上。LRP5基因有23个外显子，长度超过lOOkb，其cDNA是一段长约4. 9kb的开放阅读框。许多研究将高骨密度(HBM)候选基因定位于染色体llql3上，如LRP5。Little等发现常染色体显性高骨密度家族有LRP5突变，外显子3上ー碱基G — T，导致LRP5 171位的甘氨酸变为缬氨酸(G171V)，从而导致第一个P -螺旋结构的变化，改变了该蛋白胞外疏水性。Boyden等也有相同的发现。Van Wesenbeeck筛查一组患以高骨密度为特征的(骨硬化、骨内膜骨化、Van Buchen病)患者LRP5基因，发现该基因外显子2、3、4存在6个多态性位点，分别为Dll 1Y、G171R、A214T、A214V、A242T、A252I，均位于LRP5分子第一个表皮生长因子样区域。TakeShi Mizuguchi等对481名普通日本妇女进行基因检测发现LRP5与骨密度关联显著c2220C > T的CC型的校正骨密度明显高于那些CT或TT型的(P=O. 022)。同时IV S17_30G > A的GG型、c3989C > T的CC型的校正骨密度均明显高于其他基因型。MP Akhter建立了 G171V突变的转基因小鼠模型，发现该组小鼠与G171V突变的人类的骨骼表形非常相似。其骨生物力学特征结构强度、骨灰度值、骨硬度均显著高于对照组。以低骨密度为特征的疾病除了骨质疏松，常见的还有假神经胶质瘤(0PPG)，它常表现为低骨密度以及因儿童时期频发骨折引起的骨骼畸形、眼球血管形成障碍所致的不同程度视觉障碍。Gong等将LRP5基因确认为OPPG的致病基因，发现成骨细胞上有LRP5的表达。Kato等成功地建立了 LRP5突变的小鼠模型并发展为不同程度的0PPG。许多研究运用基因分析方法发现LRP5基因某些位点多态性或突变与低骨密度显著相关。ToMoHzkoUrano等对308名绝经后日本妇女研究发现在IVS17_1677C > A的CA、AA型的全身骨密度Z值显著低于CC型(全身骨Z值(0. 08±1. 09) VS (0. 50±1.03)，P=O. 0022 ;腰椎骨(-0. 42±1. 43) VS (-0. 02±1. 42)，P=O. 013)。Kato 等发现 LRP5-/-小鼠的骨密度显著低于同龄野生型对照组，其骨形成率相对对照组约下降25%，単位面积成骨细胞数量明显降低并伴有功能缺陷，而破骨细胞相关參数无明显差异。Jaggedl (JAGl)是ー种I型跨膜蛋白分子，是哺乳动物细胞Notch受体的配体，完整的Jaggedl基因应包含膜外区、跨膜区和胞浆区。人Jaggedl位于染色体20pll_12，它的ORF区全长为3. 6kb。膜外区包括信号肽，16个EGF样重复序列，DSL结构域及一个半光氨酸的富集区。胞内段很短约为300bp，其中EGF样重复序列与DSL结构域在与Notch的相互作用中起重要作用。Jagged在人和鼠的许多组织中均有广泛的分布，Northern分析表明，Jaggedl mRNA在心脏、胎盘、肾脏表达水平高，而在肺、肌肉、胰腺中的表达量较低。在正常人的骨髓及HS_27a等多种骨髓基质细胞系中均可克隆出Jaggedl的基因，提示Jaggedl在骨髓微环境中发挥重要的作用。HS_27a可以维持造血干/祖细胞的增长活性及自我更新能力，在骨髓的长期培养中能增加鹅卵石样增殖区(CSAs)的数量，HS-27a的这一作用依赖于Jaggedl-Notch信号途径。HS_27a及纯化的Jaggedl可以抑制G-CSF诱导的表达有Notchl的32D细胞的分化,而促进其增埴。Varnum-Finney发现，以Jaggedl培养鼠的
lin+sca一1+kit+骨髓细胞，HPP-mix集落数可得到2-3倍的增长，Jones等也发现同
样的结果，他们以表达有Jaggedl的基质细胞培养鼠的⑶34+c-kit AGM和胎肝造血组细胞 发现，HPP-mix集落数得到4倍或更多的增长。Jaggedl可以用于体外造血干/祖细胞的扩
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发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个骨质疏松相关骨密度基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (LRP5)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GACTGTCAGGACCGCTC -3’下游引物序列5’- GGGGAGGGCCTCACCGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AGACGAGGcGGACTGT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- AGACGAGGtGGACTGT - TAMRA -3’Jaggedl蛋白(JAGl)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- ACCCAGAGACAACCTGT -3’下游引物序列5’- AGACGAGGtGGACTGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - ACCACTTaTTTACC - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- ACCACTTgTTTACC - TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。[0023]扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积10 iil，其中Siil PCR反应液，2 检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读�。莸玫降磨宋馔己褪凳崩┰銮叨寥”患觳庋返腟NP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测骨质疏松相关骨密度基因SNP位点，从而告知被检者患病风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行针对性治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个骨质疏松相关骨密度基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体还骨质疏松症风险性的评估也更便捷。
图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgC12、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针低密度脂蛋白受体相关蛋白5 (LRP5)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GACTGTCAGGACCGCTC -3’下游引物序列5’- GGGGAGGGCCTCACCGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AGACGAGGcGGACTGT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5，-VIC-AGACGAGGtGGACTGT - TAMRA -3’[0041]Jaggedl蛋白(JAGl)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- ACCCAGAGACAACCTGT -3’下游引物序列5，-AGACGAGGtGGACTGT -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - ACCACTTaTTTACC - TAMRA _3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- ACCACTTgTTTACC - TAMRA -3’3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定患骨质疏松症的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95で、30秒，60°C、1分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1.ー种骨质疏松相关骨密度基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2 )、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3 )、装有阳性对照品的ー个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测骨质疏松相关骨密度基因位点是否发生突变从而评估个体患骨质疏松症风险性的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个骨质疏松相关骨密度基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患骨质疏松症风险性的评估也更便捷。
文档编号G01N21/64GK202401073SQ201120569489
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司
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