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专利名称：使用五聚环蛋白-3(ptx-3)的药物安全性试验的制作方法
使用五聚环蛋白-3(PTX-(3)的药物安全性试验过去，在临床研究期间施用治疗性抗体导致了涉及所述抗体的第一次注入的严重 的副反应。已经描述了在循环中特定的促炎细胞因子的过量的急性释放，且认为是在引起 复杂的症状中关键的，表示为细胞因子释放综合征(CRS)。通常CRS在注入后20-90分钟开 始，且是抗体靶向的细胞释放细胞因子的结果，以及是抗体与Fc受体结合而引起的免疫效 应细胞释放细胞因子的结果。当细胞因子释放入循环时，全身性症状如发热、恶心、寒战、低 血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、嗓子发痒和呼吸困难可产生。在大多数患者中，症状在严 重性上是温和到中等的且易于处理。然而，一些患者可能经历严重的，威胁生命的反应，这 些反应源自细胞因子的大量释放。由于CRS是种特异性事件，该特异性事件在常规的药物试验的动物模型中不能观 察到，因此需要基于人类血液来源的细胞的体外模型以评价新医药产品的细胞因子释放风 险。已知的是测量血清或血浆中细胞因子水平的测试法。然而，经典的细胞因子如TNF-α、 IFN-Y或白介素的增加不是总是可预测CRS的发生。而且用可获得的测试法，血液样品中 细胞因子的释放仅仅在潜在的不利事件后的相当长时间后是可检测的。因此，需要提供可 靠的和更快速的方法用于确定化合物诱导CRS的风险。这一问题通过本发明解决，尤其通 过使用五聚环蛋白-3用于确定化合物在诱导急性细胞因子释放相关的注入反应方面的免 疫原性。因此，本发明提供ΡΤΧ-3用于确定目标化合物在人类中诱导细胞因子释放综合征 的风险的用途。另外，本发明提供用于确定目标化合物的免疫原性的新方法。尤其是该方法允许 在个体中评价目标化合物诱导CRS的风险。所述的方法包括如下步骤a)提供全血样品，其中所述的血液样品暴露于所述化合物，b)测量所述的样品中五聚环蛋白-3(ΡΤΧ_3)的水平，和c)将五聚环蛋白-3的测量水平与对照进行比较。优选地测量血浆中ΡΤΧ-3的水平，所述的血浆通过从全血样品中除去血细胞得 到。备选地，也可测量从全血样品获得的血清中的ΡΤΧ-3水平。术语“免疫原性”指物质引起免疫应答的能力。免疫应答是由B-细胞、T-细胞和 先天免疫系统的细胞，如单核细胞、巨噬细胞或中性白细胞介导的免疫系统对物质的反应。 B-细胞反应涉及抗原特异性抗体的产生和释放。T-细胞、单核细胞或粒细胞的应答可涉及 促炎性和/或抗炎性细胞因子的释放。在机体循环中过量的特定促炎性细胞因子的急性释 放表示为“细胞因子释放综合征”(CRS)。细胞因子是在细胞间起信使作用的可溶性蛋白质，其刺激或者抑制免疫系统的多 种细胞的活性。细胞因子包括淋巴因子、单核因子、白介素和干扰素。本文中使用的术语“目标化合物”指生物分子或化学分子。生物分子可以特别是 多肽或多核苷酸。所述的多肽和多核苷酸可以有修饰，例如甲基化、聚乙二醇化、磷酸化和
糖基化。
本文中使用的术语“多肽”指通过肽键连接的氨基酸链。术语“多肽”还包括蛋白 质和肽。优选地，多肽是抗体，更优选地，多肽是治疗性抗体。治疗性抗体可是人抗体或人源化抗体。本文中使用的术语“多核苷酸”涉及包含核苷酸A、C、G和T (或U)的核苷酸的聚 合物。多核苷酸是例如寡核苷酸、miRNA, siRNA、反义RNA、mRNA或cDNA。优选地，目标化合物是治疗性化合物。治疗性化合物是在治疗方法中使用的化合 物，包括缓和、消除或减轻症状，或预防或减少感染任何疾病或者人或动物机体机能失常的 可能性。治疗性化合物可以是生物分子或化学分子。生物的治疗性化合物优选地是抗体或 SiRNA0五聚环蛋白-3(ΡΤΧ_3)，也已知为Pentaxin-3，属于已知为“长五聚环蛋白”的 蛋白质家族，其具有羧基端五聚环蛋白结构域的特征(Basile等，J Biol Chem. 1997, 272(13) :8172-8)。编码 381 个氨基酸(SEQ. ID NO 1)的这一蛋白质的 cDNA 已由 Breviario 等克隆(J Biol Chem.，1992，267 (31) :22190-22197)且鉴定为其表达在人类脐静脉内皮细 胞中通过IL-I β诱导的基因。多种细胞类型产生和分泌五聚环蛋白_3。人类外周血单核细胞应答细菌脂多糖、 IL-I β 和 TNF-α 产生该蛋白质，但不应答 IL-6、MCP-U M-CSF, GM-CSF 或 IFN-y (Alles 等，Blood. 1994,84(10) :3483-93)。五聚环蛋白在受刺激的单核细胞、内皮细胞和成 纤维细胞中表达(Alles等，1994)，在树突细胞中表达(Doni等，Eur J Immunol. 2003, 33(10) :2886-93),在未分化的和分化的成肌细胞中表达(Introna等，血液.1996，87 (5) 1862-72)，在类风湿性关节炎滑膜细胞中表达(Luchetti等，Clin Exp Immunol. 2000, 119(1) :196-202.),在神经胶质细胞中表达(Polentarutti 等，J Neuroimmunol. 2000 年7月1日；106 (1-2) :87-94)，在卡波西肉瘤细胞(可通过病毒IL-6诱导)中表达 (Klouche等，AIDS. 2002年5 ^ 24 H ；16(8) :F9_18)，在巨噬细胞、内皮细胞中表达和不 常发生地由平滑肌细胞在晚期的粥样硬化斑块中表达(Rolph等，Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002 ；22 (5) :el0_4)，在肾小球系膜和内皮细胞中表达(Bussolati等，J Immunol. 2003 年 2 月 1 日；170 (3) 1466-72)，在前脂肪细胞表达(Abderrahim-Ferkoune 等，J Lipid Res. 2003 ；44(5) :994-1000)，在人类和鼠类卵丘细胞表达(Salustri等， Development. 2004 ； 131 (7) :1577-86)和在中性白细胞中表达(Jaillon 等 JEM. 2007， 204(4) :793-804 ；Imamura 等，Cell Immunol 2007,248(2) :86-94)。本文中使用的术语“全血”指包含悬浮在称为血浆的液体中的红细胞、白细胞和血 小板的液体。全血样品可以从任何动物采集。优选地，全血样品从人类患者采集(人全血 样品)。有一些方法用于使全血暴露于目标化合物方法1) 一种可能性是将化合物加到全血样品。在采集样品后尽快加化合物，优选 地在采集后4小时内加，更优选地在采集后0. 5-3小时内加。最优选地在采集后30至60 分钟内加化合物。在加化合物到全血样品和处理样品之间有孵育期。孵育优选地在采集血样后4小 时内开始。全血样品优选地和目标化合物孵育至少30分钟。更优选地，孵育期至少为1小 时，甚至更优选的是将全血样品和目标化合物孵育至少2小时。优选地，全血样品与目标化合物孵育不超过48小时，更优选地，不超过M小时。优选的孵育期是30分钟至M小时。 进一步优选的孵育期是2小时至M小时。更优选地，孵育期是30分钟至4小时。孵育在室温(20°C )或更高温度进行。优选地，在生理条件下孵育样品(温度 35-39°C，优选地大约37°C ;3至7%的(X)2浓度，优选地大约5% )方法幻第二种可能性是给供体施用目标化合物(例如通过注入)并然后采集全 血样品。在施用目标化合物和采集全血样品之间是等待期。所述的等待期在30分钟至M 小时之间。两个供选方案的组合是可能的，即给供体施用目标化合物，采集供体的全血样品， 并将目标化合物加到全血样品。在暴露后进一步处理样品。进一步处理包括但不局限于从全血样品中除去血细 胞。任选地，额外地从样品中除去纤维蛋白原和凝血因子。优选地，在从供体采集后4小时 内进一步处理全血样品，更优选地，在从供体采集血样后3小时内。最优选地，在从供体采 集血样后30至60分钟内处理全血样品。在将全血样品与目标化合物孵育的情况(按照方 法1或方法1和方法2的组合暴露)，在孵育期后进一步处理全血样品，优选地在孵育时间 结束后5至60分钟内。可在源自所述的全血样品的血清或血浆中测量PTX-3。PTX-3水平的测量可在新 鲜的血浆或血清中进行，所述的血浆或血清获得自与目标化合物孵育后的全血样品。备选 地，可冷冻血浆或血清并在稍后的日期解冻以测量PTX-3水平。术语“血浆”指血液的液体部分。通过离心除去血细胞(红细胞、白细胞、凝血细 胞)得到血浆。上清(=血浆)包含血清、纤维蛋白原和其他凝血因子。因此血清是无凝 血因子的血浆。术语“血细胞”指在血液中通常发现的任何类型的任何细胞。血细胞包括但不局 限于红细胞(红血细胞)、白细胞(白血细胞)和凝血细胞(血小板)。为了预防和延迟全血样品或血浆的凝结，向样品加入抗凝剂。优选的抗凝剂是肝 素(例如Na-肝素，例如30USP至143USP单位的肝素钠(冷冻干燥)或60至90USP单位 的肝素钠(喷雾包覆))、柠檬酸盐(例如大约0. 4%的终浓度)或草酸盐。通常抗凝剂包 覆在包含样品的容器(例如管)的内表面。这样的包覆管对本领域技术人员公知(例如源 自 BD Diagnostic Systems 的 Vacutainer 或源自 Greiner Bio-one 的 Vacuette)。另一禾中 可能性是在集血后5至15分钟内向样品添加抗凝剂(优选地在采集后小于5分钟，更优选 地在采集后小于1分钟)。肝素化的血浆是含有肝素以预防凝结的血浆。测量PTX-3的方法对本领域技术人员公知。它可以例如通过利用酶联免疫吸附 剂测试法(ELISA)测量。ELISA试验对对本领域技术人员公知。为了测量PTX-3，一般使 用夹心ELISA。试剂盒是是商业上可获得的(例如源自ALEXIS Biochemicals的目录号 ALX-850-299)。优选地，用增强化学发光(ECL) ELISA测量PTX-3水平。夹心ELISA例如通过如下进行(1)用捕获抗体包被固体支持物(例如板)；⑵ 加样品(血浆)，且任何存在的抗原结合到捕获抗体；(3)加结合抗原的检测抗体；(4)加结 合检测抗体的酶联二抗；( 加底物，该底物被酶转化为可检测的形式。在ECL ELSA中，连接到二抗的酶直接地或间接地转化ECL底物为发射化学发光的形式。适宜的酶例如是辣根过氧化物酶(HRP)。适宜的ECL底物例如是鲁米那。酶在目标 分子附近催化转化ECL底物为致敏剂，其通过过氧化氢进一步氧化产生三联体(激发的) 羰基，该三联体羰基在衰退为单体羰基时发射光。增强的化学发光允许检测微量生物分子。 可以检测低至飞摩尔量的蛋白质。另一种检测PTX3的方法是比色ELISA测试法。在比色ELISA中，连接到二抗的酶 直接或间接转化底物为可通过分光光度法检测的形式。适宜的酶是与例如TMB (四甲基联 苯胺)、DAB (3，3 ‘ - 二氨基联苯胺)、AEC (3-氨基-9-乙基咔唑)或CN(4-氯-1-萘酚) 结合的辣根过氧化物酶(HRP)。另一种适宜的酶是与例如萘酚AS-MX磷酸酯或硝基蓝四唑 /5-溴-4-氯-3-羟基吲哚磷酸酯对甲苯胺(NBT/BCIP)结合的碱性磷酸酶(AP)。如果与对照的PTX-3水平相比较，在暴露于目标化合物后的PTX-3的测量水平显 著地提高，则所述目标化合物具有在体内诱导CRS的风险。对照是未暴露的全血样品的五聚环蛋白-3水平。未暴露指所述的血液既未暴露 于目标化合物，也未暴露于另一种在生理条件下已知引起细胞因子释放的化合物。血液优 选地在处理前根本不暴露于物质。显著地提高指水平与对照水平对比更高且与对照水平的差异是统计学上相关的 (p ( 0. 05，优选地，P 彡 0. 01).现在已一般地描述了本发明，通过参考具体的实施例并与下面的附图相结合，本 发明将变得更好理解，所述具体的实施例仅仅为了说明的目的包括在本文中且除非另有说 明，并不试图限制本发明。附ι是CDiib+中性白细胞(I)的活化和在暴露于MabCampath 、 Synagis 、Orthoclone οκτ 3 或 LPS 后全血中 PTX-3 (II 和 III)测量的释放的 图解表示。从两个不同的个体供体1(

图1A)和供体2(图1B)采集全血样品并各自用 (0. ooi-ioong/ml)LPS( Δ )或阳性对照单克隆抗体MabCampath ( )、阴性对照抗
体Synagis ( □)和比较者单克隆抗体Orthoclone OKT3 (▲)处理2小时，这些抗 体的浓度范围0. 01-200 μ g/ml，与在治疗性蛋白质首先在人中注入期间在体内一般获得的 药物暴露水平对应。通过FACS(I)测量⑶lib表达和通过比色(II)或电化学发光(III) 定制夹心ELISA测量血浆(通过从全血样品中除去血细胞得到)中PTX3释放。图 2 是在暴露于MabCampath 、Synagis 、Orthoclone ΟΚΤ 3 或 LPS 后 全血中TNF- α释放的图解表示。从两个不同的个体供体1 (图2Α)和供体2 (图2Β)采集全 血样品并各自用阳性对照单克隆抗体MabCampath ( )、阴性对照抗体Synagis (□)和比较者单克隆抗体Orthoclone ΟΚΤ 3(A)处理2小时，或用(0. OOl-IOOng/ ml)LPS( Δ )处理2小时。测量血浆(通过从全血样品除去血细胞得到)中⑶lib和PTX3 的浓度。一般地，在两个供体中单克隆抗体MabCampath 引起TNF-α的强烈释放，达到 ι μ g/ml的峰水平，而单克隆抗体Synagis 在两个供体中在任何浓度为阴性。单克隆抗 体Orthoclone OKT 3仅在一个供体的血液中在TNF- α方面显示剂量相关的增加(图 2Α)，但在另一个供体中不显示(图2Β)。图3是在源自5-10个健康个体的全血样品中检测的⑶lib+中性白细胞(I)的活化和检测的PTX3(II)和TNF-α (III)的释放的图解表示，所述的全血样品在不同浓度的 单克隆抗体 Mab Campath ( )、Orthoclone OKT 3 ( ▲ )、Synagis ( □)和 LPS( Δ ) (200μ g/mlU00y g/mlU0y g/mlUu g/ml,0. 1 μ g/ml、0. 01 μ g/ml)存在下在 2 小时后分析。测量血浆(通过从全血样品除去血细胞得到)中的PTX3和TNF-α。Α)供体1，B)供体2，C)供体3，D)供体4，E)供体5，F)供体6，G)供体7， H)供体8，I)供体9，K)供体10图 4 是在暴露于 Mab Campath 后 PTX3 (I)、TNF- α (II)和 IFN- y (III)释放 动力学的图解表示。Y-轴血浆中PTX3、TNF-α和IFN-γ的测量浓度；X-轴加入到全 血样品的 Mab Campath 浓度(200 μ g/ml> 100 μ g/ml> 10 μ g/ml> 1 μ g/ml、0. 1 μ g/ml、 ο. οι μ g/ml)。人全血样品与Mab Campath 孵育30分钟( )、1小时(▲ )、2小时 (□)和4小时(〇)。5个健康供体的结果显示为A)供体6，B)供体7，C)供体8，D)供 体9，E)供体10。图5是在暴露于Synagis 后PTX3⑴、TNF- α (II)和IFN- y (III)释放动力学 的图解表示。Y-轴血浆中PTX3、TNF-a和IFN-γ的测量浓度；X-轴加入到全血样品的 Synagis 浓度(200 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、0· 01 μ g/ml)。人 全血样品与Synagis 孵育30分钟( )、ι小时(▲)、2小时(□)和4小时(〇)。5 个健康的供体的结果显示为A)供体6，B)供体7，C)供体8，D)供体9，E)供体10。图6是TNF- α (图6A)、IFN- Y (图6Β)和ΡΤΧ3 (图6C)释放的动态范围的图解表 示。为了测量动态范围，将来源自10个健康供体的血液样品在MabCampath 的标示浓 度存在下孵育2小时。各曲线代表采集自供体1-10之一的数据。图7是用ECL ELISA可检测的PTX的范围的图解表示。对采集自供体1_10的全 血样品除去血细胞得到的血浆进行测量。标准曲线显示测量的标准品在浓度框范围和检测 范围的线性。A 表示检测范围之上的信号；B 表示检测范围内的信号；C 表示检测范围之 下的信号。Χ-轴浓度(pg/mgl)，Y-轴信号强度图8是在暴露于TGNl 1412样抗体、MabCampath (阳性对照)和爱必妥(Eribitux) (阴性对照)后PTX3释放的图解表示。将来源自2个不同个体的血液用阳性对照单克隆 抗体Mab Campath (O)或阴性对照抗体ErbitllX ( )和比较者TGN1412样单克 隆抗体(■)以0.1、1.0、10和100 μ g/ml的浓度处理M小时。通过电化学发光定制夹心 ELISA测量PTX3(I)和TNF-α (II)释放。图8Α 供体A ；图8Β 供体B。
实施例除非另外指出，在实施例中涉及的商业上可获得的试剂按照制造商说明书使用。实施例1 Α)材料和方法试验物质由于产生最严重的CRS的抗⑶观单克隆抗体TGN1412 (Suntharalingam G等， Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti_CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006) :1018-28)不是公开地可得到的，与I期临床试验专家试验组
7一致(ESG 最终报告EXPERT SCIENTIFIC GROUP ON PHASE ONE CLINICAL TRIALS, Final Report, Department of Health (UK)，30. November 2006)，我们利用改制的抗⑶沘人 IgG 即 TGN1412 样抗体、抗 CD3 单克隆抗体 Muromonab_CD3 (Orthoclone OKT 3) (Chatenoud L, Ferran C, Legendre C. In vivo cell activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and modulation by steroids. Transplantation. 49(1990) 697-702)和特别是抗CD52单克隆抗体阿来组单抗(Alemtuzumab) (Mab Campath ) 作为参考标准品(Wing MG Mechanism of first-dose cytokine-release syndrome by CAMPATH I-H : involvement of CD16 (FcgammaRIII) and CDl la/CD 18 (LFA-I) on NK cells. J Clin. Invest. 98(1996) :2819-26) 对比者:Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT 3)，抗 CD3 小鼠 IgG2a, Jansen Cilag AG，瑞士，批次号 BN 6GSTV00，有效期限:2007 年 4 月，贮液 10mg/ml (用 Centricon Ultracel YM-100.目录号 4211，Micon 从 lmg/ml 输注液浓缩)，用 Bradford 分析和 SDS-PAGE检验浓度和纯度。在4°C等分贮存，进一步在PBS(pH 7.4)中稀释(参见“全血测 试法”)。在肾移植患者中产生CRS的鼠IgGh抗⑶3单克隆抗体Orthoclone OKT 3用 作为额外的参照药物。在40%试验病例中它对TNF-α释放为阳性(图2、3和6)。改制的抗⑶沘人IgG即TGN1412样抗体(基于US2006/(^86104 Al中TeGenero TGN1412公开的序列)贮液11. 2mg/ml，用Bradford分析SDS-PAGE检验浓度和纯度。贮存 在-80°C，进一步在PBS中稀释。阳性对照阿来组单抗(Mab Campath )，抗CD52人源化IgGl，Schering,瑞 士，批次号42018R,有效期限:2007年5月；和42019T,有效期限:2007年12月，贮液IOmg/ ml，无菌液体，在4°C等分贮存；进一步在PBS中稀释(参见“全血细胞测试法”)。已知在白血病、淋巴瘤和多发性硬化患者中引起首次剂量CRS(Wing MG等， Mechanism of first-dose cytokine-re lease syndrome by CAMPATH 1~H involvement of CD16(FcgammaRI11)andCDlla/CD18(LFA-I) on NK cells.J Clin. Invest. 98(1996) =2819-26)的人源化 IgGl 抗 CD52 单克隆抗体 Mab Campath 用作为 细胞因子释放和中性白细胞伴发活化的阳性对照。在已试验的除一个样品外的全部样品中 MabCampath 诱导TNF-α释放超过60士 10pg/ml的阈(参见“阈”)(图2、3和6，表 5)。动态研究的第一个供体仅仅在与MabCampath 孵育4小时后达到这一 TNF-α分 泌的阈。阴性对照抗体Palivizumab(SynaglS ),抗 RSV 人源化 IgGl，Abbott Laboratories，批次号3(^82TF，有效期限2008年6月，贮液100mg/ml，在随药用产品提供 的无内毒素水中重建，等分贮存在-80°C，进一步在PBS中稀释(参见“全血细胞测试法”)。不与任何类型的CRS相关，在儿童中指征先天性心脏病的人源化IgGl抗呼吸道合 胞病毒(RSV)单克隆抗体Synagis 用作为阴性对照。单克隆抗体Synagis 在全部试验 病例中对细胞因子释放为阴性(图2、3和6)。特异性结合人表皮生长因子受体(EGFR)的胞外域的人/小鼠嵌合单克隆抗体爱 必妥(Cetuximab )在大约3%的患者中发生严重的注入反应，贮液2mg/ml，等分贮存在4°C，进一步在PBS中稀释。药物浓度范围在 0. 01-200 μ g/ml (0. 01 μ g/mUO. 1 μ g/ml > 1 μ g/ml > 10 μ g/ml> 100 μ g/ml 禾口 200 μ g/ml或0. 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml和100 μ g/ml)的浓度范围内测试要分析的药
用产品。如从各个药物代谢动力学(PK)曲线所得，该范围在大多数情况覆盖对于人首次剂 量期待的各个产品的峰暴露水平。所有的参照药物在相同的浓度范围内平行分析，从而也 在治疗患者中覆盖各个药物的典型血浆暴露。包括PBS对照以检测基线水平。由于参照药物单克隆抗体MabCampath 的细胞毒性，导致血液负荷细胞死 亡，并且由于对可以加至全血的体积的限制来避免不可接受的稀释，药物浓度> 200 μ g/ml 对WBA是难以顺从的。全血细胞测试法(WBA)除非另外说明，在含有肝素锂作为抗凝剂(Blood Donation Center, Swiss Red Cross，Basel，瑞士，或Roche Pool)的Vacutainer管中采集源自健康血液供体的全血。在 采集后1-3小时内处理血液并与增加浓度的相关药用产品在37°C共孵育30分钟直到4小 时和M小时。预验证试验显示在4小时内开始的血液加工最佳的实施条件，否则红细胞的 裂解将扰乱分析。在下面浓度分析包括参照抗体MabCampath 、Orthoclone OKT 3 禾口 Synagis 的药用产品:0. Ol μ g/ml、0. I μ g/ml, 1 μ g/ml, 10 μ g/ml, 100 μ g/ml 和 200 μ g/ml。在下面的浓度分析 TGN1412 样抗体0. 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ ml。将195 μ 1的血液一式三份的加入到含有5 μ 1试验产品的96-孔板的U-底孔。这些 条件保证就实用性和有效性而言的最佳实现以获得至少70 μ 1的血浆和足够的细胞以分 别进行ΡΤΧ3、血浆中多细胞因子测量和最终的CDllb流式细胞术细胞分析。通过包括含有 PBS(磷酸缓冲盐溶液，ρΗ 7.4)的对照评价内源的血细胞活化。在37 °C在具有5% CO2的孵育器中孵育30分钟至4小时/ 小时后，将板在1800g 离心5分钟。小心除去上清(含有大约70 μ 1血浆)并在-70°c等分冷冻。将70 μ 1 PBS (ρΗ 7. 4)加入到细胞沉淀并轻轻地混合。TNF- α 禾P IFN- γ 多路测试法(MSD)为了测定血浆中的细胞因子，将血浆解冻。预试验显示细胞因子的水平在新 鲜的血浆样品和解冻的血浆样品间无差异。按照制造商方案(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)通过超灵敏人细胞因子测试法测定细胞因子浓度(人细胞因子测 试法，MS2400 定制板人 TNF- α 和 IFN- y 2erPlex 源自 MSD)。在 kctor Imager 2400 上用 MSD Discovery 工作台软件 2. 0 (Mesc^cale Discovery, Gaithersburg MA, USA)分析板。数据呈现为源自三孔的血浆上清的测量的平均值。结果表示为pg/ml。荧光激活的细胞分选(FACS)对于FACS分析，在室温将50μ1的全血细胞(见全血细胞测试法)与抗体 CD45PerCP(目录号 345809，BD Pharmingen)、CDllb PE(目录号 555388，BD Pharmingen) 和CD16 FITC(目录号554406，BD Pharmingen)孵育30分钟。在孵育时间后将450 μ 1的 FACS裂解液(目录号349202，BDPharmingen)加入到细胞悬浮液。将染色和固定的细胞在 暗处室温储存并通过流式细胞术(BD FACS Calibur ；CelIQuestPro 4.0.2.软件，制造商 BDBiosciences San Jose CA, USA)第二天分析 CDllb 在 CD16+/CD45+中性白细胞上的上调(Nicholson 等，A novel flow cytometric assay of human whole blood neutrophil and monocyte CDllb levels :upregulation by chemokines is related to receptor expression, comparison with neutrophil shape change, and effects of a chemokine receptor (CXCR2)antagonist. Pulm Pharmacol Ther. 20 (2007) :52-9.)。比色ELISA用于人血浆中的PTX3使用PTX3 人检测套组(目录号 ALX-850-299, Alexis Biochemicals (ALEXIS Corporation, Lausen，Schweiz)开发夹心 ELISA。在 4°C用捕获抗体(700ng/ml)过夜包 被后，用PBS-0. 05%吐温洗涤96孔板(目录号446612，Nunc Maxisorp , Nunc A/S)并用 PBS-0. 2%明胶缓冲液在37°C封闭1-2小时。通过在PBS-吐温-2% BSA(吐温0. 05%,PBS PH7. 4)中稀释重组人PTX3蛋白制备校准物。样品和校准物在37°C孵育2小时，接着在37°C 与生物素化检测抗体(50ng/ml)孵育1小时。将样品与链亲和素-过氧化物酶(目录号 7100-05，Southern Biotech Birmingham, USA)孵育 45 分钟起始比色反应，接着与 TMB (四 甲基联苯胺，目录号T4444，Sigma Saint Louis, USA)孵育15分钟，然后用浓硫酸终止。在 ELISA 读数器上用 SoftMax Pro 软件(Molecular Devices, USA)在 450nm 读板。ECL ELISA用于人血菜中的PTX3通过电化学发光，使用PT)(3人检测套组(目录号ALX-850-299，Alexis)，设 计 MSD QuickPlex 定制板(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA)和免疫测定 用于PTX3检测。捕获抗体(lyg/ml)缀合到QuickPlex连接体(目录号K15A06-2， MesoScaleDiscovery)并按照 MSD 说明书(MesoScale Discovery, Gaithersburg MA, USA) 进行免疫测试。在 Sector Imager 2400 读数器(Mesc^cale Discovery, Gaithersburg ΜΑ, USA)上分析板。数据表示为源自三孔的血浆上清测量的平均值。结果表示为ng/ml。阈的定义(阳性对照)通过各药用产品诱导的细胞因子，如果满足以下两个标准，则认为样品“阳性”(= 出现CRS的风险提高) (i)测量到在分割点60 士 10pg/ml以上的TNF- α水平。这一阈源自采集自 多发性硬化患者血浆的体内数据，所述患者在首次注入MabCampath 后产生了 CRS(Moreau T等，Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996) :225-37)。60士lOpg/ml 是 在与严重的CRS相关的同组的各个患者中报告的最低的TNF-α水平。在第一次注入美 罗华(Rituximab)后，在显示CRS的肿瘤患者中发现了类似范围的TNF-α值(Winkler U 等，Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8) · Blood. 94(1999) :2217-24)。(ii)⑶lib+中性白细胞的百分数超过30%。通过即使缺乏细胞因子释放，可在某种程度观察到中性白细胞活化的事实解释这 一阈，所述中性白细胞活化取决于供体，有时候达到25-30%的值。统计学评价从一式三份计算平均值和标准偏差。通过GraphPad prism 4(GraphPad Software
10Inc, La Jolla，USA.)进行动态范围的评价和变异系数的计算。用LOD Fit 1.0 (Roche Pharma Informatics)计算 LLOD 禾口 LL0Q。体外评价与体内细胞因子释放的关系WBA方案预见了对于OKT 在37°C共孵育达4小时的源自健康个体或患者的肝 素化血液，随着相关药用产品关增加的浓度，在采集血液后1-3小时内进行。随后分析源自 那些样品的血浆的PTX3和促炎细胞因子TNF- α和IFN- γ的释放。这一方案尽可能接近地模拟体内的情形已报道引起CRS的抗体在首次注入开 始后的0.5-4小时内诱导全身释放TNF-α和/或IFN-γ和潜在地其他细胞因子和趋 化因子，例如 IL-6、IL-8 (Moreau T Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996) 225-37 ；Suntharalingam G 等，Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti_CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006) :1018-28)。额外地，在具有全身 炎症应答综合征或处于败血性休克中的患者中，在第一个M小时期间PTX3血浆水平急剧 地增加且与临床评分以及疾病严重性相关(Muller B等，Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlate with severity of infection in critically ill patients, Crit Care Med. (2001)29:1404-1407)。总之，认为这些可溶性因子引起并反映相当大量 的各种严重性的症状，显然取决于数量、位置、时限和通过血流释放和循环的细胞因子的类 型。终点已建立两种类型的终点以说明药物诱导的细胞因子释放的风险关键的促炎细胞 因子，例如TNF-α和IFN-Y的分泌；以及中性白细胞上的粘附分子⑶lib的上调a.促炎细胞因子TNF-α禾Π IFN-γ在其他细胞因子中，细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-Y已在首次注入相关CRS 的情形中重复地描述。主要地，随着将TNF-α释放的幅度在某种程度上与CRS的严 重性相关，TNF-α看来是由各个药物引起释放的动力学上首先的和步调调整的细胞因 子(Suntharalingam G 等，Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti_CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006) :1018-28 ；Winkler U 等， Cytokine-release syndrome in patients with B~cell chronic lymphocyticleukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti_CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8) · Blood. 94(1999) :2217-24).通过使用允许在小体积样品中检测多重分析物的MSD超敏人细胞因子测试法 (Meso Scale Discovery，Gaithersburg，Maryland，USA)测量所述的细胞因子。与常规的 ELISA比较，MSD系统具有如下优势(i)硫代-TAG电发光检测的宽动态范围和高灵敏度； ( )通过在多点板上以图案模式阵列固定的特异性抗体有效地捕获分析物；和(iii)通过 独特的条形码系统完全地可追溯回板制造记录和抗体斑点模式。b.中性白细胞上的粘附分子⑶lib细胞因子释放常常伴随毛细血管泄漏和血细胞渗透出到处周组织，导致血压降低 禾口有时的多器官衰竭(Suntharalingam G 等，Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355(2006) :1018-28.)。
11表达升高水平的粘附分子CDllb的活化的中性白细胞(Nicholson GC等，A novel flow cytometric assay of human whole blood neutrophil and monocyte CDllb levels upregulation by chemokines is related to receptor expression, comparison with neutrophil shape change, and effects of a chemokine receptor(CXCR2)antagonist. Pulm Pharmacol Ther. 20(2007) :52-9)呈现为属于参与毛细血管泄漏和其后果中的免疫 细胞的亚型。因此，CDllb+中性白细胞百分数的测量将促炎细胞因子的释放与潜在的下游 事件相联系，其中所述下游事件例如中性白细胞的活化、中性白细胞粘附到毛细血管壁和 伴发的导致毛细血管泄漏综合征的内皮衬的打开。可通过多色流式细胞术对⑶45+/⑶16+血细胞亚群的门控确定活化中性白细胞 的百分数。没有再评价加各个药物后CDllb+细胞相对于基线变化的百分数。阈细胞因子在首次注入后，血浆中分泌的TNF-α的量明显地与和CRS相关的症状的数量和 严重性相关。因此，如在MSD试验中检测的，认为TNF-α的量对风险评价最相关。根据 从用MabCampath 治疗的多发性硬化患者(Moreau T等，Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996) :225-37)和用美罗华治疗的淋巴瘤或白血病患者(Winkler U等， Cytokine-release syndrome in patients with B—cell chronic lymphocytic leukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti_CD20 monoclonal antibody (Rituxima, IDEC-C2B8). Blood. 94 (1999) :2217-24)获得的间接体内(ex vivo) 数据，认为60士10 8/1111的1顺-(1水平为区分阴性样品和阴性样品的合理的分割点。这一 阈值与TNF-α最低水平相对应，其足以诱导轻微的CRS。CDllb 在本文描述的WBA条件下，在缺乏TNF-α或一种其他细胞因子时⑶lib+中性白 细胞的亚群显示达到大约30%的基线水平。因此，将30%的百分数用作为分割点。因此， 仅仅认为⑶lib+中性白细胞的数值> 30%为阳性信号。总之，认为达到TNF-α水平> 60pg/ml和> 30%⑶lib+中性白细胞的样品对于 临床上相关的细胞因子释放风险为“阳性”。细胞因子释放和中性白细胞活化的纵向稳定性源自健康个体的全血中药物诱导的细胞因子释放和伴发的中性白细胞活化显得 相当的纵向稳定而不是有意义的可变。因此细胞因子释放的纵向稳定性的研究在此处不重
Μ. ο技术鉴定由于在患CRS的患者中的许多病例中发现TNF-α是动态地首先释放的细胞因子， TNF-α呈现为对于CRS的风险评价关键的细胞因子。因此，下面详细描述的技术鉴定计划 主要是指用TNF-α获得的数据。已经研究了另外的细胞因子IFN-γ，然而主要用于证实。如通过粘附分子⑶lib的上调确定的，已平行分析了⑶lib+中性白细胞的亚群以 评价TNF-α释放在何种程度上伴随中性白细胞活化。作为创新的方法，测量人血浆中的PTX3以评价它是否便于用来解释中性白细胞活化和确定是否PTX3可作为CRS风险评价的 适当的参数。由于MabCampath 存在下大多数血液供体显示中等到强的细胞因子释放， 将MabCampath 选作为WBA技术鉴定的主要参照药物。PTX3测量和中性白细胞活化(结果)
OKT3 用(O.OOl-lOOng/ml)的脂多糖(LPS)或用典型地在治疗性蛋白质的人首次注入 期间达到的与体内药物暴露水平相应的0. 01-200 μ g/ml的浓度范围的阳性对照单克隆抗 体MabCampath 、阴性对照抗体Synagis 和比较者单克隆抗体0rthocloneQKT:3 处理源自两个不同个体的血液样品2小时。通过FACS测量⑶lib表达。通过比色ELISA 或者电化学发光定制夹心ELISA测量PTX3释放。在与血液共孵育2小时后，在两个供体中除Synagis 外所有的试验药物诱导对 于中性白细胞的活化而言大于30%阈的⑶lib上调。另外，在这两种ELISA测试平台中， LPS、MabCampath 和OrthocloneOKTS 引起剂量依赖PTX3释放。比色和ECL ELISA ΡΤΧ3剂量应答曲线显示类似的形状但测量浓度的一起比较显示在两种方法之间100倍的 不同，其值分别在0. 1-0. 6ng/ml范围对10-60ng/ml的范围(图1)。临床试验中报道的PTX3血液水平和间接体内研究典型地在对照中低于2ng/ml， 而在8小时后对于败血症患者是800ng/ml的范围(Bottazzi B, Garlanda C, Salvatori G, Jeannin P, Manfredi A, Mantovani A. Pentraxins as a key component of innate immunity. Curr Opin Immunol (2006) 18 :10-15)。这些值与用 ECL 测试法得到的 PTX3 浓度 级别相应，因此赞同这一测试法作为目前研究中选择的方法用于PTX3测量。TGN1412 样抗体用首次注入期间达到的与体内药物暴露水平相应的0. 1-100 μ g/ml的浓度范围 的阳性对照单克隆抗体MabCampath ,或阴性对照抗体Erbitux 和比较者TGN1412 样单克隆抗体处理源自两个不同个体的血液M小时。用电化学发光定制夹心ELISA测量 PTX3释放。结果示于图8中。准确性为了确定最准确的PTX3ELISA方法，向源自两个人全血供体的血浆加入覆盖 0-2500pg/ml范围的增加的重组人PTX3浓度。随后通过ECL对比色ELISA测量PTX3信号。通过ECL方法测量时，加入浓度10_2500pg/ml的PTX3重获范围对一个供体是 12-1365pg/ml，并对第二个供体是 16-2104(表 1)。当用PTX3比色测试法测量相同样品时(表1)，数值在355_6464pg/ml的范围。总之，发现用ECL ELISA技术测量肝素化人血浆中PTX3重获更准确。因此，选择 这一方法用于进一步在目前研究中PTX3的测量。基体效应(Matrix effect)为了确定基体在何种程度上干扰PTX3检测，在肝素或EDTA抗凝剂处理的两个供 体的血液产生的血浆中稀释PTX3标准品。将重获的PTX3浓度与从刻度器稀释液中获得的标准曲线浓度对比。用ECL测试法，贯穿10-2500ng/ml重获的PTX3的总体百分数是在肝素化血浆中 85 士 13%和在EDTA血浆中在4000%以上(表2)。如提供者所述，比色测试法不适宜于肝素化血液的测量。灵敏度分析源自25个健康血液供体的样品以确定对于PTX3端点的检测下限 (LLOD)和定量下限(LLOQ)(IUPAC Technical Report)Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis, Pure and Applied Chemistry (2002) 74 :835-855)。发现PTX3 测量的 LLOD 是 0. 065ng/ml 和 LLOQ 是 0. 466ng/ml (表 3)。这与由人 PTX3检测组抗体的供货商提供的数值一致，对于ELISA应用75pg/ml的LL0D。由于根据间接体内PTX3分析认为仅仅在2-lOOOng/ml范围的PTX3的值相关，这 一测试法关于其灵敏度能胜任测量人血液中PTX3水平的有意义的改变。CDllb的流式细胞分析依赖于与全血中细胞的全部细胞组相关的细胞亚群的检 测，对于其容易用流式细胞分析的标准设置为< 1.0%的灵敏度。由于认为仅仅大于30% CDllb+中性白细胞的分割点的值对于风险评价相关，认为流式细胞分析的灵敏度是适当 的。PTX3应答的动态范围和动力学关于PTX3分析，ECL PTX3 ELISA测试法的标准曲线的线性范围典型地在 0. 6-2500ng/ml的范围。这一范围覆盖在临床试验中源自患者间接体内的血液中观察到的 PTX3 值的全部范围或贯穿几个指征(Bottazzi B, Garlanda C, Salvatori G, Jeannin P, Manfredi A, Mantovani A. Pentraxins as a key component of innate immunity. Curr Opin Immunol(2006) 18 :10-15 ；Latini R. ,Maggioni A. P. ,Peri G. ,Gonzini L,Lucci D, Mocarelli P, Vago L, Pasqualini F, Signorini S, Soldateschi D, Tarli L, Schweiger C, Fresco C, Cecere R, Tognoni G, Mantovani A ；Lipid Assessment Trial Italian Network (LATIN)Investigators. Prognostic significance of the long pentraxin PTX3 in acute myocardial infarction. Circulation(2004) 110 :2349-2354 ；Muller B, Peri G, Doni A, Torri V, Landmann R, Bottazzi B, Mantovani A.Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlate with severity of infection in critically ill patients, Crit Care Med. (2001)四1404-1407)，且在败血症和内毒素性休克期间在6_8 小时报道的患者血液中PTX3的峰值在200-800ng/ml的范围。在我们的分析中PTX3释放随着药物浓度和孵育时间的增加而增加，不会达到停 滞状态。不像细胞因子和其峰贯穿应用的药物浓度的⑶lib值。尽管TNF-α和IFN-γ分 泌随着药物孵育持续时间而加强，在2小时后细胞因子分泌的程度在90%的试验的供体中 足以达到60pg/ml阈值。在全血中0.01-200 μ g/ml MabCampath 攻击2小时后从10个健康供体得 到 22-88ng/ml 的 PTX3 最大值(图 6C)。应答LPS 0. 001-100ng/ml的PTX3释放的动态范围轻微地更宽，对于5个健康试 验个体在22-91pg/ml的范围(图6C)。
在用于确定CDllb+中性白细胞亚群的流式细胞测定法中，对于活化中性白细胞 的指示，动态范围位于1-100%的间隔。实际在中性白细胞活化评价中得到的值典型地在 3-97%⑶lib+中性白细胞的范围(图3、表5)。对于TNF- α分析，MSD试验的标准曲线的线性部分典型地在10_10000pg/ ml的范围，覆盖在临床试验中间接体内患者血液中报道的或售后药品注入引起CRS的 TNF- α {^^^ηΡ Ε (Moreau T Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis.Brain. 119(1996) :225-37; Moreau T 等’ Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. Brain. 119(1996) :225-37 ；Winkler U 等， Cytokine-release syndrome in patients with B—cell chronic lymphocyticleukemia and high lymphocyte counts after treatment with an anti_CD20 monoclonal antibody(Rituximab, IDEC-C2B8) · Blood. 94(1999) :2217-24)。与此一致，贯穿4小时的MabCampath 攻击，从9个健康供体全血中获得 64-690pg/ml TNF-α释放的峰值。对于一个供体，2小时时的细胞因子水平低，且TNF-α 释放未达到60pg/ml阈(图3、4和5)。IFN- γ峰值观察到更高的范围，具有12_1904pg/ml 浓度(图4)。特异性在两个水平上建立全血测试法的特异性(i)供体-特异性应答和(ii)药物特异 性应答。在单克隆抗体MabCampath 和Orthoclone OKT3 存在下通过细胞因子和 CDiib分析说明供体特异性关于应答MabCampath 的TNF-α和ifn-γ分泌供体2 为阳性。相反，关于TNF-α和IFN-Y的诱导供体1不应答MabCampath (图3、表 5)。在PTX3测量中也观察到供体差异，动态研究中对于供体1的35ng/ml的基线值比较对 于供体3、4和5的3-5ng/ml的基线值(图4和5)。这一测试法也证实了宣称的药物特异性单克隆抗体MabCampath 在供体3 中诱导TNF-α和IFN-γ释放，而单克隆抗体Orthoclone OKT3 不诱导(表5)。相反的趋 势对于供体1是确实的，该供体强烈地应答单克隆抗体Orthoclone OKT3 ，诱导TNF- a 和IFN- γ，而在单克隆抗体MabCampath 攻击后分泌非常低量的细胞因子(表5)。变异系数浓度和供体间精密度为了评价在何种程度上变异系数(CV)依赖于各个抗体的浓度或供体的选择，用 单克隆抗体MabCampath 在5个不同的浓度试验源自10个个体的血液样品，且将在 MabCampath 的各个浓度用ι个供体的样品得到的CV值与其他9个供体的CV值比 较。另外，计算贯穿浓度的全部CV值的平均值和SD并确定每一组的最小CV(CVmin)和最 大 CV (CVmax)值(表 4)。ΡΤΧ3 的 CV 值分析显示 1. 6-2. 5% 的 CVmin 值和 13. 4-23. 5% 的 CVmax 值(表 4)， 平均CV值在浓度间显示非常低的变异(5. 1-9. 8%)0除了在浓度曲线的较低末端，用⑶lib上调测试法发现CV值更宽的分布(CVmin
151. 0-8. 6%, CVmax 4. 7-42. 0%，平均 CV :2. 5-19. 9% )(表 4)。总之，在供体和浓度间PTX3 CV值适度地变化并不显示与药物浓度任何的相互关 系。在源自不同供体的样品间观察到的CV值也没有显著的改变。阈估算为了评价阈，在WBA中PTX3释放在阈以上可认为显著阳性，我们确定在阴性对照 单克隆抗体Synagis 存在下2小时后测量的PTX3应答的平均值+2SD的值。贯穿这一研 究的全部的浓度和全部的10个供体，这一分割点值对应于25ng/ml (表6)。因此，基于目前的结果，我们建议2小时时25士5ng/ml的PTX3浓度可用作区别在 WBA中阳性和阴性应答的阈。在这样的条件下，全部的供体1-5在与单克隆抗体MabCampath 以及在 与Orthoclone OKT3 孵育2小时后，他们的应答将认为阳性。有趣地是，用单克隆抗 体MabCampath 的供体 I 对于 TNF-α (64士 15pg/ml)和 PTX3 (22. 7士3. 5ng/ml)释 放恰好达到阈。另外，将PTX3应答与细胞因子分泌相关地定性供体4是用单克隆抗体 MabCampath 为阳性，而⑶lib上调在30%阈以下(表5)。此外，供体3如所期
待的那样，以细胞因子分泌来说的话不对Synagis 应答，也在PTX3释放方面呈现阴性 (13. 99士0. 6ng/ml)。相反，然后认为动态研究的供体1是独立于药物暴露的PTX3阳性，这 仅因为其高PTX3基线水平(用Synagis O. 5小时时36. 45士2. Olng/ml)。总之，在2小时后血浆中达到PTX3水平> 25ng/ml PTX3的样品可认为对于临床 相关细胞因子释放的风险为“阳性”。与涉及外周血细胞(PBMC)亚群以评价中性白细胞活化程度的CDllb测试比较，基 于ECL ELISA定制技术的PTX3测量呈现出具有下面的优点·肝素化血浆在体内是相关的隔室·避免稀释步骤和加入Ficoll (对于PBMC制备必需)·全套细胞的存在，包括全血中的中性白细胞和嗜酸性粒细胞·单(ECL)而不是双(ELISA和FACS)测试形式·当在体内观察到典型的细胞因子释放综合征症状时，在2小时的相关时间框内 评价表表1 准确性.作为PTX3的检测方法，比较了增强的化学发光(ECL) ELISA (表la) 和比色测试法(表lb)。用源自两个供体的包含肝素或EDTA抗凝剂的血浆进行测量。向源 自两个人全血捐赠的血浆加入覆盖0-2500pg/ml范围的浓度提高的重组人PTX3。# 源自 一式三份的平均值，n. e.不可评价表 la)加入的PTX3 浓度(ng/ml)血浆中重获的PTX3(ng/ml)，通过ECL ELISA测试法肝素' 匕血液EDTA血液供体α供体β供中α供利平均值#SD平均值"SD平均值#SD平均值#SD25001365.3716.662104.44266.647737.86245.149133.14260.65625382.1819.49636.3136.547513.31167.498897.3899.6915688.781.17186.018.076749.16109.708117.6877,073925.450.6754.166.843669.54125.205739.99216.999.812.413.2716.661.271144.2291.471058.4957.792.411.2516.667.28266.64281.20245.14168.54260.65表lb)
加入的 ΡΤΧ3浓度 (ng/ml)血浆中重获的PTX3(ng/ml)，通过比色测试法肝素4匕血液EDTA血液供体α供体P供剩、a供吻平均值#SD平均值#SD平均值#SD平均值 #SD2500n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.625n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.n.e.1561.690.042.710.29n.e.n.e.n.e.n.e.390.630.020.970.06n.e.n.e.n.e.n.e.9.80.360.050.400.01n.e.n.e.n.e.n.e.2.40.170.050.250.092.620.022.130,03表2:基体效应。作为PTX3的检测方法，比较了增强的化学发光(ECL)ELISA(表 2a)和比色测试法(表2b)。对肝素或EDTA抗凝剂的两个供体的血液产生的血浆进行了测量。^t 2a)
1权利要求
1.用于评价目标化合物的免疫原性的体外方法，包括以下步骤a)提供全血样品，其中所述血液暴露于所述化合物，b)测量所述样品中五聚环蛋白-3的水平，和c)将五聚环蛋白-3的测量水平与对照进行比较。
2.根据权利要求1的方法，其中在获自全血样品的血浆或血清中测量PTX-3水平。
3.根据权利要求1或2的方法，其中全血包含抗凝剂。
4.根据权利要求2的方法，其中血浆包含抗凝剂。
5.根据权利要求3或4的方法，其中抗凝剂是肝素。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中全血样品与目标化合物的孵育在采集 血液样品后4小时内开始。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中全血样品与目标化合物孵育30分钟至 24小时。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中用增强的化学发光ELISA测量五聚环 蛋白-3的水平。
9.PTX-3的用途，用于确定目标化合物在人类中诱导细胞因子释放综合征的危险。
10.基本上如本文前面所述的尤其是参考上述实施例的方法和用途。
全文摘要
本发明涉及体外评价目标化合物的免疫原性的方法，包括如下步骤a)提供全血样品，其中所述血液暴露于所述目标化合物，b)在所述样品中测量五聚环蛋白-3的水平，和c)将五聚环蛋白-3的测量水平与对照进行比较。
文档编号G01N33/68GK102066944SQ200980123206
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月10日 优先权日2008年6月20日
发明者A·沃格特, C·普罗伊科斯, H·克劳勃绍佛 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司