专利名称：用于对修饰的肽进行定量的方法
用于对修饰的肽进行定量的方法本发明涉及用于对修饰的肽进行定量的方法，尤其是涉及用于对磷酸化的肽进行定量的方法。此类方法用于例如鉴定和定量蛋白上的磷酸化位点，以及用于定量蛋白激酶的活性。多数蛋白通过添加官能团而以一定方式被修饰，这些修饰可以通过质谱法来检测。可以通过质谱法检测的蛋白修饰包括磷酸化、硝化、糖基化、乙酰化、甲基化和脂化。这些蛋白修饰在细胞中具有多种生物学功能。质谱法(MS)是分析技术，其测定当分子或原子被离子化、蒸气化并被导入能够根据它们的质荷比分离这些离子的仪器时，所形成的离子的质荷比(m/z)。质谱法还包括将分子分解为片段，因此能够测定分子的结构。MS与液相色谱法的物理分离技术的组合被称作液相色谱-质谱法(LC-MS)。在典型的MS程序中，样品被载入MS仪器，存在于该样品中的化合物被离子化，例如，通过电喷射离子化(ESI)或基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)。然后，通过不同形式的质量分析器，例如飞行时间、离子捕获或四极或这些的组合，来计算离子的质荷比。正常细胞的动态平衡由信号传导途径的作用控制，当所述作用被下调时，也引起很多疾�。ò┲�、神经退化、过敏和糖尿病。蛋白和脂激酶是这些途径的主要成员，因此，这些酶代表用于治疗很多疾病的药物靶的最重要的类别之一。已经报道了用于无偏(unbiased)检测酶活性的方法。可以使用化学探针来共价连接酶活性位点中的有反应活性的氨基酸(Blethrow，J. D.等人，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)105，1442-1447Q008))或底物上的有反应活性的氨基酸 (Barglow,K. Τ. &Cravatt,B. F. Nat Methods (自然方法)4，822-827 Q007))。将连接于探针的蛋白亲和纯化并通过质谱法测定它们的性质。该方法可以检测活性和底物，但是其需要大量的细胞，并且所提供的信息仅为定性的。作为更加定量化的方法，已知为特定激酶的底物的蛋白上的磷酸化位点的定量是激酶活性的度量。当使用质谱作为读出来执行时，该方法允许在单一实验中定量数百至数千个磷酸化位点。例如，使用以稳定同位素进行的代谢标记(SILAC方法)，可以定量以EGF 处理HeLa细胞之后显示出改变的表达水平的大于2000个磷酸化位点(Olsen，J. V.等人， Cell (细胞)127,635-648 (2006))。然而，由于细胞需要保持代谢活性以引入标记的氨基酸，所以该方法不能用作一般性工具来定量原代组织中的信号传导，并且其低通量限制了其有用性。使用同位素标记的内部标准肽来测定磷酸化的肽可以是替代方式(Gerber， S. Α.等人，Proc Nat/Acad Sci U S A (美国国家科学院学报)100，6940-6945 (2003))，但是，虽然在理论上是可能的，但是在实际中不可能合成数以千计的以稳定同位素标记的磷酸化的肽以用作内部标准。iTRAQ试剂可用于以稳定同位素化学地标记肽(Ross，P.L.；等人，Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)2004，3，(12)，1154-69.)。该技术可用于肽、包括修饰肽的相对定量。其局限性在于可以被比较的样品数受到同位素标记物数目的限制，对于获得数据的统计学验证，这对其有用性增加了限制。在临床环境中，化学标记也是不实际的，可能在化学反应步骤弓I入差异性。因此，本领域需要可用于无偏、全面且精确地测定原代组织中的信号传导的方法。本发明人发明了改进的用于定量修饰的肽尤其是磷酸化的肽的方法。该方法包括产生修饰的肽的数据库和将该数据库与获自生物样品的数据进行比较，通常使用计算机程序进行。在第一方面，本发明提供了用于定量样品中的修饰肽的方法，该方法包括(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)中获得的肽中，以产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MQ以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库i)从样品中获得肽；ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和ν)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。本发明提供了用于定量样品中的修饰肽的方法。本发明的方法适合于定量含有可通过质谱检测的任何修饰的肽。本发明的方法用于定量源自较长的蛋白的修饰肽。本发明的方法可用于同时定量数以千计的修饰肽。本发明的方法特别适合于定量样品中的磷酸化的肽，因此，在一个实施方式中，所述修饰肽是磷酸化的肽。在本发明的该实施方式中，术语“磷蛋白(phosphoprotein) ”本文中用于指磷酸化的蛋白，术语“磷酸肽(phosphop印tide) ”在本文中用于指磷酸化的肽。本发明的方法还用于定量通过例如乙酰化、硝化、糖基化、甲基化和/或脂化修饰的肽。本发明的方法用于定量任意含有肽的样品中的修饰肽。所述样品通常是生物样品，因此可以是获自生物来源的任何类型的样品，例如，获自人、动物、植物或细菌的样品。 因此，本发明包括使用获自人和非人来源的样品。本发明的方法用于检测和定量来自任何目标物种的样品的修饰肽。通常而言，本发明的方法用于分析来自人或动物的样品。所述动物通常是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、 豚鼠、母牛、绵羊或山羊。所述动物备选为鸟类例如鸡，鱼类例如斑马鱼，线虫类例如蠕虫，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，或昆虫例如果蝇，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。本发明的方法也可用于分析来自其它生命形式例如细菌和酵母的样品。本发明的方法可用于分析来自在实验上具有重要意义的细菌物种的样品，所述细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或酵母，例如面包酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母，粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。本发明的方法也可用于分析来自植物或真菌或病毒的样
P
ΡΠ O通常而言，生物样品源自人，并且可以是例如体液样品，例如尿或血液，或其它组织。通常而言，生物样品是细胞系或组织，通常是原代组织。例如，样品可以是来自人或动物的组织。人或动物可以是健康的或患病的。在本发明的一些实施方式中，在进行本发明的方法之前，以测试底物处理样品本身或该样品所获自的生物。因此，在该实施方式中，在细胞系或组织上进行本发明的方法之前，以测试底物处理细胞系或组织所获自的生物。所述测试底物通常是外源化学品或药物， 例如小分子抑制剂、RNAi、治疗肽和抗体。本发明的该实施方式允许研究测试底物对于肽修饰的效应。例如，在一个实施方式中，当本发明的方法用于定量磷酸化的肽时，可以在实施本发明的方法之前，以途径激动剂和/或激酶抑制剂处理细胞系。典型的激酶抑制剂包括 PI3K的抑制剂，例如渥曼青霉素和PI-103，如实施例中所使用。至少有80种激酶抑制剂处于临床开发的不同阶段Chang，J.；等人，Nat Rev Cancer (自然综述癌症)2009，9，(1)， 28-39.)。该技术也用于研究怀疑对激酶途径具有效应的其它类型的抑制剂，例如HSP90抑制剂，磷酸酶抑制剂和抗体药物。本发明的方法的步骤(a)包括从样品中获得肽。可以使用本领域已知的任何适宜方法从样品中获得肽。在一个实施方式中，本发明的方法的步骤(a)包括(1)裂解样品中的细胞；(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和(3)将所述蛋白切割为肽。在本发明的该实施方式的步骤(1)中，将样品中的细胞裂解或裂开。可以使用本领域已知的任何适宜方法来裂解细胞，例如使用物理方法，例如机械裂解(例如使用 Waring搅拌器)、液体勻浆、超声或人工裂解(例如使用杵和钵)或基于去污剂的方法，例如CHAPS或Triton-X。通常而言，使用变性缓冲液例如基于脲的缓冲液来裂解细胞。在本发明的该实施方式的步骤O)中，从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白。换言之，从裂解的细胞的其它成分中分离蛋白。在本发明的该实施方式的步骤(3)中，将来自裂解的细胞的蛋白切割为肽。换言之，将蛋白分解为较短的肽。蛋白分解也通常被称作消化。在本发明中可以使用本领域已知的任何适宜的试剂进行蛋白的切割。通常使用蛋白酶进行蛋白切割或消化。本发明中可以使用任何适宜的蛋白酶。在本发明中，蛋白酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C，胃蛋白酶，V8，Lys-C, Asp-C和/或 AspN。备选地，可以例如使用羟胺、甲酸、溴化氰、BNPS-粪臭素，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸 (NTCB)或任何其它适宜的试剂化学地切割蛋白。用于本发明中并且通常按照如上所述的步骤(3)通过蛋白切割或消化而产生的肽适合用于质谱分析中。通常而言，此类肽的长度为大约5至30个氨基酸，例如7至25个氨基酸，10至20个氨基酸，12至18个氨基酸，或14至16个氨基酸。然而，也可以使用更短和更长的肽，例如大约2至大约50，例如大约3至大约40，或大约4至大约45个氨基酸。 可以被分析的肽的长度受到质谱仪对此类长肽进行测序的能力的限制。在一些情况下，可以分析长达300个氨基酸的多肽。在本发明的方法的步骤(b)中，将参考修饰肽加入到获自样品的肽中以产生肽与参考修饰肽的混合物。因此步骤(b)产生一个肽混合物(包括修饰的肽)/样品。参考修饰肽在本文中也被称作“内部标准”(ISs)。通常而言，加入5至10，例如6至9，或7至8个参考修饰肽。在本发明中，参考修饰肽通常是参考磷酸化的肽。此类参考磷酸化的肽通常源自确定性质和浓度的参考蛋白，经常被称作内部标准(1 蛋白。1 可以是商业上可获得的蛋白，例如酪蛋白。备选地，特别针对用于本发明而合成ISs。在本发明的该实施方式中，通常按照与需要定量的一些磷酸化的肽相同的序列来合成参考磷酸化的肽，但是在碳和氮的稳定的重同位素中富集。通常使用固相合成化学法合成肽，其中一次添加一个氨基酸以形成氨基酸链或多肽。通常而言，在替代常规的1的1中富集此类肽。该富集引起参考磷酸化的肽比具有相同序列的内源性磷酸化的肽更重大约6-10道尔顿，从而可以使用质谱法区分它们。在本发明的另一个实施方式中，当本发明的方法用于定量乙酰化肽，参考修饰肽是参考乙酰化肽。此类参考乙酰化肽通常是含有乙酰化氨基酸的合成肽。通常以已知的量在每个待比较的样品中添加参考修饰肽。在下游分析中，针对参考修饰肽的信号标准化内源性修饰肽的信号。在一个实施方式中，本发明的步骤(b)还包括从获自步骤(b)的肽与参考修饰肽的混合物富集修饰肽，以产生富集的修饰肽的混合物。因此，该另外的步骤产生富集的修饰肽的单一混合物/样品。因此，在本发明的该实施方式中，步骤(C)包括在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MQ，以获得与样品中的肽相关的数据。在本发明的该实施方式中， 步骤(b)通常产生富集的磷酸化的肽的混合物。通常使用色谱法进行富集修饰肽的步骤。在一个实施方式中，色谱是固定的金属离子亲和色谱(IMAC)，二氧化钛(TiO2)色谱，和/或二氧化锆(ZrO2)色谱。通常而言，色谱是IMAC和TiA色谱。备选地，使用基于抗体的方法进行富集修饰肽的步骤。在本发明的一个实施方式中，当被定量的肽是磷酸化的肽时，将具有针对磷酸化氨基酸例如酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸或组氨酸的亲和性的抗体连接(固定)于固体基质。通过这些抗体特异性结合磷酸化的肽的能力来富集磷酸化的肽。然后洗掉非磷酸化的肽，而磷酸化的肽保留在抗体包被的基质上。通常使用低PH溶剂或通过任何其它合适的使抗体与磷酸化的肽之间的相互作用变性的方法将磷酸化的肽从固定的抗体上洗脱。在本发明的另一个实施方式中，当被定量的肽是乙酰化肽时，通过使用针对乙酰化氨基酸残基的特定抗体来富集乙酰化肽。将此类抗体连接于固体基质，然后通过抗体特异性结合乙酰化氨基酸残基的能力来富集。然后洗掉非乙酰化肽，而乙酰化肽保留在固定的抗体上。
在本发明的方法的步骤(C)中，在获自步骤(b)的肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据。通常而言，该数据的形式为针对样品的MS 数据文件。在本发明的一个实施方式中，当本发明的方法的步骤(b)进一步包括从获自(b) 的肽与参考修饰肽的混合物中富集修饰肽以产生富集的修饰肽的混合物时，步骤(c)包括在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MQ，以获得与样品中的肽相关的数据，通常是针对样品的MS数据文件。通常而言，质谱是液相色谱-质谱(LC-MQ。因此，步骤(c)通常产生LC-MS数据文件(一个样品一个文件)。与样品中的肽相关的数据通常包括肽的质荷比(m/z)，电荷(ζ)和/或相对保留时间。在本发明的方法的步骤(d)中，使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据(通常是MS数据文件的形式，更通常是LC-MS数据文件的形式)与修饰肽的数据库中的数据进行比较。例如，将样品中的肽的质荷比(m/z)，电荷(ζ)和/或相对保留时间与数据库中修饰肽的质荷比(m/z)，电荷(ζ)和/或相对保留时间进行比较。这使得能够使用修饰肽的数据库鉴定并定量样品中的每个稀释肽。通常而言，计算机程序是被称作PESCAL的程序(Cutillas，P. R.； Vanhaesebroeck, B. Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)6(9), 1560-73，2007)。 PESCAL构建所有待比较的样品的数据库中存在的每个修饰肽的提取离子色谱(XIC，即洗脱谱)。这是通过集中之前被鉴定为磷酸化的肽(即，存在于在该程序的第一步中构建的数据库中)的m/z和保留时间上的XIC而进行的。PESCAL还考虑肽的电荷以辅助性质的正确排列。该程序还计算每个XIC曲线下的峰的高度和面积。通过将每个被分析的修饰肽的强度读数(峰面积或高度)除以参考修饰肽的强度读数来标准化数据。在本发明的方法中，通过包括以下步骤的方法编撰修饰肽的数据库(i)从样品中获得肽；(ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；(iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；(iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和(ν)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。本发明的方法的步骤(i)包括从样品获得肽。可以使用本领域已知的任何适宜方法从样品获得肽。样品通常是生物样品，并且可以是如上所述的获自生物来源的任何类型的样品。 通常而言，样品是细胞系或原代组织。在本发明的一些实施方式中，当步骤(i)中使用的样品是细胞系时，在进行步骤 (i)之前以抑制剂处理所述样品。所述抑制剂可以是任何适宜类型的抑制剂。通常而言，当本发明的方法用于定量磷酸化的肽时，所述抑制剂是磷酸酶抑制剂。以磷酸酶抑制剂处理增加磷酸化的化学计量，并产生可以包含于数据库中的更大数目的磷酸化的肽。此外，当目的是定量甲基化和乙酰化的肽时，可以分别使用甲基转移酶抑制剂或乙酰水解酶抑制剂。在一个实施方式中，本发明的步骤(i)包括(1)裂解样品中的细胞
(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和(3)使用与上文所述的步骤(a)中的步骤(3)相同的方法将所述蛋白切割为肽。在本发明的该实施方式的步骤(1)中，将样品中的细胞裂解或裂开。可以使用本领域已知的任何适宜方法来裂解细胞，例如使用物理方法，例如机械裂解(例如使用 Waring搅拌器)、液体勻浆、超声或人工裂解(例如使用杵和钵)或基于去污剂的方法，例如CHAPS或Triton-X。通常而言，使用变性缓冲液例如基于脲的缓冲液来裂解细胞。在本发明的该实施方式的步骤O)中，从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白。换言之，从裂解的细胞的其它成分中分离蛋白。在本发明的该实施方式的步骤(3)中，使用与上文所述的步骤(a)中的步骤(3) 相同的方法将来自裂解的细胞的蛋白切割为肽。因此，步骤(i)的步骤(3)产生肽包括修饰肽的混合物。在本发明中可以使用本领域已知的任何适宜的试剂进行蛋白的切割。然而，如上所述，步骤(i)的步骤(3)中使用的切割方法必须与上文所述的步骤(a)的步骤(3)中使用的切割方法相同。通常使用蛋白酶进行蛋白切割或消化。本发明中可以使用任何适宜的蛋白酶。在本发明中，蛋白酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C,胃蛋白酶，V8，Lys-C，Asp-C 或AspN。备选地，可以例如使用羟胺、甲酸、溴化氰、BNPS-粪臭素，2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或任何其它适宜的试剂化学地切割蛋白。用于本发明中并且通常按照如上所述的步骤(3)通过蛋白切割而产生的肽适合用于质谱分析中。通常而言，此类肽的长度为大约5至30个氨基酸，例如7至25个氨基酸， 10至20个氨基酸，12至18个氨基酸，或14至16个氨基酸。然而，也可以使用更短和更长的肽，例如大约2至大约50，例如大约3至大约40，或大约4至大约45个氨基酸。可以被分析的肽的长度受到质谱仪对此类长肽进行测序的能力的限制。在一些情况下，可以分析更长的，长达300个氨基酸的多肽。在本发明的方法的步骤(ii)中，从步骤(i)中获得的肽中富集修饰肽。因此，步骤步骤(ii)产生富含修饰肽的数种级分。通常使用多维色谱进行步骤(ii)中的修饰肽的富集。在一个实施方式中，使用强阳离子交换高效液相色谱(SCX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2) 色谱进行所述多维色谱。在另一个实施方式中，使用阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)、 固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。在本发明的这些实施方式中，连续进行色谱技术。备选地，使用基于抗体的方法进行步骤(ii)中的修饰肽的富集。在本发明的一个实施方式中，当被定量的肽是磷酸化的肽时，将具有针对磷酸化氨基酸例如酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸或组氨酸的亲和性的抗体连接于固体基质。通过这些抗体特异性结合磷酸化的肽的能力来富集磷酸化的肽。然后洗掉非磷酸化的肽，而磷酸化的肽保留在抗体包被的基质上。通常使用低PH溶剂或通过任何其它合适的使抗体与磷酸化的肽之间的相互作用变性的方法将磷酸化的肽从固定的抗体上洗脱。在本发明的另一个实施方式中，当被定量的肽是乙酰化肽时，通过使用针对乙酰化氨基酸残基的特定抗体来富集乙酰化肽。将此类抗体连接于固体基质，然后通过抗体特异性结合乙酰化氨基酸残基的能力来富集。然后洗掉非乙酰化肽，而乙酰化肽保留在抗体包被的基质上。在本发明的方法的步骤(iii)中，在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。在本发明的方法的步骤(iv)中，将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽。该步骤通常使用商业上可获得的搜索引擎进行，例如但不限于 MASCOT、ProteinProspector Phenyx 或 Sequest 搜索弓|擎。在本发明的方法的步骤(ν)中，将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。该数据库列出在随后的生物实验中定量磷酸化的肽所需的所有参数。通常而言， 与修饰肽相关的数据包括修饰肽的本性、质荷比(m/z)，电荷和/或相对保留时间。这允许将与样品中的肽相关的数据(通常为样品中的肽的质荷比(m/z)，电荷(ζ)和相对保留时间)与数据库中修饰肽的这些值进行比较，因此允许鉴定并定量样品中的修饰肽。对于可以使用本发明的方法比较的样品的数目没有限制。本发明的方法通常用于定量磷酸化的肽。在该实施方式中，本发明的方法是用于靶向和深度定量信号传导的技术(被称作TIQUAS)，其允许灵敏、迅速且广泛地定量信号传导途径的活性。在一个简单的检验中，该方法可以同时测定蛋白上的数以千计的磷酸化位点ο因此，本发明的方法在信号传导途径的分析中有用，因此信号传导途径的流在很大程度上受脂和蛋白激酶、使蛋白磷酸化的酶的控制。根据本发明的该实施方式的方法相对于使用质谱来定量磷酸化的肽的其它方法具有优点(见表1)。这些优点包括广泛性(可以定量数以千计的磷酸化的肽)、通量(分析时间是大约2小时/样品或大约20个样品/天/LC-MS)、该技术的比较不受限数目的样品的能力，以及其优越的灵敏性(因为定量无需通过串联质谱(MS/MS)鉴定肽)。与之比较SILAC实验需要大约3周来比较至多3个样品；这是因为细胞需要在SILAC培养基中生长大约2周，并且对于每次实验需要深入的分离。表1的参考文献1. Olsen, J. V.等人，Cell (细胞)127，635-648 (2006)2. Cutillas，P. R 等人，Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)4， 1038-1051(2005)3. Gygi, S. P.等人，Nat Biotechnol 17,994-999(1999)4. Ross, P. L.等人，Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)3， 1154-1169(2004)5. Gerber, S. A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)100， 6940-6945(2003)6. Barglow, K. T. &Cravatt, B. F. Nat Methods (自然方法)4，822-827 (2007)7. Cutillas,P. R.等人，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)103， 8959-8964(2006)
权利要求
1.用于定量样品中的修饰肽的方法，所述方法包括(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)中获得的肽中，以产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MQ，以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰修饰肽的数据库，所述方法包括1.从样品中获得肽； 从获自步骤⑴的肽富集修饰肽；iii.在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)； iv将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和v.将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述修饰肽是磷酸化的肽。
3.根据权利要求1或权利要求2中所述的方法，其中所述样品是细胞系或原代组织。
4.根据前述权利要求中任一项中所述的方法，其中步骤(a)包括(1)裂解样品中的细胞；(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和(3)将所述蛋白切割为肽。
5.根据权利要求4中所述的方法，其中使用蛋白酶进行步骤(3)。
6.根据权利要求5中所述的方法，其中所述蛋白酶选自由胰蛋白酶、糜蛋白酶、Arg-C、 胃蛋白酶、V8、Lys-C、Asp-C和AspN组成的组。
7.根据权利要求4-7任一项中所述的方法，其中步骤(3)包括将所述蛋白切割为5-30 个氨基酸的肽。
8.根据前述权利要求中任一项中所述的方法，其中步骤(b)进一步包括从所述肽与参考修饰肽的混合物富集修饰肽，以产生富集的修饰肽的混合物，和步骤(c)包括在所述富集的修饰肽的混合物上进行质谱(MQ以获得与样品中的肽相关的数据。
9.根据权利要求8中所述的方法，其中使用色谱进行富集修饰肽的步骤。
10.根据权利要求9中所述的方法，其中所述色谱选自由固定金属离子亲和色谱 (IMAC)、二氧化钛(TiO2)色谱和二氧化锆(&02)色谱组成的组。
11.根据权利要求8中所述的方法，其中使用基于抗体的方法进行富集修饰肽的步骤。
12.根据前述权利要求任一项中所述的方法，其中与样品中的肽相关的数据包括肽的质荷比(m/z)、电荷(ζ)和相对保留时间。
13.根据前述权利要求任一项中所述的方法，其中步骤(c)中所述的质谱(MS)是液相色谱-质谱(LC-MS)。
14.根据权利要求4-7任一项中所述的方法，其中步骤(i)包括(1)裂解样品中的细胞；(2)从步骤(1)中获得的裂解的细胞中提取蛋白；和(3)使用与权利要求4的步骤(3)相同的方法将所述蛋白切割为肽。
15.根据前述权利要求任一项中所述的方法，其中使用多维色谱进行步骤(ii)。
16.根据权利要求15中所述的方法，其中使用强阳离子交换高效液相色谱 (SCX-HPLC)、固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。
17.根据权利要求15中所述的方法，其中使用阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)、 固定金属离子亲和色谱(IMAC)和二氧化钛(TiO2)色谱进行所述多维色谱。
18.根据权利要求1-14任一项中所述的方法，其中使用基于抗体的方法进行步骤 (ii)。
19.根据前述权利要求任一项中所述的方法，其中使用MASCOT搜索引擎进行步骤 (iv)。
20.根据前述权利要求任一项中所述的方法，其中与修饰肽相关的数据选自由修饰肽的本性、修饰肽的质荷比(m/z)、电荷和相对保留时间组成的组。
全文摘要
本发明提供定量样品中修饰肽的方法，包括(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)获得的肽中，产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库(i)从样品中获得肽；(ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；(iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；(iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，鉴定所述修饰肽；和(v)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。
文档编号G01N33/68GK102395886SQ201080016652
公开日2012年3月28日 申请日期2010年4月16日 优先权日2009年4月17日
发明者佩德罗·罗德里格斯库蒂利亚斯, 巴特·万哈瑟布勒克 申请人:玛丽女王和威斯菲尔德学院
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
