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专利名称：一种薄层层析显色方法
技术领域：
本发明涉及薄层层析，具体的说是用薄层层析技术分离未知抗生活性物质的一种薄层层析显色方法。
背景技术：
薄层色谱法(TLC)是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。薄层色谱法是将固定相涂铺在载板上，使之形成均匀的薄层。待分离的样品溶液被点加在薄层板上离下沿约为10mm的位置，将下沿向下，放入盛有深度约为5mm的适当的流动相的密闭缸中，进行色谱展开，从而实现混合物的分离。对被展开的色谱谱带(斑点)，可通过适当的技术进行定性检测和定量测定。
在使用薄层色谱技术分离未知抗生物质时，由于未知抗生物质结构不清楚，含量又特别小，抗生物质本身在紫外光下又不产生荧光，其显色就产生了困难。由于其含量很少，用硫酸等氧化显色剂和碘蒸气也很难看到层析谱带。

发明内容
本发明的目的在于提供一种效果明显、操作简便分离未知抗生物质的薄层层析显色方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为对用薄层层析分离能进行生物显色的未知抗生物质，按常规方法进行薄层层析，然后，将生物显色培养基直接铺在层析完干燥后的薄板(硅胶)上，再在凝固的生物显色培养基上涂上检定菌，最后培养显色。具体操作过程如下(1)薄板上平铺生物显色培养基将未知的抗生物质点在硅胶薄板上，薄板放入层析缸中选取合适的层析液进行层析，层析完毕后将薄板取出晾干。将培养检定菌的生物显色培养基熔化后，放入恒温水浴中恒温至50～55℃，然后倒在晾干的薄板硅胶上。
(2)检定菌的涂布将检定菌制成菌悬液，用无菌镊子夹无菌棉球沾菌悬液均匀的涂在薄板上凝固的生物显色培养基上。
(3)培养显色在瓷托盘中放入两层用无菌水润湿的无菌滤纸，再放入经步骤(2)处理的薄板，盖上盖子，将其放入培养箱中，在28～37℃下培养18～24小时，进行生物显色。
所述生物显色培养基为适合于检定菌生长的生物显色培养基。
所述生物显色培养基中可加入黑色或蓝色墨水，以加大菌落与培养基颜色的对比度，使生物显色在照相时能得到清楚的照片，其加入量为培养基体积的0.5～2％。
此法可用于所有能进行生物显色的抗生活性物质。
在进行抗菌素筛选工作时，为了避免病原菌感染的危险，一般不用病原菌作为检定菌，而是尽可能选择一些没有毒性且对某些致病菌具有代表性的微生物作为检定菌，这些检定菌称为筛选模型。通常用代表各种微生物类型的检定菌以使拮抗菌所产生的抗菌素的作用绝大部分都能表现出来。根据链霉菌鉴定手册(中国科学院微生物研究所放线菌分类组编著，科学出版社，1975)抑制革兰氏阳性球菌选用金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性杆菌选用枯草杆菌、革兰氏阴性肠道细菌选用大肠杆菌、结核杆菌选用分枝杆菌、酵母状真菌用白色念珠菌、丝状真菌用青霉、发癣菌或稻瘟菌。
本发明具有如下优点1.效果明显、准确稳定、操作简便。在使用薄层色谱技术分离未知抗生物质时，由于某些未知抗生物质结构不清楚，在紫外光下又不产生荧光，使其显色非常困难，而且由于其含量很少，即使使用硫酸等氧化显色剂和碘蒸气也很难看到层析谱带；本发明薄层层析显色新方法，通过采用将生物显色培养基直接倒在薄板上进行生物显色的独创技术，产生了非常显著的技术效果，与其它通用显色方法进行对照，不但可很好的观察到薄层层析对未知抗生物质的分离效果，而且其操作简便，准确稳定。
2.应用范围广。本发明可应用于所有能进行生物显色的抗生活性物质在薄层层析分离时进行的生物显色。
具体实施例方式
实施例1(1)产生未知抗生物质海洋细菌的筛选选取海水和海泥样品，用无菌水稀释后涂布Zobell 2216E培养基，从中分离纯化海洋细菌。用白念珠菌做检定菌，挖块法测定纯化的海洋细菌对白念珠的抑制作用，获得了1株有抑制作用的海洋细菌。
(2)海洋细菌的发酵培养和抗生活性物质的初步纯化将海洋细菌发酵培养后，用酸沉淀和离子交换方法除去发酵液中的部分杂质，初步纯化了发酵产生的未知抗生活性物质。
A.材料1.菌株(1)海洋芽孢菌71株，中国沿海采样分离得到。
(2)白念珠菌，沈阳市第七人民医院临床分离、惠赠。
2.培养基(1)抑菌活性培养基(沙氏培养基)葡萄糖4％ 蛋白胨1％ 琼脂2％ pH5.6 0.8atm灭菌20分钟。
(2)发酵培养基葡萄糖0.6％ 玉米面1％ 豆饼粉0.6％ K2HPO40.05％ pH自然0.8atm灭菌20分钟3.层析液(略)B.方法1检定菌白念珠菌悬液的制备取一环白念珠菌斜面种子接种于新鲜沙氏斜面培养基的试管中，37℃培养16～24小时。从培养好的斜面上取一环白念珠菌接入装有20ml无菌水的三角瓶中，振荡三角瓶便制成检定菌悬液。
2层析样品的制备取一环新鲜海洋细菌种子斜面接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在28℃、140～180转/分下培养20小时。培养完毕后将发酵液加酸调pH3～4，放在70℃水浴中保温10分钟，取出冷却后离心取上清液，上清液过732+交换柱，用氨水洗脱活性物质，将未知活性物质再经过G-15凝胶柱纯化，即可获得层析样品。
C.结果1.未知抗生物质的层析将层析样品点在硅胶G薄板上，然后放入层析缸中层析，层析完毕后将层析板取出晾干后，将在50～55℃保温溶化的沙氏固体培养基铺在层析板上。
2.检测菌培养用无菌镊子夹住无菌棉球沾白念珠菌悬液涂于层析板凝固的培养基表面，将涂菌的层析板放入装有两层用无菌水润湿的无菌滤纸的瓷托盘中，将瓷托盘盖上盖后放入37℃培养箱中静置培养18～24小时后，取出发现在Rf＝0.33处有一条明显的抑菌带。
3.其它显色方法的对照检查在层析板铺沙氏固体培养基前，将层析板在紫外光下检测和进行碘显色(因为紫外光检测和碘显色对有机化合物没有破坏，显色后还可以进行生物显色)。结果紫外光检测和碘显色出现的谱带与生物显色的谱带不重合，表明①未知抗生物质得到了较好的分离。②未知抗生物质含量很少，在碘蒸气下看不到谱带，在紫外光下也没有吸收。
权利要求
1.一种薄层层析显色方法，将含有未知的抗生物质的层析样品点在硅胶层析薄板上，薄板放入盛有适宜培养基的层析缸中进行层析，层析完毕后，将薄板取出晾干，其特征在于(1)将溶化的生物显色培养基直接铺在按常规方法层析后晾干的层析薄板上；(2)将检定菌制成菌悬液，涂在层析薄板上的生物显色培养基表面；(3)将涂菌的层析薄板放入培养箱中培养显色。
2.根据权利要求1所述薄层层析显色方法，其特征在于所述生物显色培养基为适合于检定菌生长的生物显色培养基。
3.根据权利要求1或2所述薄层层析显色新方法，其特征在于所述生物显色培养基恒温于50～55℃，铺在层析完的干燥层析板上。
4.根据权利要求1所述薄层层析显色方法，其特征在于所述生物显色培养基中加入黑色或蓝色墨水，以加大菌落与培养基颜色的对比度，使生物显色在照相时能得到清楚的照片，其加入量为培养基体积的0.5～2％。
5.根据权利要求1所述薄层层析显色方法，其特征在于所述检定菌制成菌悬液后，用无菌镊子夹住无菌棉球沾菌悬液涂在层析板上凝固的生物显色培养基表面。
6.根据权利要求1所述薄层层析显色方法，其特征在于所述培养显色是在瓷托盘中放入两层无菌滤纸，并用无菌水润湿后，再放入涂菌的层析薄板，然后，将托盘加盖后放入培养箱中显色。
全文摘要
本发明涉及薄层层析显色方法，具体的说是用薄层层析技术分离未知抗生活性物质的一种薄层层析显色方法。其具体操作为(1)将溶化的生物显色培养基直接铺在按常规方法层析后晾干的层析薄板上；(2)将检定菌制成菌悬液，涂在层析薄板上的生物显色培养基表面；(3)将涂菌的层析薄板放入培养箱中培养显色。本发明可应用于所有能进行生物显色的抗生活性物质在薄层层析分离时进行的生物显色，其具有效果明显、准确稳定、操作简便等优点。
文档编号G01N30/94GK1743842SQ200410050370
公开日2006年3月8日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者马成新, 郭敬斌, 胡江春, 薛德林, 王书锦 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所