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专利名称：硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方 法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人体 过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护细胞 膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免疫功能， 可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法如原子吸收光
谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法 (ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微 量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)鉴 定硒化合物。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用硒依赖性的酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，
计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nrn波长处吸光度的 变化，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒 诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到 切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢 过氧化氢+ 二氧化碳+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶
丙酮酸+辅酶八+氧 丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+
乙酰辅酶八+还原型辅酶 这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase; EC 1.11.1.9)酶(偶)联(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC1.2丄51)酶促反应速率比色法/终点法。谷胱甘肽过氧化 物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、 丙酮酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原 型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光 度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算 硒的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较为
理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶
丙酮酸氧化酶
丙酮酸脱氢酶
谷胱甘肽二硫
二氧化碳
乙酰辅酶A
辅酶A
3 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 10 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L
二氧化碳可以是任何碳酸氢盐，如碳酸氢钠。
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮
酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、 辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、 辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。
辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽 二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置 可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定硒浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂500 mmol/L
f. 1、. TT" 辅酶3 mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000U/L
丙酮酸脱氢酶12000U/L
谷胱甘肽二硫10 mmol/L
二氧化碳2 mmol/L
乙酰辅酶A2 mmol/L
辅酶A2 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37r，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂的体积 比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右， 检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大 小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmd/L稳定剂
谷胱甘肽二硫 二氧化碳 乙酰辅酶A 辅酶A
50 mmol/L 3 mmol/L
10 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/TL 2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
谷胱甘肽过氧化物酶
500 mmol/L
10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
丙酮酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光度 《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、试 剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
谷胱甘肽二硫 二氧化碳
乙酰辅酶A
辅酶A
试剂2
稳定剂
丙酮酸氧化酶 丙酮酸脱氢酶
试剂3
稳定剂
谷胱甘肽过氧化物酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体:
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L
500 mmol/L 10000U/L
:试剂，可以直接使用,
测定硒浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间10 分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒 样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上 升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
ii加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析
仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本 发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0010;吸 光度时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达 0.5 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土5 %;试剂测试的 精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.056 ± 0.028 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
权利要求
1. 一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法的硒的浓度测定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽过氧化物酶/Se</u>2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+二氧化碳+乙酰辅酶A <u>丙酮酸氧化酶</u>丙酮酸+辅酶A+氧丙酮酸+辅酶A+辅酶 <u>丙酮酸脱氢酶</u> 二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出硒的浓度大小测定结果。
2. —种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 稳定剂 谷胱甘肽过氧化物酶丙酮酸氧化酶丙酮酸脱氢酶谷胱甘肽二硫二氧化碳乙酰辅酶A辅酶A 1"——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此 范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。二氧化碳可以是任何碳酸氢盐。
3. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸 脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮 酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A组成双剂试 齐lj;试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰 辅酶A、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物 酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、 丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、 辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮 酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A组成多剂试 齐!J;试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰 辅酶A、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙 酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂l~4000mmol/L或0.1°/。-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷胱甘肽二硫、二氧化碳、乙酰辅酶A、辅酶A、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464337SQ200710192130
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司