专利名称：一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物细菌学与动物传染病学技术领域。具体地说，是一种借助胶体金 标记显色的免疫层析反应，快速、鉴别检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术：
牛结核病是一种由牛分枝杆菌引起的慢性消耗性人兽共患病，被国际动物卫生组 织(OIE)定的必须通报的疾病之一。2001年和2002年的部分统计结果表明我国个别省市 奶牛结核病阳性率高达10%以上。牛结核病的防制措施是“检疫-扑杀”，即采用牛提纯结 核菌素(PPD)变态反应进行检疫，对检出的阳性牛进行扑杀。皮内变态反应的基本过程是 剃毛、量皮厚、注射结核菌素、72小时后再量皮厚。该方法具有较多缺陷，如牛结核菌素成 分复杂，与环境分枝杆菌和卡介苗具有共同成份而使变态反应出现非特异性反应；感染后 期的敏感性降低；结果判断主观性强；操作复杂，劳动强度大，需要时间长等，这些均使我 国“检疫-扑杀”政策的实施效果大打折扣；此外，皮试反应只能进行活体现场检测，不能 保存样品并进行回顾性分析。除牛外，其它动物的皮试反应未进行过标准化。野生动物因 为难以捕捉，很难进行皮试反应。因此，临床上需要一种适合于不同动物、操作简便、能鉴别 卡介苗免疫和环境分枝杆菌感染的灵敏特异的检测方法。胶体金试纸条就是一种被认为适 合于“栏圈旁”检测的简易方法。该方法是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析 方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫 标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技 术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析 快速检测试纸条。由于牛结核感染过程中抗体产生较晚，且不同时期出现针对不同蛋白的抗体，因 此，针对单个蛋白设计的抗体检测方法虽然简便但灵敏度不高。各个科学家都在通过同时 应用多种诊断抗原以提高灵敏度，这种方法被称为“鸡尾酒”法(Siguo Liu, Sheping Guo, Chunlai Wang, Meili Shao, Xiuhua Zhang, YangGuo and Qiang Gong. A novel fusion protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay forthe detection of bovine tuberculosis. Tuberculosis, 2006, 3 ；C. Aagaard, Μ. Govaerts, V. Meikle, A. J. Vallecillo, J. A. Gutierrez-Pabello, F. Suarez-Giiemes, [J]. McNair, A. Cataldi, C. Espitia, P.Andersen, and J.M. Pollock, Optimizing Antigen Cocktails for Detection of Mycobacterium bovisin Herds with Different Prevalences of Bovine Tuberculosis :ESAT6_CFP10 Mixture Shows OptimalSensitivity and Specificity, [J],Clin Microbiol,2006,44(12) 4326-4335 ；Cockle PJ, GordonSV, Hewinson RG, Vordermeier HM. Field evaluation of a novel differential diagnostic reagentfor detection of Mycobacterium bovis in cattle[J]. Clin Vaccine Immunol,2006, 13(10) 1119-1124 ； Kanaujia GV, Garcia MA, Bouley DM, et al. Detection of earlysecretory antigenic target-6 antibodyfor diagnosis of tuberculosis in non-human primates [J], Comp Med 2003,53(6) =602-606) 本课题组前期研究中，进行了多种牛分枝 杆菌特异性抗原蛋白的融合表达，最后发现，RV3872、CFP10、ESAT6的融合蛋白作用牛结核 诊断抗原具有灵敏度高、特异性好、可区别卡介苗免疫与非结核分枝杆菌的干扰。Rv3872和CFP10及ESAT6蛋白同属牛分枝杆菌的差异基因区(RDl区)，是 ESAT6-CFP10复合体转运系统中的关键因子，敲除Rv3872会中止复合体的合成与分泌， 可能参与了复合体的合成、分泌过程(Priscille Brodin, Laleh Majlessi, Laurent Marsollier, Marien I. de Jonge, Daria Bottai, Caroline Demangel, Jason Hinds, Olivier Neyrolles, Philip D. Butcher, Claude Leclerc, Stewart T.Cole, and Roland Brosch, Dissection of ESAT—6 System 1 of Mycobacterium tuberculosis and Impact on Immunogenicity and Virulence. Infection and Immunity,2006,74(1) :88_98)。有 研究证明结核分枝杆菌的Rv3872能诱导结核病人产生显著的抗体反应(P.Mukherjee， Μ. Dutta, P. Datta, A. Dasgupta, R. Pradhan, Μ. Pradhan, Μ. Kundu, J. Basu andP. Chakrabarti, The RDl-encoded antigen Rv3872 of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate forserodiagnosis of tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection, 2007，13 (2) 146-152)，鉴于牛分枝杆菌与结核分枝杆菌在基因组水平上 有99. 95%的同源性，提示该蛋白可能具有应用于牛结核血清学诊断的潜力。申请者的前期工作即授权专利(专利号ZL 2006101665510 ；发明名称检测牛结 核抗体的免疫胶体金试纸条，授权公告日2009年6月3日)也是一种牛结核抗体检测方 法，但该方法不具备鉴别诊断功能，不能区分卡介苗和非结核分枝杆菌感染，而本发明是针 对毒力型牛分枝杆菌的特异性早期分泌蛋白设计的免疫胶体金试纸条，除了具上已授权专 利的灵敏度与特异性外，还具有鉴别诊断的新功能。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种一种应用Rv3872新型融合蛋白 制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条，该试纸条适合于早期鉴别诊断，具有特异性强、灵敏度 高，操作简便，检测快速、准确的特点，专门用于检测牛结核病的抗体的免疫层次试纸条，为 我国牛结核病防制提供一种新型试剂盒和新方法。鉴于以上三种牛分支杆菌特异性分泌蛋白的Rv3872、CFP10和ESAT6的特性，以及 现阶段牛结核诊断方法研究现状，本发明以牛分支杆菌全基因组为模板克隆了 Rv3872(基 因登录号NC 002945)、CFP10基因(基因登录NC 002945)和ESAT6基因(基因登录号 NC002945)，并构建了三种基因融合表达的原核表达载体，在大肠杆菌中表达。在所述的每 种蛋白(Rv3872、CFP10和ESAT6)之间加入了连接序列以最大限度地保证融合蛋白中各个 蛋白的空间构像和活性不受影响(见图8)。对纯化的Rv3872-CFP10-ESAT6融合蛋白活性 进行了鉴定和ELISA初步验证(刘冬光，郭爱珍等，融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制 备及在牛结核诊断中的初步应用，中国奶牛，2009(10) :7-11)，表明上述三蛋白融合抗原的 牛结核抗体检出率显著高于由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室自行克隆表达 的CFP10-ESAT6 二蛋白融合抗原(张桂荣、郭爱珍等，间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法 的建立及初步应用.中国预防兽医学报，2007,29(29) :555_560 ；张书环、郭爱珍等，牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析.中国人兽共患病学 报，2007,23(12) :1238-1242)，因此，本发明应用新型融合蛋白制备成牛结核抗体鉴别诊断 胶体金免疫层析试纸条，证实该产品具有简便、灵敏、特异等优点，为牛结核病的快速鉴别 诊断提供了更加有效的工具。本发明总体技术路线如附图1所示。本发明通过以下技术方案实现一种牛结核抗体的检测试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和 PVC背衬。在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、 吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有保藏号为CCTCC NO :M208244的重组大肠杆菌所表 达的Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白与胶体金的标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被 有Rv3872-CFP10-ESAT6蛋白的检测线(5)、抗Rv3872-CFP10_ESAT6蛋白IgG构成的质控线 (6)；其中，RV3872-CFP10-ESAT6蛋白是以牛分支杆菌全基因组为模板克隆Rv3872、 CFPlO和ESAT6基因，并构建三种基因融合表达的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达得 到。一种适用于检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括1)克隆牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE基因并在重组大肠杆菌中表达，表达牛分 枝杆菌RCE蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET_28a-RCE，该重组大肠杆 菌已于2008年12月4日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏号为 CCTCC NO :M208244。2)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；3)将RCE蛋白加入步骤2)制备的胶体金中，得到RCE蛋白-胶体金标记物；4)将得到RCE蛋白-胶体金标记物包被在结合垫(3)上；5)将步骤1)表达纯化RCE蛋白包被在硝酸纤维素膜(4)上构成检测线(5)；并将 纯化RCE蛋白的IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；6)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、结合垫(3)、硝酸 纤维素膜(4)、吸水垫(7)，得到所述的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条、将试纸条装 到专门的透明外壳(9)中、血清稀释液(8)专指用于该检测试纸条血清样本稀释的溶液。本发明选用牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE作为检测线，牛分枝杆菌特异性分泌 蛋白RCE作为胶体金标记物，利用间接法来检测待测血清样品中是否含有RCE抗体。当待 检样品中为牛结核抗体阳性时，血清RCE抗体与RCE蛋白-胶体金标记物结合之后，在检测 线处遇到RCE抗原就会出现颜色深浅不同的红色条带，质控线处出现红色条带，表示阳性 反应(二条带)。否则只有质控线处出现红色条带(一条带)，表示阴性反应。本检测试纸条(如附图2所示结构图)由样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜 (4)、吸水垫(7)按图示的顺序依次粘附在PVC背衬(1)上组装而成的。结合垫上包被有 本发明制备的RCE蛋白-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)， 其中检测线为本发明制备的牛分枝杆菌特异抗原蛋白RCE，质控线为本发明制备的提纯抗 RCE蛋白IgG。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公 司ο
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点1、与专利号ZL 2006101665510的授权专利比较，本发明具有鉴别和检测双重功 能，可区分卡介苗和非结核分枝杆菌，同时具有早期检测功能。2、本发明具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(5-10分钟)的特点。3、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。4、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。5、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在2 8°C下有效保存期可达 两年。
SEQ ID NO=I是牛分枝杆菌特异性融合抗原蛋白的核苷酸序列表图1 本发明的总体技术路线2 本发明检测试纸条的组装示意中1为PVC背衬，2为样品垫，3为结合垫，4为硝酸纤维素膜，5为检测线，6为 质控线，7吸收垫图3 本发明检测试纸条结果判定示意中A 为阳性标准品结果，B 为阳性样品结果，C 为阴性样品结果，D、E 为试纸 条失效。图4:本发明检测试纸条结果判定中A 为阳性结果，D 为阴性样品结果，B和C 为试纸条失效。图5 :PET-28a(+)原始质粒载体物理图谱。图6 是本发明PCR扩增Rv3872电泳图谱；图中M为DL2000 ；1为阴性对照；2为 扩增后得到的321bp的Rv3872片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。图7 为PCR扩增CFPlO和ESAT6电泳图谱。图中M为DL2000 ；1,3为阴性对照； 2为348bp的CFPlO目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度；4为341bp的 ESAT6目的片段，其中包括酶切位点和连接序列(Linker)长度。图8 是本发明中三基因融合重组原核表达载体 pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6(即 pET_28a_RCE)构建流程图。图9:是本发明中所构建包含CFP10-ESAT6融合基因的中间质粒 pET-28a-CFP10-ESAT6(即 pET_28a_CE)的图谱。图10 是本发明中所构建包含Rv3872-CFP10_ESAT6三基因的重组表达载体质粒 pET-28a-Rv3872-CFP10-ESAT6 (即 pET_28a_RCE)的图谱。图11 是本发明中重组中间融合基因CFP10-ESAT6PCR扩增后的电泳图谱。图中 M为DL2000 ；1为扩增后643bp的CFP10-ESAT6融合基因片段(包括连接序列和两端酶切 位点)；2为阴性空白对照。图12 是重组中间融合质粒pET-28a-CFP10-ESAT6构建后酶切鉴定电泳图谱。 图中Ml 为 DL2000 ；M2 为 DL15000 ；1 为 HindIII 和 NotI 双酶切 pET-28a-CFP10_ESAT6 质�：蟪鱿�5363bp和636bp左右的两个片段；2，3为NotI和HindIII分别单酶切 pET-28a-CFP10-ESAT6质粒出现5999bp左右的片段。图13:是本发明中制备的RCE蛋白表达形式鉴定图谱。图中M为蛋白分子量标准；1为IPTG诱导的空载体对照；2为菌液经IPTG诱导后的情况；3为超声波破碎菌体离心 后上清取样；4为超声波破碎菌体离心后沉淀取样。图14 是本发明中制备的RCE蛋白最佳表达条件。在图12A中M为蛋白分子量标 准；1为0. 8mmol/L IPTG (分子克隆实验指南建议浓度)诱导空载体对照；2为IPTG终浓度 为0. 4mmol/L诱导；3为IPTG终浓度为0. 6mmol/L诱导；4为IPTG终浓度为0. 8mmol/L诱 导；5为IPTG终浓度为1. Ommol/L诱导。在图12B中M为蛋白分子量标准；1为0. 4mmol/ L IPTG 诱导空载体；2 为0. 4mmol/L IPTG 诱导 2h ;3 为 0. 4mmol/L IPTG 诱导 3h;4 为 0. 4mmol/L IPTG 诱导 5h ；5 为 0. 4mmol/L IPTG 诱导 6h。图15 是本发明中制备的RCE蛋白Western-Blot图。图中M为蛋白分子量标准； 1为牛结核阳性血清；2为正常牛血清。图16 是本发明中制备的RCE蛋白浓度测定标准曲线图。图16A和图16B为蛋白 标准品做两次重复分别所得标准曲线及公式。图17 制备好的胶体金电镜照片。图18 牛结核RCE抗体快速检测试纸条。
具体实施例方式实施例1 (制备实施例)(一 )牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE基因的克隆及在重组大肠杆菌中表达并纯 化的方法参见(专利申请号200910060913. 1 ；公开号CN101538578，公告日2009年9月 23日)报道的方法。(二)提纯RCE蛋白的I gG抗体将含有RCE抗体的血清4000r/min离心10分钟取上清用于提纯取IOml上清于 40C，12000r/min离心10分钟，弃杂质，然后加入40ml 0. 06M ρΗ4· 5的醋酸盐缓冲液，再在 室温(25°C )下缓慢加入330 μ 1辛酸，边滴加边搅拌。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为 45%，用0. OlM PBS(ρΗ7. 4)溶解后透析过夜。SDS-PAGE电泳分析(如附图11所示)显示 有两条带，一条为IgG重链，一条为IgG轻链。用紫外分光光度计测定纯化多抗在280nm和 260nm波长时的光吸收值(OD)，按公式1. 45X0D280-0. 74X0D260计算多抗浓度。调整溶 液体积，使其终浓度为2. 5mg/ml。利用该抗体作为质控线。实施例2 (制备实施例)牛分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE抗体诊断试纸条组装及制备方法1、RCE试纸条包括样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(7)和PVC背衬(1)为商购， 其具体结构是在PVC背衬(1)上按顺序依次粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜 (4)、吸水垫(7)；所述的结合垫(3)上包被有MPBrce蛋白-胶体金标记物；所述的硝酸纤 维素膜(4)上分别包被有纯化的RCE蛋白的检测线(5)、纯化RCE蛋白IgG构成的质控线 (6)。2胶体金的制备用超纯水将氯金酸稀释成0. 01%，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每IOOml 0. 01%氯金酸加入2. Oml 柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一年，胶体 金电镜照片如附图17。3RCE蛋白-胶体金标记物制备磁力搅拌下，用0. IM碳酸钾调胶体金的pH值至8. 0，按每ml胶体金加入2. 3 μ L 1. Omg/mL MPBrce蛋白，继续搅拌混勻60min，加入10 % PEG20000至终浓度为1 %，继续搅 拌混勻30min。3500rpm、4°C离心30min，弃沉淀，上清7500rpm、4°C离心30min，弃上清，沉 淀用0. 02M pH8. O的硼酸盐缓冲液(配方硼酸0. 1237g，PEG-200001g，用超纯水定容至 1000ml，调pH至8. 0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0. 02M pH8. 0的硼酸盐缓 冲液(配方硼酸0. 1237g，聚乙二醇(PEG)-200001g，用超纯水定容至1000ml，调pH至8. 0) 将沉淀重悬，置4°C备用，有效期60天。4结合垫的包被将结合垫浸泡于0. OlM pH 7. 4磷酸缓冲液(配方及制备20g牛血清白 蛋白(BSA)，25g 蔗糖，3g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10,0. 2gNaN3 NaCl 8g，KCl 0. 2g， Na2HP04 · 12H20 2. 9g, KH2PO4O. 2g，用超纯水定容至 1000ml)中 30min 后，于 37°C烘干。然 后用Biodot点膜仪将制备好的RCE蛋白-胶体金标记物均勻包被在结合垫上，每厘米结合 垫包被9 μ IMPBrce蛋白-胶体金标记物，冷冻真空干燥，真空封装，置4°C备用。5样品垫的处理将样品垫浸泡于0. OlM pH 7. 4磷酸缓冲液(配方及制备20g BSA，25g蔗糖， 3gPVP-10,0. 2gNaN3 NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, KH2PO4O. 2g，用超纯水定容至 1000ml)中30min后，于37°C烘干，真空封装，置4°C备用。6硝酸纤维素膜的包被用Biodot点膜仪将纯化的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白RCE (浓度为2mg/mL)包 被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0. 6 μ 1/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端 约8mm ；用Biodot点膜仪将纯化的猪IgG抗体(浓度2mg/ml)包被于硝酸纤维素膜作为质 控线，包被量为0.8 μ 1/cm，质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5 8mm。室温干 燥，封装备用。7试纸条的组装将样品垫⑵、结合垫(3)、硝酸纤维素膜⑷、吸水垫(7)按图2所示的顺序依次 粘附在PVC背衬(1)上，切成3mm宽的小条，装到塑料通明外壳(9)中真空封装。2 8°C 保存，有效期2年；常温保存，有效期12个月。实施例3 (应用实施例)牛结核抗体的免疫胶体金试纸条使用方法1、血清样品的预处理血清样品经4000rpm/min离心IOmin去掉血细胞，_20°C长期保存，4°C短期保存。2、检测步骤用吸管吸取40 μ 1待检血清与40 μ 1血清稀释液混合均勻后缓慢滴加在胶体金试 纸条的样品垫上，20分钟后观察结果。3、结果判定如图3所示，若待测样品试纸条检测线颜色明显深于阳性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中有牛结核分枝杆菌特异 性分泌蛋白RCE的抗体，说明该牛为结核病牛；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时 质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中没有牛结核分枝杆菌特异性分泌 蛋白RCE的抗体，说明该牛为结核阴性牛；若待测样品试纸条检测线颜色介于阳性标准品 和阴性标准品试纸条检测线颜色之间，同时质控线上出现红色条带则判断为可疑样品，说 明该牛疑似结核�。蝗绻士叵呱厦挥泻焐醮鱿郑蚋檬灾教跷扌�。实施例4 (应用实施例)本发明的应用效果举例(如附图18)本例中所指的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸检测方法参照实施例3所述的 操作步骤，其检测结果如表1、表2和表3。1、特异性试验按实施例3所述方法进行试验，检测牛结核阳性阳性血清，牛结核阴性血清(按照 常规的PPD皮试、ELISA和病理学和细菌学检验方法操作)、副结核病牛血清、布病牛血清、 弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清(均购自中国兽药监察所)。试验结果表明(见表1)，副 结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清样品检测线无颜色出现，同时 质控线上出现红色条带。本发明试纸条与牛的其他疾病无交叉反应，显示本发明试纸条具 有好的特异性。表1特异性试验 注“ + ”表示阳性，“ _ ”表示阴性。2、敏感性试验按实施例3所述方法进行试验，将200份临床牛血清样品用牛结核病抗体检测试 纸条检测，并且与TST检测做比较。牛结核病抗体检测试纸条与TST的比较(结果见表2)。 TST阳性牛100头，其中试纸条检测判断85头为阳性，阳性符合率为68%。TST阴性牛100 头，其中试纸条检测判断115头为阴性，阴性符合率为83%。总符合率为75. 5%。表2牛结核RCE抗体检测试纸条与TST的比较 用牛分枝杆菌RCE抗体检测胶体金试纸条与韩国进口的牛结核抗体检测胶体金 试纸条同时检测了 240份临床牛血清样品，结果显示本发明的试纸条检测62为阳性，韩国 试纸条阳性牛61头，共同检出60份，其中阳性符合率为97% (59/61)。韩国试纸条阴性牛 179头，其中本研究试纸条检测判断为阴性的有176头，阴性符合率为98% (176/179)。总 符合率为98% (59+176/240)。说明本发明的试纸条与韩国试纸条具有很高的符合率(表 2)。表3本发明的试纸条与同类韩国试纸条的比较 3、临床样品的检测按实施例3所述方法进行试验，对湖北省黄R地区11个牛场的1003份血清进行 检测，结果见表4。检测样品阳性率为7. 00%-65. 00% (见表4)，由此可见牛结核病分布 较广。临床应用证明该试剂盒准确性、重复性、敏感性、特异性良好，适合临床大量血清抗体 检测和疾病诊断，在清除牛结核病传染源和控制牛结核病的临床实践中具有重要的意义。尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限 制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定 的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围 内。表4本发明的牛结核病抗体检测试纸条的临床应用情况
权利要求
一种牛结核抗体的检测试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有保藏号为CCTCC NOM208244的重组大肠杆菌所表达的Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白与胶体金的标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白的检测线(5)、抗Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白IgG构成的质控线(6)；其中，Rv3872 CFP10 ESAT6蛋白是以牛分支杆菌全基因组为模板克隆Rv3872、CFP10和ESAT6基因，构建三种基因融合表达的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达得到。
2.一种表达 Rv3872-CFP10-ESAT6 蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/ pET28a-RCE，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :M208244。
3.权利要求2所述的的重组大肠杆菌在制备牛结核抗体检测试纸条上的应用。
全文摘要
本发明属于动物传染病基因工程技术领域。公开了一种利用RV3872、ESAT6和CFP10三基因融合蛋白制备的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及制备方法与应用。以融合蛋白作为胶体金标记抗原和硝酸纤维素膜上检测区的捕获抗原建立胶体金免疫层析试纸条。本发明试剂条对牛结核抗体的检测具有特异性强和灵敏度高的突出优点，能同时鉴别检测卡介苗免疫和非结核分枝杆菌感染。本发明包括一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-MPBrce，该菌株表达牛分枝杆菌RCE蛋白，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM208244。
文档编号G01N33/532GK101900727SQ20101019473
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者于清龙, 凌洁玉, 刘冬光, 廖娟红, 涂玲玲, 郭爱珍, 陈焕春, 陈颖钰 申请人:华中农业大学
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