专利名称：同时检测细胞增殖抑制活性和毒性的方法
技术领域：
本发明提供一种同时检测一种物质的细胞增殖抑制活性和毒性的方法，其可在筛选这种物质在增殖抑制中它的活性的过程中实施。
背景技术：
在药物开发过程中，特别是在肿瘤学领域，对作为有效增殖抑制剂的物质进行鉴定是非常重要的。存在各种基于细胞的体外检测来用于研究这类候选物质的抗增殖作用。这类检测的实例是，例如，MTT比色检测、[3H]胸苷摄取检测和WST检测(Johnston，P.，见Cellular Assays inHTS，Methods in Molecular Biology，110卷，Janzen W.P.(编辑)，HumanaPress，NJ，107-116页；Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708)。对药物开发来说，这类检测能够用于高通量筛选大量潜在的候选药物，这是必需的。
为了确定造血细胞的增殖状态，已知的是用待研究物质和一种试剂与细胞群接触，所述试剂能够在ATP存在的条件下产生荧光，并且检测作为增殖状态量度的荧光(US 2002/0 146680)。美国专利号5,972,639描述了一种通过荧光测量确定在细胞培养物中细胞数目的方法。
然而，这些检测是耗时的，仅能提供有限的结果，而且不能区分抑制增殖和诱导细胞死亡。
因此，需要一种简单并同时能够检测一种物质对增殖和诱导细胞死亡的影响的检测方法。而且，也需要该检测方法可以进行自动操作。
发明内容
发明概述本发明提供了一种以增殖的哺乳动物细胞样品为检测体系，同时检测一种物质的细胞增殖抑制活性和细胞毒性(诱导细胞死亡)的方法，其特征在于a)用所述物质以至少两个不同的预定浓度处理预定体积的作为细胞悬液或作为贴壁细胞的所述细胞样品；b)用对死细胞或活细胞特异染色的第一种荧光染料和任选地用染色所有细胞的第二种荧光染料处理所述细胞样品；c)向所述细胞样品中加入预定量的大小为约1-约20μm的胶乳颗粒至所述体积，并任选性地用第三种荧光染料对所述胶乳颗粒进行染色；d)测定所述样品中细胞总数与胶乳颗粒数量的比例；e)用步骤d)的结果及通过对所述样品进行流式细胞分析测定-死细胞或活细胞的数目，其通过由所述第一种荧光染料在第一个波长下激发的荧光测定；-每体积的细胞总数目，其通过在第一个角度下散射光或备选性地通过由所述第二种荧光染料在第二个波长下激发的荧光测定；-每体积的胶乳颗粒的数目，其通过在第二个角度下散射光或备选性地通过由所述第三种荧光染料在第三个波长下激发的荧光测定；f)用步骤d)和e)的结果测定所述物质的细胞增殖活性和毒性。
在本发明的一个优选实施方案中，死细胞用一种荧光染料进行特异染色，胶乳颗�：拖赴氖客ü煌牟嘞蛏⑸涔夂驼蛏⑸涔饨胁舛�。
在本发明的另一个优选实施方案中，细胞是人CD34+祖细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，以所述待研究物质的至少五种不同浓度实施该方法，其优选可以计算增殖和诱导细胞死亡的IC50值。优选地，浓度范围是一个大约1-10,000的系数。
细胞用待研究物质处理后，在允许细胞增殖的标准条件下培养细胞。在本发明的一个优选实施方案中，在多个装置，优选地在多孔微量滴定板中平行培养细胞。另外，同样将待研究物质以不同浓度加在这些装置中，优选地是通过自动吸取方式加入。
发明详述当存在推测为细胞抑制剂的物质时，在培养细胞过程中细胞生长的延迟可以通过细胞死亡和/或细胞增殖抑制造成的。因此，在培养后仅测定细胞的数量不可能直接推断该物质的毒性和/或抑制活性。这种推断需要知道活细胞和死细胞的数量及它们相对于细胞总量的比例。本发明提供了一种快速同时测定这些参数的方法。另外，依照本发明的方法可被自动实施，从而允许高通量地检测某种物质的毒性和增殖抑制活性。
根据本发明，将确定的(预定的)等分试样的胶乳颗粒加入到每个细胞培养装置中。基于在流式细胞分析中对胶乳颗粒的计数，可以估测进行所有计数的液体体积。因此，本发明提供了一种当存在推测为检测体系中的细胞的增殖抑制剂和/或对其有毒性的物质时，可同时测定培养后每体积的细胞总数(其是细胞增殖的量度)和每体积的活细胞数的方法。对不同浓度的物质比较细胞总数和死细胞或活细胞数提供了该物质抑制细胞增殖和毒性之间关系的信息。这一点可直接通过图3推断。如果死细胞相对于总细胞的比例显著增加而细胞总数降低，则表明该物质毒性很高。但是，如果死细胞相对于总细胞的比例没有随该物质浓度增加而显著增加，而细胞总数降低，则表明该物质具有低毒性。具有高毒性的物质的实例显示在图3中。5-氟尿嘧啶和阿霉素是同时表现出毒性和显著的增殖抑制的物质。对5-氟尿嘧啶而言，在该物质增殖抑制活性大于50％的浓度范围内，死细胞占总细胞的比例范围是0到25％之间。对阿霉素而言，在增殖抑制活性大约为80％时，死细胞的比例随该物质浓度高达40％或甚至更高而增加。
增殖细胞，例如CD34细胞的培养过程按如下所述进行。在进行FACS分析前，向每个储器装置(优选微量滴定板或类似物质)中加入染色活细胞或死细胞的荧光染料和不同数量的胶乳珠，分别对活细胞或死细胞进行染色并对作为被分析的细胞培养基的体积的量度的胶乳颗粒进行计数。加入待研究物质并在不同装置中进行细胞培养后，将微量滴定板放在自动吸取装置上，其将来自每个储器的细胞样品的等分试样送经FACS流体腔。对不同数目的胶乳珠进行分析(从而给出关于测定的培养基体积的信息)，停止测定，自动吸取装置从下一个储器中吸取等分试样，并如前所述再次开始分析。
此处所用的术语“待研究物质”或“物质”描述的是任何推测具有增殖抑制活性或细胞毒性活性的物质。所述物质可以是例如，抗体、多肽、短肽、寡核苷酸或低分子量化合物。该化合物至少使用两个不同的浓度，但优选地是更多个浓度，例如五个不同浓度或更多。其原因是基于这些不同浓度的结果，可能很容易地研究浓度依赖的增殖抑制和细胞死亡诱导，并且确定该物质是否诱导大量细胞死亡和/或抑制增殖。对这些数值进行比较，特别是对浓度依赖的增殖和细胞死亡诱导进行比较，可能鉴定潜在的显示例如强的增殖抑制而不诱导大量细胞死亡的候选物质。另外，在不同浓度下实施本发明的方法，可计算出增殖(“增殖活性”)和诱导细胞死亡(“毒性”)的IC50值。浓度和浓度范围依赖于待研究物质的所需效能，也依赖于研究中所用的细胞类型。通常，浓度范围在微摩尔范围，在约0.01μM/ml-100μM/ml之间。
此处所用的术语“细胞”描述的是这类在增殖检测中用作检测体系的增殖的哺乳动物细胞。这类细胞在本技术领域内是众所周知的，是例如人CD34+祖细胞和干细胞、淋巴细胞、正常成纤维细胞/角质细胞、正常内皮细胞和上皮细胞、人工转化的哺乳动物细胞、白血病细胞和实体瘤细胞。这类细胞的增殖可被已知的抑制剂，例如紫杉醇、阿霉素或5-氟尿嘧啶抑制。
通常，将细胞接种到平行装置中进行悬浮培养增殖。通常，例如，如果用96孔微量滴定板培养CD34细胞，每孔接种100-400细胞/200μl，并优选在标准条件下(无待研究物质)进行增殖培养直至它们达到每孔约10,000细胞/200μl。在培养细胞时，使用的是常规的培养基，优选加入生长因子。
此处所用的术语“胶乳颗粒”是指这类在用于细胞计数的自动计数仪的校准流体中广泛使用的胶乳颗粒。例如，在美国专利号3,977,995中描述了这类胶乳颗粒。这类胶乳颗粒通常包括由聚苯乙烯聚甲基苯乙烯或苯乙烯二乙烯基苯共聚物制造的合成胶乳。颗粒大小通常在1-约20μm，加到细胞悬液中的颗粒数目是10,000颗粒/200μl。
通过在仪器中进行流式细胞分析，进行用于根据本发明的鉴定的参数的测定，其中在所述仪器中，在不同波长的荧光和在不同角度的散射光可被测定并与提供这类信号的细胞数相关。当来源于一种样品的细胞流经仪器的分析装置时，对参数进行平行地或一个接一个(同时)地测定。优选地，这种测定是通过分析型FACS设备进行。在不同角度测定散射光，优选地作为正向散射光(FSC)(最大散射光角度高达20°，优选地为更低)和侧向散射光(SSC)(角度大约为90°)。虽然细胞和胶乳颗粒在大小上可能不存在很大差异，但它们的关于光散射行为却相当不同，这可能是由于细胞的内部结构和形状及其不同的折射率造成的。根据这些差异，可通过相当不同的散射光角度容易地区分细胞(活细胞/增殖细胞，捕获的活细胞和死细胞)和胶乳颗粒。SSC与胶乳粒相关，而FSC与细胞相关(参见图2a)。然而，也可以用荧光染料对所有细胞或所有胶乳颗粒进行染色，通过在不同波长下对荧光进行研究而区分胶乳颗�：拖赴６圆舛ú问氖褂媒鲆览涤谒靡瞧魈峁┑目赡苄院捅憷�。如果仪器能够同时在三个或四个不同荧光波长下测定荧光，则胶乳颗粒、所有细胞和分裂细胞或死细胞均可用荧光染料进行特异标记。因此，散射光和荧光的所有组合可用于测量参数，条件是散射光参数不能用于直接区分胶乳颗粒和死细胞、活细胞和增殖细胞及活细胞和捕获细胞。
此处所用的术语“特异染色死细胞或活细胞的荧光染料”是指染料仅进入死细胞(例如碘化丙锭)，或仅在活细胞中富集(例如二乙酸荧光素)。如果需要对所有细胞进行细胞计数，则需要使用对死细胞和活细胞均进行染色的染料(例如Hoechst 33342)。描述了多种用于选择性标记活细胞或死细胞的荧光染料(如分子探针目录；http//www.molecularprobes.com/)。荧光染料以合适的量加入，例如，终浓度为1μg/ml。
提供下述实施例、参考文献列表和附图以有助于理解本发明，其实际范围在后附的权力要求中阐述。应理解在不偏离本发明的精神的情况下，可对所阐述的流程进行修改。
图1是CD34细胞群中细胞生长和细胞死亡的显微镜分析。细胞因子刺激的CD34细胞在不用或用细胞毒性化合物处理条件下培养4天和7天。
图2是标准珠粒、细胞因子刺激的CD34细胞在培养10天后的活细胞和死细胞的FACS分析。细胞或者不用(左列)或者用诱导不同细胞毒性水平的细胞毒性药物进行处理。
图3是由图2所示的FACS分析定量的细胞数目和死细胞的比例。所示的是两种典型的细胞毒性化合物，5-氟尿嘧啶(0.1-100μmol/l)和阿霉素(1-1000ng/ml)。5-氟尿嘧啶和阿霉素的细胞数目分析的IC50值分别为0.34μmol/l和0.67μg/ml。
具体实施例方式
实施例在一个典型的实验设计中，通过免疫磁性细胞分选法分离高纯度(＞90％)人脐带血CD34+细胞，进行等分并冷冻在含有DMSO的培养基中。当进行细胞培养时，融化冷冻的CD34+细胞，并在每孔200μl完全培养基的96孔板中接种200个细胞/孔。基础细胞培养基由补加20％人AB血清和抗生素(氨苄青霉素/链霉素)的IMDM培养基组成。通过加入下述细胞因子混合物hu-SCF(100ng/ml)、hu-1L6(10ng/ml)、hu-GM-GSF(100U/ml)、hu-TPO(25ng/ml)和hu-EPO(5U/ml)，活化CD34+细胞。在37℃、高湿度及7％CO2的培养箱中进行培养。
可使用两个不同的实验设计1)在向培养基中补加细胞因子前加入抑制剂化合物以优先处理静息细胞，和2)在用细胞因子活化CD34后4天加入抑制剂化合物以优先处理活化的细胞。
如图1所示，培养4天后，活化并成活的CD34细胞呈现为大的球状细胞(组A)。当细胞再培养3天后，细胞数目显著增加(组C)。培养4天后，细胞毒性药物在CD34细胞中诱导细胞死亡，在显微镜图象中呈现为碎片状(组B)，和碎片状细胞数目增加而细胞数目没有任何显著增加(组D)。
根据CD34+细胞的增殖速率，培养9-10天后收获细胞，并分析细胞数目和细胞毒性。通过FACS技术分析细胞数目和细胞毒性。孔中的细胞数目通过与内部的珠粒标准物比较而进行计数。将10000个珠粒的一份等分试样(FluoSpheres聚苯乙烯，15μm；Molecular Probes)加入到含有200μl培养基的每个孔中。如图2所示，在典型的FACS仪器装置中，活细胞出现在正向散射光(FSG)和低侧向散射光(SSG)的中间/右边位置，而加入的标准珠粒存在于更低的FSC和高SSC区域(组A)。将一个以矩形区域表示的口设置在标准珠粒上，对不同数目进行计数，停止分析，计算含有细胞的相应培养基的体积。组E显示的是该测定方法对所分析的CD34细胞的存活检测。活细胞再次出现在正向散射光(FSC)的中间/右边位置，其显示低的/无碘化丙锭标记。少量死细胞出现在相对于活细胞群左边或上部/左边位置。这时FACS测定法取一等分试样数量的珠粒，并计算孔中的细胞数，而细胞毒性，死细胞的数目，在该测定中被平行记录(加入碘化丙锭，终浓度为1μg/ml)。随着细胞毒性化合物浓度的增加，死细胞簇中的细胞数目显著增加(图2，组F和G)。在最高抑制和细胞毒性浓度下，非常少的细胞还存在于活细胞簇中，大部分细胞已被杀死，证据是PI染色或碎片增加(组H)。
图3中显示的是对于两种细胞毒性化合物，即5-氟尿嘧啶和阿霉素，计算每孔中CD34细胞数目和死细胞百分比的典型实例。对于每个检测浓度，每孔的细胞数目显示为柱形图。对5-氟尿嘧啶而言，细胞数目在0.3和1.0μmol/l之间显著降低，而阿霉素在1ng/ml最低浓度时，细胞数目已经更低了。应用IC50计算程序，计算出抑制剂化合物的IC50值，对于5-氟尿嘧啶和阿霉素分别是0.34μmol/l和0.67ng/ml。分析PI阳性的细胞部分而得到的死细胞比例的增加显示为实线(图2，组E-H)。
参考文献Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708.
Johnston，P.，inCellular Assays in HTS，Methods in Molecular Biology，Vol.
110，Janzen W.P.(ed.)，Humana Press，NJ，pp.107-116.
US Patent No.3,977,995.
US Patent No.5,972,639.
US 2002/0146680.
权利要求
1.一种以增殖的哺乳动物细胞样品为检测体系，同时检测一种物质的细胞增殖抑制活性和细胞毒性(诱导细胞死亡)的方法，其特征在于g)用所述物质以至少两个不同的预定浓度处理预定体积的作为细胞悬液或作为贴壁细胞的所述细胞样品；h)用对死细胞或活细胞特异染色的第一种荧光染料和任选地用染色所有细胞的第二种荧光染料处理所述细胞样品；i)向所述细胞样品中加入预定量的大小为约1-约20μm的胶乳颗粒至所述体积，并任选地用第三种荧光染料对所述胶乳颗粒进行染色；j)测定所述样品中细胞总数与胶乳颗粒数量的比例；k)用步骤d)的结果及通过对所述样品进行流式细胞分析测定-死细胞或活细胞的数目，其通过由所述第一种荧光染料在第一个波长下激发的荧光测定；-每体积的细胞总数目，其通过在第一个角度下散射光或备选地通过由所述第二种荧光染料在第二个波长下激发的荧光测定；-每体积的胶乳颗粒的数目，其通过在第二个角度下散射光或备选地通过由所述第三种荧光染料在第三个波长下激发的荧光测定；l)和用步骤d)和e)的结果测定所述物质的细胞增殖活性和毒性。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述死细胞用荧光染料进行特异染色，所述胶乳颗�：拖赴氖客ü煌嘞蛏⑸涔夂驼蛏⑸涔獠舛�。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述细胞是人CD34+祖细胞。
4.权利要求1-3的方法，其特征在于在多个装置中平行培养所述细胞，并且通过自动吸取将所述样品转移到流式细胞分析仪中。
全文摘要
以增殖哺乳动物细胞样品为检测体系，同时检测物质的细胞增殖抑制活性和细胞毒性的方法，特征在于a)用物质以至少两个不同的预定浓度处理预定体积的作为细胞悬液或作为贴壁细胞的细胞样品；b)用第一荧光染料和任选用第二荧光染料处理细胞样品；c)向细胞样品中加入预定量的大小为约1－约20μm的胶乳颗粒至所述体积，并任选用第三荧光染料对胶乳颗粒进行染色；d)测定样品中细胞总数与胶乳颗粒数的比例；e)用步骤d)的结果及对样品进行流式细胞分析测定－死细胞或活细胞数；－每体积细胞总数；－每体积胶乳颗粒数；f)用步骤d)和e)的结果测定物质的细胞增殖活性和毒性。
文档编号G01N21/77GK1530643SQ20041003965
公开日2004年9月22日 申请日期2004年3月12日 优先权日2003年3月12日
发明者伯恩哈德·戈勒, 曼弗雷德·库贝斯, 伯恩哈德 戈勒, 德 库贝斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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