专利名称：信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫快速分析技术领域，尤其涉及一种信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
免疫检测技术是目前医学、生物学、食品安全等领域最基本也是最常用的检测技术之一。它广泛应用于医学生物学研究、医学临床、环境检测，以及食品和微生物污染的检测中。免疫检测技术是基于抗体抗原反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法， 具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。荧光免疫测定是指将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术(荧光标记物对抗体或者抗原进行标记)结合起来，并通过荧光信号进行检测的方法。最终目的是通过将抗体与抗原的特异性反应和荧光信号相结合，达到定量检测的目的。斑点荧光免疫渗透试验，在斑点金免疫渗透试验的基础上发展起来的，后发展为斑点荧光免疫渗透试验，而斑点荧光免疫渗透试验则是用荧光性物质代替了胶体金作为标记物，采用免疫渗透技术、荧光标记物和固相载体相结合的一种检测方法。荧光免疫层析是在胶体金免疫层析的基础上发展起来的，是以NC膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析一般。目前，FITC、罗丹明、量子点、荧光微球等荧光标记物已经广泛应用于荧光免疫分析技术中。荧光免疫检测方法具有高特异性、敏感性高、速度快的特点。但是该检测方法在应对非常微量的物质时，也存在信号低，噪声干扰大，传统方法难以检出等问题。因此，发展新的免疫检测方法，提高检测的灵敏度是目前分析检测领域发展的迫切要求。
发明内容
本发明提供了信号放大型免疫荧光探针的制备方法，将荧光标记物标记在连接有多羧基大分子和聚赖氨酸或者连接有生物素-链霉亲和素和聚赖氨酸的抗体复合物上，使免疫反应的荧光信号大大放大，提高了荧光免疫检测的灵敏度。一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括(1)在缩合剂的存在下，将对苯二胺和均苯三甲酸加入有机溶剂中，于80-100°C 缩合反应3- ，得到多羧基大分子；(2)将步骤(1)得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化，然后加入抗体，反应0. 5-2h ；再加入聚赖氨酸，继续反应0. 5-池，得到表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子；(3)用荧光标记物对步骤( 制得的表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子进行标记，制得信号放大型免疫荧光探针。步骤(1)中，所述的缩合剂可以为三苯基亚磷酸盐(TPP)与吡啶(Py)的混合物；所述的有机溶剂可以为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。所述对苯二胺与均苯三甲酸的摩尔比优选为1 0.8-1 1.2;更优选为1 1。 对苯二胺和均苯三甲酸作为反应单体，在缩合剂的存在下能缩合得到多羧基大分子。优选地，每80-100ml N-甲基_2_吡咯烷酮中，所述对苯二胺的加入量为lOmmol， 均苯三甲酸的加入量为lOmmol，三苯基亚磷酸盐的加入量为20-30mmol，吡啶的加入量为 5_15ml ο所述的缩合反应过程中对溶液进行搅拌，确保混合物互溶成均相。所述的缩合反应完成后，对反应产物进行后处理得到多羧基大分子；所述的后处理可以为将缩合反应3- 后的反应产物加入含有盐酸的甲醇溶液中终止反应，分离得到缩合物沉淀，再对缩合物沉淀依次进行重结晶、洗涤和干燥处理。其中，所述含有盐酸的甲醇溶液中盐酸的浓度为10-15mol/L ；所述重结晶所用的试剂为N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇混合液；所述洗涤所用的试剂为热的甲醇；所述的干燥处理为将缩合物沉淀置于80-120°C烘箱中干燥10-15h。步骤⑵中，所述含有1-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亚胺(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液的溶剂可以为磷酸盐缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)的混合液。所述的抗体可以为单抗或多抗。所述步骤(1)得到的多羧基大分子、抗体和聚赖氨酸的摩尔比优选为 1:2: 20-1 3 50。所述的活化时间优选为10-15min。步骤(3)中，所述的荧光标记物可以为FITC、罗丹明、量子点或荧光微球。本发明还提供了另一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括(1)将抗体加入生物素溶液中，搅拌反应l_2h，然后加入荧光标记物进行标记，制得荧光标记的抗体-生物素复合物；(2)将聚赖氨酸加入生物素溶液中，搅拌反应l_2h，然后加入荧光标记物进行标记，制得荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物；(3)将步骤(1)制得的荧光标记的抗体-生物素复合物与链霉亲和素溶液混合， 反应0. 5-lh;然后加入步骤( 制得的荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物，继续反应 0. 5-lh，制得信号放大型免疫荧光探针。步骤(1)中，所述抗体与生物素的摩尔比优选为1 2-1 4。所述抗体加入生物素溶液中反应1- 后，可以进行透析除杂，所述透析除杂为 将反应液装于透析袋中，置于浓度lOmmol/L，pH7. 4的磷酸盐缓冲液中透析48h。步骤O)中，所述聚赖氨酸与生物素的摩尔比优选为1 1-1 2。所述聚赖氨酸加入生物素溶液中反应1- 后，可以进行透析除杂，透析除杂步骤同上。步骤C3)中，所述荧光标记的抗体-生物素复合物、链霉亲和素与荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物的摩尔比优选为1 3 10-1 5 15。本发明还提供了采用上述两种制备方法制得的信号放大型免疫荧光探针，该信号放大型免疫荧光探针标记有较多的荧光标记物，且分子间结合力强，结构稳定，在4°C无菌环境下可以稳定保存一年以上。本发明还提供了所述的信号放大型免疫荧光探针在荧光免疫检测中的应用。试验表明，本发明的信号放大型免疫荧光探针可以用于基于抗体抗原特异性反应的荧光免疫检测，尤其适用于斑点荧光免疫渗透试验或荧光免疫层析试验，检测灵敏度较高，比传统的荧光标记方法要敏感数倍甚至十几倍。本发明将荧光标记物标记在连接有多羧基大分子和聚赖氨酸或者连接有生物素-链霉亲和素和聚赖氨酸的抗体复合物上，使免疫反应的荧光信号大大放大，提高了荧光免疫检测的灵敏度。以多羧基大分子和聚赖氨酸用于免疫荧光探针的信号放大时对苯二胺和均苯三甲酸可以缩合形成表面带有大量羧基的多羧基大分子，在适当的反应顺序和加量比例下， 多羧基大分子能连接抗体和聚赖氨酸，聚赖氨酸的大量氨基基团可用于连接更多的荧光分子，从而形成一个以多羧基大分子为基�。砻媪佑幸欢ǹ固�、大量聚赖氨酸和大量荧光分子的复合物，与抗体、荧光分子直接连接相比，荧光信号大大放大。以生物素-链霉亲和素和聚赖氨酸用于免疫荧光探针的信号放大时由于生物素和链霉亲和素具有良好的配对关系，在适当的反应顺序和加量比例下，可以与抗体和聚赖氨酸相连接形成一个以抗体为起点，链霉亲和素、生物素和聚赖氨酸相互头尾相连的复合物，使免疫荧光信号放大倍数大大提高。采用本发明，具有如下有益效果(1)定量检测、灵敏度高胶体金免疫层析也具有操作方便、快捷的优点，但其更适用于定性检测；而ELISA则适用于大量标本数目的检测，所需的实验设备要求高；而荧光免疫层析不仅具有定量检测功能，而且具有所需设备简单、操作方便等优点；而经过信号放大的荧光免疫层析的定量检测，其检测灵敏度更高，可用于极微量物质的检测。(2)检测时间短，成本低由于信号放大的荧光免疫检测灵敏度更高，可直接应用于荧光免疫层析和斑点荧光免疫渗透试验，相较于ELISA检测，大大缩短了检测时间，一般一个标本的检测时间为10-15min，可以在1小时内检测50-60个标本；特别适合少量标本数的定量检测，相对于ELISA检测，成本更低。(3)探针结构稳定，易保藏本发明的信号放大型免疫荧光探针分子间结合力强， 结构稳定，在4°C无菌环境下可以稳定保存一年以上。
图1为本发明实施例1信号放大型免疫荧光探针制备过程的示意图，其中，1为多羧基大分子，2为抗体，3为聚赖氨酸，4为荧光标记物；NMP为N-甲基-2-吡咯烷酮，TPP 为三苯基亚磷酸盐，Py为吡啶，DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸盐缓冲液，EDAC为1_乙基-3- (3- 二甲氨丙基)碳二亚胺；图2为本发明实施例4信号放大型免疫荧光探针制备过程的示意图，其中，5为抗体，6为生物素，7为荧光标记物，8为链霉亲和素，9为聚赖氨酸。
具体实施例方式实施例1信号放大型免疫荧光探针的制备
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(1)在三颈瓶中，将单体1. 08g (IOmmol)对苯二胺和2. IOg(IOmmol)均苯三甲酸在搅拌下溶于80ml N-甲基-2-吡咯烷酮中，再加入缩合剂7. 5ml吡啶和20mmol三苯基亚磷酸盐，不断搅拌加热至80°C，混合物互溶成均相后，继续搅拌反应池；停止反应后，将反应混合物溶于500ml含有盐酸的甲醇中(盐酸浓度为12mol/L)，过滤得到沉淀产物；粗产品用N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇进行重结晶，最后产物用热的甲醇进行洗涤，并在100°C烘箱中烘干12h;获得多羧基大分子，命名为PT大分子。(2)将步骤(1)中 PT 大分子 5mg 溶于 IOml PBS (IOmM pH 7-8)禾口 Iml DMSO 的溶液中；取30ul PT大分子溶液，向其中加入5ul EDAC(10mg/ml) ^P 3ul NHS (5mg/ml)，室温活化IOmin后，分别先后加入3ug抗体和5ug聚赖氨酸，室温各反应lh。将上述反应溶液上凝胶色谱柱Superdex分离多余的EDAC、NHS和未连接的抗体、聚赖氨酸，并用0. 22 μ m滤孔膜除菌，4°C保存。(3)将上述纯化后的溶液IOOul中加入10%的NaHCO3，调节pH值至约为8-9，并加入5ul荧光标记物，室温反应lh，并每隔10-15min，混勻一次。再将以上混合物用纯化树脂 (Thermo Scientific Zeba)除去多余的荧光标记物，IlOOg离心5min，收集离心后的溶液， 获得抗体-多羧基大分子-聚赖氨酸-荧光标记复合物，即为信号放大型免疫荧光探针。实施例2斑点荧光免疫渗透试验检测盒的制备(1)将10ug/ml浓度的抗体包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上，并用IOmM PBS (pH 7-8)清洗3-5遍，37 °C烘干备用。(2)将塑料小盒打开，分为底和盖。安装次序从下到上依次为底、吸水材料、硝酸
纤维素膜、盖。实施例3斑点荧光免疫渗透试验检测AFP (夹心法)(1)先用将AFP标准品分别配置成浓度的系列标准品Oppb，Ippb，5ppb，20ppb， 50ppb,IOOppb，200ppb，400ppb。(2)取实施例2制得的检测盒，将40ul封闭液(IOmM PBS，pH 7-8，含0. 2% BSA和 0. 05% Tween-20)滴在检测盒的NC膜上，封闭NC膜，待其渗入盒内。(3)在NC膜上滴加IOul标准浓度的AFP溶液，并滴加30ul洗涤液(50mM PBS,pH 7-8)；待溶液略干后，再滴加IOul稀释1000倍的实施例1制得的信号放大型免疫荧光探针溶液(稀释液为含BSA和蔗糖的IOmM PBS溶液，pH 7. 2)，并滴加30ul洗涤液；待溶液略干后，利用荧光定量分析仪进行检测，读取荧光信号(每个样品分别检测3次，取平均值)；以AFP浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。该荧光免疫试纸条的AFP 最低检测线为2ppb。(4)在NC膜上滴加IOul待测AFP溶液，并滴加30ul洗涤液；待溶液略干后，再滴加IOul稀释1000倍的实施例1制得的信号放大型免疫荧光探针溶液(稀释液为含BSA 和蔗糖的IOmM PBS溶液，pH 7. 2)，并滴加30ul洗涤液；待溶液略干后，利用荧光定量分析仪进行检测，读取荧光信号；将荧光信号值代入步骤C3)制得的标准曲线得出待测标本的AFP浓度。(5)重复性实验将3份阳性标本在同一时间段测定20次，计算批内变异系数将同样的3份阳性标本连续测定10次，每天一次，计算批间变异系数。由结果知，批内变异系数和批间变异系数均小于10%，表明该信号放大型免疫荧光探针用于斑点荧光免疫渗透试验，重复性较好。(6)稳定性实验1)将试剂(实施例1制得的信号放大型免疫荧光探针)于37°C 温箱放置12天，与放置在4°C冰箱的试剂平行检测3份阳性和1份阴性标本，进行热稳定性试验。结果显示，该试剂至少可以稳定存放1年以上。幻将检测盒中的试纸条密封分别存放于37°C、25°C和4°C，观察不同温度对试纸条的影响。保存于37°C的试纸条每个月取出 70条分别检测标准品；保存于25°C的试纸条每一个月取出70条分别检测标准品。结果显示，试纸条分别在25°C下保存12个月以及37°C保存6个月，检测结果均未发现改变。实施例4信号放大型免疫荧光探针的制备(1)将20mmol活化的生物素分别与IOmmol抗体和IOmmol聚赖氨酸进行反应，室温搅拌Ih;然后装于透析袋中置于PBS缓冲溶液(10mM，pH7. 4)中透析48h，制得生物素-抗体、生物素-聚赖氨复合物；再用0. 22 μ m滤孔膜除菌，4°C保存。(2)取20ul生物素-抗体和生物素-聚赖氨酸溶液(蛋白浓度彡lmg/ml)，分别用 10%的NaHCO3,调节pH值至约为8_9，加入荧光标记物进行标记，并轻柔搅拌均勻。室温反应lh，并每隔10-15min，混勻一次。反应结束后，用纯化树脂(Thermo Scientific Zeba)除去未反应的荧光标记物，IlOOg离心5min，收集离心后的溶液，获得荧光标记的生物素_抗体、生物素-聚赖氨复合物。(3)将步骤⑵制得的荧光标记生物素-抗体复合物与链霉亲和素溶液混合，室温下反应Ih ；再加入步骤( 制得的荧光标记生物素-聚赖氨复合物，室温下继续反应lh，其中，荧光标记生物素-抗体复合物、链霉亲和素、荧光标记生物素-聚赖氨复合物的摩尔比为1 5 5;反应结束后获得抗体-生物素-链霉亲和素-聚赖氨酸-荧光标记复合物， 即为信号放大型免疫荧光探针。实施例5荧光免疫层析试纸条的制备(1)样品垫制备将样品垫裁成1. 5X30cm，将其放入处理液(3% BSA+1% Triton X-100)中，浸泡30min后，37°C烘干3h备用。(2)结合垫制备将结合垫裁成1. 0X30cm，将实施例4制得的信号放大型免疫荧光探针用稀释液(含BSA和蔗糖的PBS，10mM，pH7_8)稀释3000倍后，喷于结合垫上，37 °C 烘干 30min。(3) NC膜制备将NC膜裁成2. 5 X 30cm，用点样仪在NC膜不同位置上按照lul/cm 的量喷上羊抗鼠IgG和抗原，分别作为质控线和检测限，37°C烘干30min。(4)荧光免疫试纸条组装将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫分别粘在底板上，并裁成4cm宽的试纸条。实施例6荧光免疫层析试纸条检测瘦肉精(竞争法)(1)将瘦肉精标准品配制成不同浓度的系列标准品Oppb，0. lppb，0. 3ppb， 0.9ppb,2.7ppb,8. lppb。(2)将上述系列标准品各取80ul，加入到含有实施例4制得的信号放大型免疫荧光探针的试管中，混勻后2min，取70ul上样，层析持续8min，用荧光检测仪读取数据。利用荧光定量分析仪分别检测T线和C线的荧光强度(每个样品分别检测3次，取平均值)，制作抗原浓度的标准曲线；该荧光免疫试纸条的克伦特罗最低检测线为0. 05ppb。(3)待测抗原用实施例5制得的试纸条进行检测，利用T/C的比值代入上述标准曲线求得待测抗原浓度。(4)重复性实验将3份阳性标本在同一时间段测定20次，计算批内变异系数将同样的3份阳性标本连续测定10次，每天一次，计算批间变异系数。由结果知，批内变异系数和批间变异系数均小于10%，表明该信号放大型免疫荧光探针用于荧光免疫层析，重复性较好。(5)稳定性实验1)将试剂(实施例4制得的信号放大型免疫荧光探针)于37°C 温箱放置12天，与放置在4°C冰箱的试剂平行检测3份阳性和1份阴性标本，进行热稳定性试验。结果显示，该试剂至少可以稳定存放18个月以上。幻将试纸条密封分别存放于 37°C、25°C和4°C，观察不同温度对试纸条的影响。保存于37°C和25°C的试纸条每个月取出 70 条分别检测标准品 Oppb,0. 05ppb，0. lppb，0. 3ppb，0. 9ppb，2. 7ppb，8. Ippb0 结果显示， 试纸条分别在25°C下保存12个月以及37°C保存6个月，检测结果均未发现改变。
权利要求
1.一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括(1)在缩合剂的存在下，将对苯二胺和均苯三甲酸加入有机溶剂中，于80-100°C缩合反应3-5h，得到多羧基大分子；(2)将步骤(1)得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中进行活化；然后加入抗体，反应0. 5-2h ；再加入聚赖氨酸，继续反应0. 5-2h，得到表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子；(3)用荧光标记物对步骤( 制得的表面连接有抗体和聚赖氨酸的多羧基大分子进行标记，制得信号放大型免疫荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的缩合剂为三苯基亚磷酸盐与吡啶的混合物；所述的有机溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述对苯二胺与均苯三甲酸的摩尔比为1 0.8-1 1.2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤O)中，所述步骤(1)得到的多羧基大分子、抗体和聚赖氨酸的摩尔比为1 2 20-1 3 50。
5.一种信号放大型免疫荧光探针的制备方法，包括(1)将抗体加入生物素溶液中，搅拌反应l_2h，然后加入荧光标记物进行标记，制得荧光标记的抗体-生物素复合物；(2)将聚赖氨酸加入生物素溶液中，搅拌反应l_2h，然后加入荧光标记物进行标记，制得荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物；(3)将步骤(1)制得的荧光标记的抗体-生物素复合物与链霉亲和素溶液混合，反应 0. 5-lh ；然后加入步骤( 制得的荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物，继续反应0. 5-lh， 制得信号放大型免疫荧光探针。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗体与生物素的摩尔比为1:2-1: 4。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤O)中，所述聚赖氨酸与生物素的摩尔比为1 1-1 2。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光标记的抗体-生物素复合物、链霉亲和素与荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物的摩尔比为 1:3: 10-1 5 15。
9.一种采用如权利要求1-8任一所述的制备方法制得的信号放大型免疫荧光探针。
10.如权利要求9所述的信号放大型免疫荧光探针在荧光免疫检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种信号放大型免疫荧光探针及其制备方法和应用。该探针的制备方法包括在缩合剂的存在下，对苯二胺和均苯三甲酸经缩合反应得到多羧基大分子；多羧基大分子经活化后，依次加入抗体、聚赖氨酸进行反应；再用荧光标记物标记，制得所述的探针。或者，其制备方法包括将抗体、聚赖氨酸分别加入生物素溶液中反应生成相应的复合物，再用荧光标记物标记；将荧光标记的抗体-生物素复合物与链霉亲和素溶液混合进行反应，再加入荧光标记的聚赖氨酸-生物素复合物继续反应，制得所述的探针。通过上述方法制得的探针，标记有较多荧光标记物，结构稳定，易保藏；用于荧光免疫检测，具有检测灵敏度高、检测时间短、成本低等特点。
文档编号G01N21/64GK102565383SQ20111045612
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者吴坚, 陈春香 申请人:吴坚
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