亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法
技术领域：
本发明涉及一种扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法。
背景技术：
海洋生物热应答分子标记的发展是目前一个热点研究领域。1991年，Veldhuizen等将贻贝放置在不同程度的污染水中时，发现水体污染物异常敏感地诱导贻贝表达热休克蛋白70，这表明在传统指标未发生变化时，热休克蛋白70的表达就可灵敏地探测出水体污染的出现。Cruz-Rodriguez等发现，水体沉积物的增加会诱导牡蛎鳃和外套膜中热休克蛋白70表达水平的显著增加。Snyder MJ等观察到贻贝(Mytilusgalloprovincialis)和鲍鱼(Haliotis rufescens)暴露于高热和化学药品超标的水体中时，其体内的热休克蛋白70含量发生显著变化。Radlowska M等观察到，低浓度的重金属污染可导致贻贝(Mytilus edulis)体内热休克蛋白70的轻微变化，而高浓度的重金属污染可诱导热休克蛋白70高水平的表达，铜、镉联合作用时对热休克蛋白70的诱导似乎更为显著，热休克蛋白70的变化可作为评估环境重金属污染的工具。鉴于这些特性，尝试将热休克蛋白70作为分子指标监测环境胁迫的工作正在进行。
目前对贝类热休克蛋白70的监测大都采用传统的免疫印迹法或聚合酶链式反应检测法。这两种方法均需采集贝类的组织进行研磨后才能进行进一步的实验操作；另外采用免疫印迹法检测热休克蛋白70的表达量之前，还需要对样品总蛋白量进行定量，因此这两种方法前期处理操作步骤繁杂。此外免疫印迹法的检测灵敏度也远不如分子生物学方法和流式细胞术检测方法；而聚合酶链式反应检测法虽然灵敏度高，但由于热休克蛋白70存在转录后翻译水平的调控，聚合酶链式反应检测法存在假阳性，不能精确反映扇贝受激和热休克蛋白70表达的状况。

发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、灵敏度高，可准确反映应激状态下热休克蛋白70表达的活体检测法-扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法。
本发明首先抽取与抗凝剂等量的扇贝血淋巴液，离心后用生物缓冲液洗涤细胞，再次离心，并用细胞固定剂进行固定；然后将固定的细胞分成两份--阳性处理样和阴性本底对照，阳性处理样用间接荧光染色法对热休克蛋白70进行荧光标记，阴性本底对照只进行异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG的孵育；最后利用流式细胞仪对上述阳性处理样和阴性本底对照进行荧光强度的测量，两者荧光强度的比值即为热休克蛋白70的相对表达量。
具体实施例方式
1.取样、固定取出扇贝，用棉球擦干肌柱水分，用预先抽取了常规MAS抗凝剂的一次性注射器，从扇贝肌柱抽取与抗凝剂等量的血淋巴液，用离心机以150×g离心10min，再以常规PBS缓冲液重悬细胞，计数并调至106cells/ml，取上述1ml的细胞重悬液，再150×g离心10min，然后用1ml的4％多聚甲醛细胞固定剂重悬细胞，必要时可以将固定细胞在4℃保存备用。
2.样品的荧光标记取上述固定的细胞，以150×g离心10min，取1ml的PBS-1％BSA(BSA代表小牛血清白蛋白)再度重悬细胞。然后将其分为两份一份0.6ml做为阳性处理样；另一份0.4ml做为阴性本底对照，每个样品的两个样相应做以下处理A.将阳性处理样离心(150×g/10min)用300μl的1∶500稀释的鼠抗热休克蛋白70(Sigma，H5147，稀释液为PBS-1％BSA-0.02％Triton X-100)重悬细胞，并在4℃条件下孵育30min，然后用PBS-1％BSA洗涤细胞；再用300μ1的1∶100稀释的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG(华美生物工程公司，稀释液为PBS-1％BSA-0.02％Triton X-100)重悬细胞，然后再在4℃条件下避光孵育30min，再用PBS-1％BSA洗涤细胞，最后于0.5ml的PBS中重悬细胞，以备下一步的荧光检测。
B.阴性本底对照只进行前述的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG的孵育。
3.荧光强度的测量用流式细胞仪以525nm的波长检测细胞，测得的每个细胞荧光强度信号即反映了该细胞中热休克蛋白70的表达量；每个检测样至少选取5×103个细胞，通常宜选取1×104个细胞，如以每个检测样1×104个细胞的荧光强度平均值即为该样品的平均荧光强度，将阳性处理样与阴性本底对照的平均荧光强度相比，其比值就代表了该扇贝样品热休克蛋白70的相对表达含量。
上述扇贝血细胞离心以150×g/10min的条件最为理想，既保证了血淋巴细胞的分离，又不损伤细胞的完整性。
由此构筑的本发明可以从单个细胞水平监测热休克蛋白70的表达，有较的高灵敏度；另外只需从扇贝体内抽取0.25～0.3mL的血淋巴液既可满足测试需要，又不会影响扇贝的存活，这样有利于连续对所选定的扇贝进行长期监测。另外本发明中血淋巴细胞在4℃条件下体外固定一周，也不影响检测效果。因此本发明提供了一种操作简便、灵敏度高，可准确反映应激状态下热休克蛋白70表达的活体检测法。
本发明作为活体检测，还可应用于其它包括淡水贝类的血淋巴细胞中进行热休克蛋白70的检测，从而反映环境污染状态。另外本发明还可应用于对细胞内其它目的蛋白的标记和分析。
权利要求
1一种扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法，首先抽取与抗凝剂等量的扇贝血淋巴液，离心后用生物缓冲液洗涤细胞，再次离心，并用细胞固定剂进行固定；然后将固定的细胞分成两份——阳性处理样和阴性本底对照，阳性处理样用间接荧光染色法对热休克蛋白70进行荧光标记，阴性本底对照只进行异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG的孵育；最后利用流式细胞仪对上述阳性处理样和阴性本底对照进行荧光强度的测量，两者荧光强度的比值即为热休克蛋白70的相对表达量。
2如权利要求1所述的检测方法，其特征是上述细胞固定剂为4％多聚甲醛。
3如权利要求1所述的检测方法，其特征是上述的离心条件为150×g10min。
4如权利要求1所述的检测方法，其特征是上述抗凝剂为MAS。
全文摘要
一种扇贝血淋巴细胞中热休克蛋白70的流式细胞术检测方法，首先抽取与抗凝剂等量的扇贝血淋巴液，离心后用生物缓冲液洗涤细胞，再次离心并用细胞固定剂进行固定；然后将固定的细胞分成两份——阳性处理样和阴性本底对照，阳性处理样用间接荧光染色法对热休克蛋白70进行荧光标记，阴性本底对照只进行异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG的孵育；最后用流式细胞仪对上述阳性处理样和阴性本底对照进行荧光强度的测量，两者荧光强度的比值即为热休克蛋白70的相对表达量。因此本发明提供了一种操作简便、灵敏度高，可准确反映应激状态下热休克蛋白70表达的活体检测法。本发明作为活体检测，还可应用于其它包括淡水贝类，从而反映环境污染状态。
文档编号G01N33/536GK1598583SQ20041003559
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月20日 优先权日2004年8月20日
发明者曲凌云, 孙修勤, 相建海 申请人:国家海洋局第一海洋研究所