专利名称：Dna的定量或检测方法
技术领域：
本发明涉及样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法等。
背景技术：
作为样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法，例如，已知抽提出样本中所含的生物来源的基因组DNA后，通过利用DNA聚合酶的DNA合成的链式反应 (Polymerase Chain Reaction ；以下有时也记作PCR)对DNA进行扩增而进行检测的方法； 使荧光标记的寡核苷酸与生物来源样本中的DNA所具有的目标DNA区域杂交而进行检测的方法等(例如，参见 J. Cataract. Refract. Surg.，2007 ；33 (4) :635-641、Environ. Mol. Mutagen.，1991 ； 18 (4) :259-262)。
发明内容
本发明的目的在于，提供简便地对样本中所含的具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的方法。
本发明包含以下的发明。
[发明1] 一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的、具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，其特征在于，包括如下步骤 (1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA ； (2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的检测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸和能够与该特定寡核苷酸结合的支撑体混合，形成含有该被测寡核苷酸、该检测寡核苷酸、该特定寡核苷酸和该支撑体的检测复合物；和 (3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
[发明2] 如发明1所述的方法，其中，检测寡核苷酸为包含多个甲基化位点的、含有多个寡核苷酸的复合检测寡核苷酸。
[发明3] 如发明1或2所述的方法，其中，检测寡核苷酸的识别功能为与检测寡核苷酸的甲基化DNA结合的甲基化DNA抗体的识别功能。
[发明4] 如发明1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，含有构成基因组中的重复序列的碱基序列或其一部分。
[发明5] 如发明1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，是含有基因组中的重复基因或假基因的碱基序列或其一部分的DNA。
[发明6] 如发明1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，是含有分类为LINE或Alu序列的碱基序列的DNA。
[发明7] 如发明4所述的方法，其中，构成基因组中的重复序列的碱基序列含有以下所示的任一碱基序列 (1)序列号1表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (2)序列号2表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (3)序列号3表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
[发明8] 如发明1 7中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸具有以下所示的任一碱基序列 (1)序列号1表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (2)序列号1表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (3)序列号2表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (4)序列号2表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (5)序列号3表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (6)序列号3表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (7)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (8)序列号4表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (9)序列号6表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (10)序列号6表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (11)序列号8表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (12)序列号8表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (13)序列号10表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (14)序列号10表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (15)序列号12表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (16)序列号12表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (17)序列号13表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (18)序列号13表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (19)序列号14表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (20)序列号14表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (21)序列号15表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (22)序列号15表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
[发明9] 如发明1 7中任一项所述的方法，其特征在于，特定寡核苷酸具有以下所示的任一碱基序列 (1)序列号1表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (2)序列号1表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (3)序列号2表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (4)序列号2表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (5)序列号3表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (6)序列号3表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (7)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (8)序列号4表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (9)序列号6表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (10)序列号6表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (11)序列号8表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (12)序列号8表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (13)序列号10表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (14)序列号10表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (15)序列号12表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (16)序列号12表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (17)序列号13表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (18)序列号13表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (19)序列号14表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (20)序列号14表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (21)序列号15表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、 (22)序列号15表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
[发明10] 如发明1 9中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸为含有甲基化胞嘧啶的甲基化寡核苷酸。
[发明11] 如发明1 10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸的识别功能为甲基胞嘧啶的检测、利用甲基化DNA抗体进行的检测或利用甲基胞嘧啶抗体进行的检测。
[发明12] 如发明1 11中任一项所述的方法，其中，样本为下述任何一种样本 (a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液、 (b)从由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的DNA、 (c)以从由哺乳动物来源的组织、细胞、组织裂解液和细胞裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA、 (d)从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或 (e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的DNA。
[发明13] 如发明1 12中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的生物来源DNA样本为下述任意一种具有目标DNA区域的DNA (a)预先用不以目标DNA区域作为识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的DNA ； (b)预先进行纯化后得到的具有目标DNA区域的DNA ； (c)血液中的具有目标DNA区域的游离DNA ； (d)微生物基因组来源的具有目标DNA区域的DNA ；或 (e)利用逆转录酶从RNA生成的具有目标DNA区域的DNA。
[发明14] 如发明1 13中任一项所述的方法，其中，第一步骤中用于制备样本DNA的DNA 抽提操作中使用的溶液中的钠盐的浓度为IOOmM以上、IOOOmM以下。
[发明15] 如发明1 13中任一项所述的方法，其中，第一步骤中用于制备样本DNA的DNA 抽提操作中使用的溶液中的钠盐的浓度为IOOmM以上、200mM以下。
[发明16] 一种方法，用于挑选癌症患者来源的样本，其中，包括如下步骤 当使用受试者来源的样本并通过发明1 15中任一项所述的方法定量或检测的 DNA的定量结果或检测结果、与使用健康人来源的样本并通过相同方法定量或检测的DNA 的定量结果或检测结果之间存在显著差异时，将受试者来源的样本评价为癌症患者来源的样本，并基于该评价的结果确定癌症患者来源的样本。
[发明17] 如发明16所述的方法，其中，样本为哺乳动物来源的血清。
[发明18] 如发明16 17中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为哺乳动物来源的血清中的具有目标DNA区域的游离DNA。
图1是表示实施例1中目标DNA区域X的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸M1，对基因组DNA浓度为500ng/20y L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸Ml，对基因组DNA浓度为50ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸Μ1，对基因组DNA浓度为 5ng/20uL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸Ml，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图2是表示实施例2中目标DNA区域Y的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸Μ2，对基因组DNA浓度为500ng/20y L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸M2，对基因组DNA浓度为50ng/20yL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸M2，对基因组DNA浓度为 5ng/20uL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸M2，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图3是表示实施例3中目标DNA区域X的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸Μ1，对基因组DNA浓度为500ng/20y L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸Ml，对基因组DNA浓度为50ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸Μ1，对基因组DNA浓度为 5ng/20uL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸Ml，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图4是表示实施例4中目标DNA区域X的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸Μ3，对基因组DNA浓度为500ng/20y L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸M3，对基因组DNA浓度为50ng/20yL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸M3，对基因组DNA浓度为 5ng/20uL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸M3，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图5是表示实施例5中目标DNA区域X的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸M3，对基因组DNA浓度为500ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸Μ3， 对基因组DNA浓度为50ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸Μ3，对基因组DNA浓度为5ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸Ml和甲基化寡核苷酸Μ3，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图6是表示实施例6中目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，A表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，对基因组DNA浓度为500ng/20y L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。B表示使用甲基化寡核苷酸M4，对基因组DNA浓度为50ng/20 μ L TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。C表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，对基因组DNA浓度为 5ng/20uL TE缓冲液的溶液进行荧光测定所得到的值。D表示使用甲基化寡核苷酸M4，对基因组DNA浓度为0rig/20 μ L TE缓冲液的溶液(阴性对照液)进行荧光测定所得到的值。
图7是表示实施例7中目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，溶液 A表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品A实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液B表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品B实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度的值。溶液C表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品C实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。D表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品D (阴性对照液)实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。
图8是表示实施例7中目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，溶液 A表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品A实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液B表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品B实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液C表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品C实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。D表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品D (阴性对照液)实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。
图9是表示实施例8中目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，溶液 A表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品A实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液B表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品B实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液C表示使用甲基化寡核苷酸Μ4，测定对血清样品C(阴性对照液)实施包括处理1的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。
图10是表示实施例8中目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，溶液 A表示使用甲基化寡核苷酸M4，测定对血清样品A实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液B表示使用甲基化寡核苷酸M4，测定对血清样品B实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。溶液C表示使用甲基化寡核苷酸M4，测定对血清样品C(阴性对照液)实施包括处理2的操作后所得到的样品的荧光强度而得的值。
图11是表示实施例9中人血清中所含的目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，将使用甲基胞嘧啶抗体和甲基化寡核苷酸M4以及5’末端生物素标记的寡核苷酸B4进行检测的结果、与通过实时PCR定量的结果加以比较。以检测结果为纵轴，以实时PCR的定量结果为横轴作图。另外，图中的直线表示回归直线(粗线)和标准差范围(细线)。
图12是表示实施例9中人血清中所含的目标DNA区域Z的检测实验的实施结果的图。图中，对59岁以下的人血清样品，将使用甲基胞嘧啶抗体和甲基化寡核苷酸M4以及 5’末端生物素标记的寡核苷酸B4得到的DNA检测结果分为癌症患者和健康人分别进行作图，并分别示出其平均值和标准差。
具体实施例方式本发明的方法为一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的、具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，所述方法中，包括如下步骤⑴第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA ； (2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的检测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸和能够与该特定寡核苷酸结合的支撑体混合，形成含有该被测寡核苷酸、该检测寡核苷酸、该特定寡核苷酸和该支撑体的检测复合物；和(3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA 进行定量或检测。
作为本发明方法中的“样本”，可以列举例如食品、河流、土壤、一般市售制品的表面附着物等，这样的样本中可能含有真菌、细菌、病毒等的混入微生物或核酸。
食品中有无食物中毒菌的检查和病原菌的确定是很重要的，通常使用利用微生物表面抗原的免疫法。但是，免疫法中为制作抗原需要大量的劳动，而且需要确定病原菌。即， 微生物检查时的免疫法利用的是微生物种类的特异性，因此难以通过一次检查将多种菌种总括在一起检查其有无，而且，对于免疫法无法成立的微生物，要使用PCR法等，因而检查中需要大量的劳动。本发明的方法能够提供一种检查方法，首先，即使在难以用免疫法进行检查的情况下，利用基因也能够使检查方法成立，其次，能够同时检测多种微生物。即，本发明方法能够用于非生物来源样本中存在的真菌类、微生物类、病毒等的检查。另外，通过使用本发明的方法，能够检测例如食品中的混入微生物或病毒，从而可望用于感染症的检查、 食品污染检查等。
作为样本，还可以列举(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液；(b)从选自由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中的一种物质中抽提的DNA; (c)以从选自由哺乳动物来源的组织、细胞、组织裂解液和细胞裂解液组成的组中的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA ； (d) 从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA ； (e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的 DNA ；等。另外，所述组织表示包括血液、淋巴结等在内的广义的含义，作为所述体液可以列举血浆、血清、淋巴液等，作为所述体分泌物可以列举尿、乳汁等。
作为样本中所含的DNA，可以列举从所述生物试样、所述混入微生物中抽提得到的基因组DNA、来自基因组DNA的DNA片段或RNA等。另外，在哺乳动物来源的样本为人的血液、体液或体分泌物等的情况下，可以利用在人的定期体检的临床检查等中采集的样本。在使用血液作为样本的情况下，根据通常的方法由血液制备血浆或血清，以制得的血浆或血清为样本，分析其中所含的游离DNA (含有胃癌细胞等癌细胞来源的DNA)时，能够避开血细胞来源的DNA而对胃癌细胞等癌细胞来源的DNA进行分析，从而能够提高胃癌细胞等癌细胞以及含有癌细胞的组织等的检测灵敏度。
从哺乳动物来源的样本中获得基因组DNA时，使用例如市售的DNA抽提用试剂盒等即可。另外，从RNA获得DNA时，使用市售的cDNA制作试剂盒等利用逆转录酶从RNA合成DNA的试剂盒即可。另外，本发明的方法中，作为样本，也可以是人工合成的DNA。
本发明方法中的“哺乳动物”是指分类为动物界-脊索动物门-脊椎动物亚门哺乳纲(Mammalia)的动物，具体而言，可以列举人、猿、狨猴、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、山羊、狗、 猫等。
本发明中的“体液”是指构成个体的细胞间存在的液体，可以列举血浆和间质液， 多数情况下，发挥维持个体的稳态的功能。更具体而言，可以列举淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液、间质液)、体腔液、浆膜腔液、胸水、腹水、心包液、脑脊液(脊髓液)、关节液 (滑液)、眼房水(房水)、脑脊液等。
本发明中的“体分泌液”是指由外分泌腺分泌的分泌液。具体而言，可以列举唾液、胃液、胆汁、胰液、肠液、汗液、泪液、鼻涕、精液、阴道液、羊水、乳汁等。
本发明中的“细胞裂解液”是指通过将例如在细胞培养用的IOcm培养皿等中培养的细胞、即细胞株、原代培养细胞、血细胞等破坏而得到的含有细胞内液的裂解液。作为破坏细胞膜的方法，可以列举使用超声波的方法、使用表面活性剂的方法、使用碱性溶液的方法等。另外，将细胞裂解时，也可以使用各种试剂盒等。
例如具体而言，在IOcm培养皿中将细胞培养至铺满后，弃去培养液，在IOcm培养皿中加入0. 6mL的RIPA缓冲液(lxTBS，诺纳德P-40,0. 5%脱氧胆酸钠，0. 1% SDS, 0. 004%叠氮化钠)。在4°C将培养皿缓慢振摇15分钟后，用细胞刮等将IOcm培养皿上的贴壁细胞剥落下来，并将培养皿上的裂解液转移到微量离心管中。添加裂解液的1/10容量的10mg/mL PMSF后，在冰上放置30 60分钟。在4°C以10000 X g离心10分钟，取上清作为细胞裂解液。
本发明中的“组织裂解液”是指通过将采自哺乳动物等动物的组织中的细胞破坏而取得的含有细胞内液的裂解液。
更具体而言，将取自动物的组织测定重量后，使用剃须刀片等将组织裁切为小片。 将冷冻组织切片时，需要切成更小的小片。裁切后，以每Ig组织为3mL的比率添加冰冷却的 RIPA缓冲液(可以添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等，例如可以添加RIPA缓冲液的1/10 容量的lOmg/mLPMSF)，并在4°C下勻浆化。勻浆化使用超声波仪、加压型细胞破碎装置。勻浆化的作业中，溶液恒定维持于4°C，以抑制发热。将勻浆液转移到微量离心管中，在4°C以 IOOOOXg离心10分钟，取上清作为组织裂解液。
本发明方法中的“目标DNA区域”(以下，有时也记作目标区域)，是指样本中所含的DNA中，想要通过本发明的方法检测或定量(作为目标)的DNA区域。样本为DNA时的目标DNA区域，是指DNA的碱基序列上的规定的碱基序列；在样本为RNA时，是指利用逆转录酶从RNA制作得到的DNA上的碱基序列，其为RNA上的作为检测或定量对象的规定碱基序列的互补碱基序列。
第一步骤是制备含有被测寡核苷酸的样本的步骤，所述被测寡核苷酸为具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA。
本发明方法中的“被测寡核苷酸”是指包含基因组中存在多个的目标DNA区域的寡核苷酸。
作为“基因组中存在多个的目标DNA区域”，只要是在基因组中可见到多个的碱基序列(以下，有时也记作重复序列)则可以是任何碱基序列，如果是作为疾病指标的碱基序列则更好。例如，对于癌症而言，已知血液中的来自基因组DNA的游离DNA会增力卩，此时，被测寡核苷酸可以列举具有血液中的游离DNA中的重复序列、其部分序列的寡核苷酸。这些具有重复序列或其部分序列的寡核苷酸的定量值，可以作为表示癌症进展程度的指标。另外，重复序列如后所述，可以是简单重复序列(称为串联重复序列，tandem r印eat)、散在重复序列、重复基因(duplicate gene)或假基因等。
获取包含目标DNA区域的碱基序列的基因组DNA时，例如，在样本为哺乳动物来源的情况下，使用市售的DNA抽提用试剂盒(Genfind v2试剂盒(Beckman Coulter公司制)、 FastPure DNA试剂盒(Takara Bio公司制))等即可。
另外，在样本为真菌等微生物的情况下，使用如Methods in Yeast Genetics (酵母遗传学方法实验指南)(冷泉港实验室出版社)中记载的、一般的酵母基因组的制备方法等即可，在样本为大肠杆菌等原核生物的情况下，使用如Molecular Cloning-A Laboratory Manual-(分子克隆实验指南)(冷泉港实验室出版社)中记载的一般的微生物基因组制备方法等即可。
另外，在样本为食品的情况下，可以从食品中分离出微生物等后获取DNA，也可以同时获取食品中所含的微生物以外的例如病毒等的基因组DNA与微生物来源的基因组 DNA。
另外，在样本为哺乳动物来源的组织、目标DNA区域为病毒来源的DNA的情况下，可以使用市售的RNA抽提用试剂盒(IS0GEN(311-02501)NIPPON GENE公司制)、或者 FastRNA Pro Green 试剂盒(Funakoshi 公司制)、FastRNA Pro Blue 试剂盒(Funakoshi 公司制)JastRNA Pro Red试剂盒(Funakoshi公司制)等从组织中抽提RNA，再利用逆转录酶获取DNA。另外，在样本为哺乳动物来源的样本的情况下，可以在抽提病毒粒子后抽提病毒的DNA，或者也可以在抽提病毒粒子后使用市售的试剂盒(QuickGene RNA组织试剂盒 S II、富士胶片公司制)等抽提病毒RNA，再利用逆转录酶获取病毒来源的DNA。可以在从病毒感染的组织中抽提RNA后利用逆转录酶获取病毒来源的DNA，也可以从病毒感染的组织中获取DNA而获取病毒来源的DNA。另外，利用逆转录酶由RNA获取DNA的情况下，可以使用市售的试剂盒(iTranscriptor高保真cDNA合成试剂盒、Roche Diagnostics公司制)等。
另外，在样本为以来自哺乳类来源的组织或细胞株等的RNA为模板而制备的DNA 的情况下，可以以使用市售的RNA抽提用试剂盒从组织、细胞株等中抽提的RNA为模板，利用逆转录酶获取DNA。
本发明方法中的“具有目标DNA区域的DNA”，可以是预先用在该DNA所具有的目标DNA区域内的碱基序列处不具有识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的 DNA，或者也可以是预先纯化后得到的DNA试样。此外，作为第一步骤中获得的DNA，可以是血液中的游离DNA、微生物基因组来源的DNA、利用逆转录酶从样本中的RNA合成的DNA等。
在使用利用逆转录酶从RNA合成的DNA区域作为“目标DNA区域”的情况下，作为 “具有目标DNA区域的DNA”，可以列举由核糖体RNA、信使RNA、转运RNA以及小RNA等合成的DNA等。RNA不仅包括由RNA聚合酶从宿主的基因组转录而来的RNA，也包括以RNA为基因组的病毒基因组等，只要是RNA即可。
作为本发明方法中的“具有目标DNA区域的DNA”，可以列举革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等细菌、真菌、病毒、病原性原虫等微生物等来源的DNA、或利用逆转录酶从这些微生物等来源的RNA获取的DNA。例如，生殖支原体(Mycoplasma genitalium)、肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae) ^MsMMW (Borrelia burgdorferi)B31、普氏立克次氏体 (Rickettsia prowazekii)、梅毒螺方宠体(Treponema pallidum)、月市炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、幽门螺方宠杆菌(Helicobacter pylori) J99、幽门螺旋杆菌沈695、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)RcU结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv、绿月农假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 口耆月市军团菌(Legionella pneumophila)、丰占质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、大肠木干菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲！flif (Campylobacter jejuni subsp. Jejuni) > 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、畐Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 蜡样芽胞杆菌(Bacillusu cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、小肠结肠炎耳口尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 假结核耳口尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、红色毛痛菌(Trichophyton ruburum)、须发;)||菌(Trichophyton mentagrophytes) > [=3^^: (Candida albicans) > 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、卡氏月市孢子菌(Pneumocystis carinii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、巨细胞病 _ (Cytomegalovirus) > AMM^iJPlM (human herpesvirus) 5> g^Sjrfi - E/K # (Epstein-Barr virus)、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)、人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus)、肠病毒(Enterovirus)、诺如病毒(Norovirus)、 流感病毒anfluenza Virus)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)的基因组 DNA 或利用逆转录酶从RNA制作的DNA，可以用于样本中的感染症病原菌或食品中的食物中毒病原菌等的检测。
作为检测对象的碱基序列，可以列举在基因组中可见到多个的碱基序列 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成族的规律间隔的短回文重复序列)区域等。
使用本发明方法的微生物的鉴定、检测，可以用于感染症诊断、食物中毒菌的鉴定、在土壤、河流、湖沼的底质等中存在的微生物的种类与数量的鉴定(环境中的微生物调查等)、生产有用化合物的微生物或可用于食品发酵等的微生物等产业上有用的微生物的鉴定、污水处理、食品发酵等的微生物在工业利用状态下的菌层(微生物层)的确认等。
本发明方法中的“重复序列”表示在基因组中可见到多个相同的规定序列的碱基序列。作为这样的重复序列，已知简单重复序列(称为串联重复序列，tandem r印eat)、散在重复序列等。
简单重复序列的特征在于，相同的序列以相同的朝向相邻存在，已知卫星DNA、小卫星、微卫星、着丝粒、端粒、动粒、核糖体基因簇等一系列碱基序列等。
散在重复序列的特征在于，不相邻而散在，认为其为来自于逆转录转座子的 DNA。根据碱基序列的长度，散在重复序列分类为SINE (Short Interspersed Repetitive Element，短散在重复序列)和LINE (Long Interspersed Elements，长散在重复序列)，作为人的碱基序列，已知Alu序列和LINE-I序列分别为其代表性重复序列。另外，还已知由 RNA或蛋白质反转录而得到的失活加工假基因、通过基因重复扩增而得到的基因序列。
重复基因是指在一个基因组中存在多个具有高同源性的基因的情况，多数情况下，为在一个基因附近随机排列而存在的碱基序列。另外，假基因中已知也包括包含于重复基因中的基因。
作为在基因组中可见到多个的碱基序列，首先，可以列举含有比较短的碱基序列的重复序列。具体而言，可以列举(A) n、(T) η、(GA) η、(CA) η、(TAA) η、(GGA) η、(CAGC) η、(CATA) η、(GAAA) η、(TATG) η, (TTTG) η、(TTTA) η、(TTTC) η、(TAAA) η、(TTCA) η、(TATAA) η、(TCTCC) η、(TTTCC) η、(TTTAA) η、(TTTTC) η、(TTTTA) η、(TTTTG) η、(CAAAA) η、(CACCC) η、 (TATATG) η、(CATATA) η、(TCTCTG) η、(AGGGGG) η、(CCCCCA) η、(TGGGGG) η (η 表示重复数) 等序列。其次，可以列举来自于转录因子的序列。具体而言，作为hAT组(group)，已知 MER1-Charlie> Zaphod ；作为 Tc-I 组，己知 MER2_Tigger、Tc-U Mariner。此夕卜，还己知 TiggerU Tigger2a、Tigger5、Charlie4a、Charlie7 等。这些“比较短的碱基序列”、“来自于转录因子的序列”，只要可以设定后述的特定接合序列(日文接着配列)和检测用接合序列，则也可以用于本发明的方法。另外，卫星DNA、小卫星、微卫星等是分类为简单重复序列的重复序列，只要能够设定后述的特定接合序列和检测用接合序列，则也可以用于本发明的方法。另外，作为在基因中存在多个拷贝的序列，作为存在于着丝粒中的序列已知有 ALR6，作为snRNA已知有U2、U6，并且已知在tRNA、rRNA等具有生物功能的碱基序列中也具有在基因组中存在多个拷贝的碱基序列。作为这样的基因，可以列举通过基因重复而在基因组中存在多个拷贝的基因即重复基因。
重复基因是指，通过基因重复使基因组中的特定基因或基因片段加倍而产生的基因或其基因片段。基因重复是包含基因的DNA的某个区域产生重复的现象。作为产生基因重复的原因，有基因重组的异常、逆转录转座子的转移、染色体整体的重复等。例如，当1 个基因被复制而插入基因组DNA时，有插入到不同的染色体位置的情况和插入到原基因的附近的情况。通过插入到原基因的附近而使所复制的基因串联的场所称为串联重复序列 (tandem r印eat)，通过基因重复而制作的基因组称为基因簇(基因家族)。
关于假基因，是指DNA的序列中，具有以使人联想到其曾经编码基因产物(特别是蛋白质)为特征的碱基序列，但目前已丧失功能的基因。认为其是由原来的具有功能的序列发生突变的结果而产生的。例如有由突变导致终止密码子产生，蛋白质的肽链缩短，无法发挥作为蛋白质的功能的情况；或由单碱基置换等突变导致正常转录所需的调节序列丧失功能的情况等。假基因大多会另外留有原来的正常的基因，但也有单独成为假基因的情况。假基因根据基因序列的特点可以分类为3种类型。有如下情况基因组中插入有由逆转录转座子的逆转录酶从mRNA制作成的DNA的情况(加工型假基因)；原基因序列在基因组内重复，其拷贝中的一部分因突变等丧失功能而成为假基因的情况(重复假基因或非加工型假基因)；以及基因组内的基因(无重复基因而仅有单独的基因的状态)丧失功能而成为假基因的情况。
目前，在作为假基因已知的基因中，还已知进行转录的例子、具有基因功能的例子 (尚不确定是否应称为假基因)，因此本发明方法中的“假基因”，不表示有无基因功能或是否进行转录，而表示前述的“加工型假基因”和“重复假基因(非加工型假基因)”。
作为本发明方法中的“重复序列”即“在基因组中可见到多个的碱基序列”，可以列举逆转录病毒、末端具有LTR(Long terminal r印eat，长末端重复序列)的逆转录转座子、 MaLRs (Mammalian apparent LTR-Retrotransposons,哺乳动物显性 LTR-逆转录转座子) 等认为来源于病毒的内源序列、逆转录病毒来源的LTR等。
例如，作为逆转录病毒来源的LTR，具体而言，已知LTRl、LTRlB、LTR5、LTR7、LTR8、 LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E, MER48、MLT2CB 等亚家族。另外，逆转录转座子来源的LTR分类为ERV、ERVK、ERVL各类，具体而言，可以列举LTR8A、LTR28、MER21B、MER83、 MER31B、MER49、MER66B、HERVH、ERVL, LTR16A1、LTR33A、LTR50、LTR52、MLT2A1、MLT2E、 MER11C、MER11C等亚家族。另外，MaLRs是指与典型的逆转录转座子同样地在其序列的两端含有LTR，但是LTR所夹的内部序列并非逆转录病毒来源的序列的DNA因子。可以列举例如 MLTlAl、MLT1A2、MLT1B、MLT1C、MLT1D、MLT1F、MLT1G、MLT1H、MLTl J、MLT1K、MLTlI、MLT2CB、 MSTA, MSTA-int、MSTB, THE1A、THE IB, THElB-internal、THEl 等亚家族。
“散在重复序列”的特征在于不相邻而散在，认为其来自于逆转录转座子。另外，散在重复序列根据其长度分类为SINE (Short Interspersed Repetitive Element，短散在重复序列)和LINE (Long Interspersed Elements，长散在重复序列)。SINE中，大部分为属于 Alu家族的序列。作为特征，具有7SL RNA的3’侧的序列或5’侧的序列，并且具有由称为左单体(Left-monomer)和右单体(Right-monomer)的区域夹着的AT富集区域。作为Alu 家族的亚家族，可以列举 Alu、AluJb、AluJo、Ali^c、AluSg、AluSp、AluSq、Alu&uAluY，并且可以列举 FAM (Fossil Alu Monomer)和具有 FAM 的序列的 FLAM (Free Left Alu Monomer) 禾口 FRAM (Free RightAlu Monomer)。作为 Alu 家族以外的 SINE，已知 MIR及 Ther/MIR3，作为各自的亚家族，已知MIR、MIR3。此外，作为其它生物种类的Alu家族的亚家族，已知B1、B2、 B4、PB1、PB1D 等。作为 LINE，报道了从 LINEl 到 Line23 的亚家族，但已知 LINE-1、LINE2、 LINE3在基因组中广泛存在。另外，对于LINE-I,已知例如L1M1、L1M2、L1M3、LlM3d、L1M4、 LlM4c、L1MA2、L1MA7、L1MA8、L1MA9、LlMBU LlMBU L1MB3、L1MB4、L1MB5、L1MB6、L1MB7、 LIMCa、LlMCb、L1MC2、L1MC3、L1MC4、LlMC4a、L1MC5、LIMDa、LIME、LlMEc、LIMEd、LIMEg、 LlMEl、L1ME2、L1ME3、L1ME3A、L1ME3B、LlME4a、L1PB3、L1P4、L1PA2、L1PA3、L1PA4、L1PA5、 L1PA6、L1PA7、L1PA10、L1PA12、L1PA13、L1PA14、L1PA16、LlPBU L1PB3、L1PB4、L1PREC2、 HALl的亚家族，作为LINE-2，已知L2、L2c的亚家族。另外，对于例如Alu家族或Alu的亚家族中共有的序列、LINE-I家族或LINE-I的亚家族中共有的序列，如果能够设定后述的特定接合序列和检测用接合序列，则能够在一个基因组中设定多个检测对象，因此能够以更高的灵敏度进行基因组的检测。
作为目标DNA区域，具体可以列举例如LINE-I的部分序列(序列号1或序列号2 所示的碱基序列)、Alu的部分序列(序列号3所示的碱基序列)或与它们显示同源性的碱基序列等。
另外，在例如想要考察某个区域中的重复序列时，难以用PubMed等一般的序列检索的数据库进行检索，通常使用R印base (www. girinst. org/repbase/)、 RepeatMasker (www. repeatmasker. org/)等数据库即可。这些重复序列的测定例如可以作为血液中的游离DNA量的替代标志物来处理，另外，例如，关注于生物种类特异性的重复序列的情况下，可以用于生物种类的确定等。
作为基因组中的重复序列，具体可以列举含有以下所示的碱基序列的重复序列。
(1)序列号1表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (2)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (3)序列号9表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 第二步骤是将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的检测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸和能够与该特定寡核苷酸结合的支撑体混合，形成含有该被测寡核苷酸、该检测寡核苷酸、该特定寡核苷酸和该支撑体的检测复合物的步骤。
第二步骤中的“检测寡核苷酸”，是能够与该被测寡核苷酸互补结合的寡核苷酸， 构成寡核苷酸的核苷酸的碱基具有用于检测或定量该检测寡核苷酸的识别功能，所述检测寡核苷酸具有检测用接合序列和与该检测用接合序列连接的检测序列，该检测用接合序列是用于通过互补性与具有目标DNA区域的DNA(被测寡核苷酸)结合的碱基序列。另外， “检测寡核苷酸”可以含有能够与后述的人基因组中的重复序列、重复基因或假基因的碱基序列或其一部分互补结合的碱基序列。另外，本发明的方法的第二步骤中的“检测寡核苷酸”，可以采用后述的复合检测寡核苷酸的形态。另外，检测寡核苷酸可以是含有多个甲基化DNA的寡核苷酸，也可以是包含甲基化胞嘧啶的甲基化寡核苷酸。
检测寡核苷酸中的“检测用接合序列”，是含有与具有目标DNA区域的碱基序列互补的碱基序列的一部分的寡核苷酸，是与检测用接合序列能配对的具有目标DNA区域的 DNA的碱基序列部分具有75%以上、优选90%以上的同源性的序列。另外，检测用接合序列具有与被测寡核苷酸中的目标DNA区域或目标DNA区域的附近结合的碱基序列，只要设成能在第二步骤中形成后述的检测复合物即可。
另外，检测用接合序列只要能够形成由检测寡核苷酸、被测寡核苷酸、后述的特定寡核苷酸和支撑体结合而成的检测复合物，则可以是任何的碱基序列，特别优选不妨碍后述的特定寡核苷酸与被测寡核苷酸的结合的碱基序列。另外，检测用接合序列在同一重复序列中(目标DNA区域中)可以设计一个，也可以设计两个以上。在设计两个以上时，多个检测用接合序列接合序列和后述的特定接合序列接合序列优选不妨碍各自与具有目标DNA 区域的DNA的结合。检测用接合序列的碱基序列的长度为5bp 50bp，优选IObp 30bp。
“检测序列”只要是能够与所述检测用接合序列结合使用、且具有识别功能的碱基序列即可。即，可以是含有用于检测或定量的特有的碱基序列的寡核苷酸，或者也可以是具有识别功能的分子本身或结合有具有识别功能的分子的寡核苷酸。例如。可以是FITC、放射性标记、用FITC或放射性同位素标记的寡核苷酸。
另外，例如，检测序列可以是甲基化的DNA。具体而言，在甲基化寡核苷酸为5-甲基胞嘧啶的情况下，通过结合具有识别功能的甲基胞嘧啶抗体，可以对检测序列进行检测、 定量。另外，检测序列可以是能够与甲基化寡核苷酸互补结合的碱基序列。
“能够结合识别功能的分子”是指为了赋予检测寡核苷酸识别功能而在该寡核苷酸上结合的寡核苷酸以外的分子。例如，在识别功能为后述的由FITC抗体标记的辣根过氧化物酶(HRP)的情况下，当检测寡核苷酸上结合有FITC时，FITC为“能够结合识别功能的分子”。
“识别功能”是指能够对检测寡核苷酸进行检测或定量的功能。识别功能只要是检测寡核苷酸所具有的功能则可以是任意识别功能，可以列举例如基于检测寡核苷酸的标记的识别功能、或由检测寡核苷酸上结合的检测分子赋予给检测寡核苷酸的识别功能。具体而言，可以列举在其5’末端或3’末端进行了铕标记、胶体金标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记等的检测寡核苷酸的荧光、发色等特性。
为了检测铕，添加增强溶液(Enhancement Solution) (PerkinElmer公司制)并混合，在室温下静置约45分钟后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光612nm)即可。另外，在检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸的情况下，作为检测分子，具体可以列举甲基化DNA 抗体、锇络合物(J.Am. Chem. Soc.，2007 ；129 =5612-5620)等。甲基化寡核苷酸是指构成寡核苷酸的核苷酸的碱基中的至少一个被甲基化的寡核苷酸，具体可以列举包含5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤等的寡核苷酸。在检测寡核苷酸用FITC标记的情况下，作为检测分子可以列举FITC抗体。
“检测分子”只要具有对检测寡核苷酸进行检测或定量的性质即可。另外，检测分子可以识别检测寡核苷酸的检测序列，也可以预先结合在检测寡核苷酸上。检测分子只要具有与检测寡核苷酸特异性结合的性质，并且具有能够用于定量或检测的功能、特性即“识别功能”或能够被赋予识别功能即可。具体而言，在检测序列为甲基化寡核苷酸的情况下， 检测分子只要是与该甲基化寡核苷酸结合从而能够检测该甲基化寡核苷酸的检测分子即可，只要是与该甲基化寡核苷酸特异性结合而显示识别功能的检测分子即可。此外，例如， 检测分子可以是甲基化DNA抗体。另外，在检测序列为检测分子本身的情况下，为了对检测寡核苷酸进行检测，可以不添加新的检测分子，通过对检测寡核苷酸中结合的检测分子进行检测，可以进行该检测寡核苷酸的检测。
在检测分子为甲基化DNA抗体的情况下，通过以下的方法，可以作为用于定量或检测的识别功能来利用。具体而言，铕标记、胶体金标记、乳胶珠标记、放射性同位素标记、 荧光物质(FITC等)标记、辣根过氧化物酶(HRP)标记、碱性磷酸酶标记、生物素标记等标记是利用了荧光、发色等的功能。另外，作为对这些作为检测分子的抗体赋予识别功能的方法，可以在作为检测分子的抗体上直接结合识别功能，也可以使具有识别功能的二次抗体或三次抗体与作为检测分子的抗体结合。具体而言，可以利用荧光物质标记的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、碱性磷酸酶标记的抗体、生物素标记的抗体、铕标记的抗体作为二次抗体或三次抗体。另外，也可以利用结合有能够通过酶循环法检测的底物的抗体。作为这些识别功能的定量或检测手段，可以列举例如利用放射线检测器、分光光度计等进行测定或目测等。例如，在通过检测寡核苷酸的识别功能对其进行检测或定量的情况下，具体而言在使用附加有铕的二次抗体的情况下，使二次抗体与后述的检测复合物结合后，添加增强溶液(PerkinElmer公司制)并混合，在室温下静置约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发MOnm/荧光612nm)即可。
在使甲基化DNA抗体与检测寡核苷酸上的甲基化DNA结合，并利用其功能进行检测或定量的情况下，具体而言使甲基化DNA抗体与检测复合物结合后，添加抗甲基化DNA抗体的二次抗体(例如，Eu-Nl标记的小鼠IgG抗体，PerkinElmer公司制)，在室温下静置约 1小时，从而促进二次抗体在复合物上的结合。然后，添加增强溶液(PerkinElmer公司制) 并混合，并在室温下静置例如约45分钟。然后，用荧光检测器测定荧光(激发340nm/荧光 612nm)，由此进行检测或定量。
另外，在用FITC对与检测寡核苷酸上的甲基化DNA结合的甲基化DNA抗体进行了标记的情况下，也可以使用结合有FITC的抗体作为二次抗体。此时，也可以通过公知的方法测定FITC的荧光，进行检测或定量，也可以以抗FITC抗体作为二次抗体进行检测或定量。另外，在检测寡核苷酸上直接结合有FITC的情况下，也可以利用FITC作为识别功能， 也可以通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的FITC抗体、碱性磷酸酶标记的FITC抗体、生物素标记的FITC抗体、铕标记的FITC抗体等来赋予标记功能。具体而言，作为复合检测寡核苷酸，在使用FITC标记的寡核苷酸作为检测寡核苷酸的情况下，在包含该检测寡核苷酸的、 固定于后述的支撑体上的检测复合物中添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体(例如，HRP 标记的FITC抗体(Jackson Immuno Research Laboratories公司制))，在室温下静置约1 小时 2小时，从而促进FITC抗体在检测复合物上的结合。然后，将FITC抗体溶液洗涤除去后，添加适当的底物(例如，底物试剂包#DY999，R&D SYSTEMS公司制)并混合。在室温下静置约5 60分钟后，添加终止溶液ON H2SO4水溶液)，使辣根过氧化物酶(HRP)的反应停止，反应停止后30分钟以内测定450nm的吸光度即可。另外，在甲基化DNA抗体的固定化未使用生物素的情况下，检测或定量中可以使用生物素化后的检测寡核苷酸。在对生物素化的检测寡核苷酸进行检测或定量的情况下，例如，将HRP标记的链霉亲和素添加到固定化的检测复合物中并混合，形成生物素化检测寡核苷酸与HRP标记的链霉亲和素的结合物并分离后，通过公知的方法测定HRP的活性，由此可以对生物素化甲基化DNA抗体进行检测或定量。
另外，作为识别功能，可以利用酶循环法等高灵敏度检测法中使用的底物等。具体而言，以结合有酶循环法中使用的酶的抗体作为检测分子，使其与检测复合物结合即可。另外，作为本发明的方法中赋予检测分子的识别功能，不限于上述记载的方法。
本发明中，“甲基化DNA抗体”是指以DNA中的甲基化的碱基为抗原进行结合的抗体。具体而言，可以列举作为甲基胞嘧啶抗体、具有识别单链DNA中的5位被甲基化的胞嘧啶并与之结合的性质的抗体。另外，只要是特异性识别本说明书记载的甲基化状态的DNA 并能够特异性结合的抗体即可，也可以使用市售的甲基化DNA抗体。甲基化DNA抗体可以以甲基化的碱基、甲基化DNA等为抗原，通过通常的方法制作。具体而言，为了制作甲基胞嘧啶抗体，可以通过从以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或者含有5-甲基胞嘧啶的DNA 等为抗原而制作的抗体中，以该抗体与DNA中的甲基胞嘧啶的特异性结合为指标进行挑选来制作。另外，从这样的甲基化DNA抗体的性质(1个甲基化的碱基(胞嘧啶)上结合1个抗体)来考虑时，优选挑选存在数量较多的甲基化的碱基(胞嘧啶)即CpG的区域作为目标DNA区域，并且可以期待定量精度和检测灵敏度的提高。
作为使动物接触抗原而得到的抗体，有用从动物纯化得到的抗原进行免疫后，利用IgG级分(fraction)的抗体(多克隆抗体)的方法和利用生产单一克隆的抗体(单克隆抗体)的方法。本发明中优选为能够特异性识别甲基化DNA或甲基胞嘧啶的抗体，因而优选利用单克隆抗体。
作为制作单克隆抗体的方法，可以列举利用细胞融合法的方法。例如，细胞融合法是通过使来自于免疫小鼠的脾细胞(B细胞)与骨髓瘤细胞进行细胞融合来制作杂交瘤，挑选杂交瘤所生产的抗体，从而能够制作甲基胞嘧啶抗体(单克隆抗体)。在通过细胞融合法制作单克隆抗体的情况下，不需要纯化抗原，例如，可以以5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等的混合物作为抗原，施用于免疫所用的动物。作为施用方法，将5-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶或含有5-甲基胞嘧啶的DNA等直接施用于产生抗体的小鼠。在难以产生抗体的情况下，也可以使抗原与支撑体结合而进行免疫。另外，通过将佐剂溶液(例如，将液体石蜡与Aracel A混合并混合结核杆菌的死菌作为佐剂而得到的溶液)与抗原混合施用、或将抗原吸收到核糖体中来免疫，能够提高抗原的免疫性。或者， 还有等量添加含有抗原的溶液与佐剂溶液，充分形成乳液状后，注射到小鼠的皮下或腹腔内的方法；或与明矾水充分混合后添加百日咳死菌作为佐剂的方法。另外，也可以在初次免疫后间隔适当的时间后，向小鼠的腹腔内或静脉内进行追加免疫。另外，在抗原的量较少的情况下，可以将悬浮有抗原的溶液直接注入小鼠脾脏内来进行免疫。自末次免疫起数天后摘取脾脏并剥离脂肪组织后，制作脾细胞悬浮液。将该脾细胞与例如HGPRT缺陷骨髓瘤细胞进行细胞融合，从而制作杂交瘤。作为细胞融合剂，只要是能够使脾细胞(B细胞)与骨髓瘤细胞有效融合的方法则可以是任何方法，可以列举例如使用仙台病毒(HVJ)、聚乙二醇 (PEG)的方法等。另外，也可以通过使用高压脉冲的方法进行细胞融合。在细胞融合操作后，在HAT培养基中进行培养，选择脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤的克�。却赴さ侥芄唤猩秆〉某潭取Ｗ魑糜谘≡裆勘昕固宓脑咏涣龅目固寮觳夥椒ɑ蚩固逍Ъ鄣牟舛ǚ椒ǎ梢岳每乖固宸从ο低�。具体而言，在抗可溶性抗原的抗体的测定方法中，可以列举放射性同位素免疫定量法(RIA)、酶联免疫定量法(ELISA)等。
本发明方法中的“特定寡核苷酸”是指，具有能够通过互补性与包含目标DNA区域的DNA结合的碱基序列的寡核苷酸，并且，只要具有与后述的支撑体结合的功能即可。具体而言，是具有与具有目标DNA区域的DNA互补结合的特定接合序列，且能够与支撑体结合而形成后述的检测复合物的寡核苷酸。
“特定接合序列”是指，含有能够与具有目标DNA区域的碱基序列(被测寡核苷酸) 互补结合的碱基序列的寡核苷酸。特定接合序列能够配对的被测寡核苷酸的碱基序列部分的互补碱基序列，与特定接合序列的碱基序列具有75%以上、优选90%以上的同源性。特定接合序列的碱基序列的长度为5bp 50bp，优选IObp 30bp。另外，特定接合序列以如下方式设定即可具有与被测寡核苷酸中的目标DNA区域或目标DNA区域附近结合的碱基序列，在第二步骤中能够形成后述的检测复合物。另外，特定接合序列只要能够形成由检测寡核苷酸、被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和支撑体结合而成的检测复合物，则可以是任何的碱基序列，特别优选不妨碍特定寡核苷酸与被测寡核苷酸的结合的碱基序列。另外，特定接合序列在同一重复序列中(目标DNA区域中)通常设计一个即可，也可以设计两个以上。在设计两个以上的情况下，优选不妨碍特定接合序列各自与具有目标DNA区域的DNA的结合的特定接合序列。
“互补结合”是指，通过碱基之间利用氢键进行的碱基配对，使两条单链DNA形成双链DNA。例如，构成单链DNA的碱基通过与构成其它单链DNA的碱基之间产生嘌呤与嘧啶的碱基配对，使这些单链DNA形成双链DNA，更具体而言，是指通过多个连续的胸腺嘧啶与腺嘌呤、鸟嘌呤与胞嘧啶的利用氢键进行的碱基结合，形成双链DNA。“互补结合”有时也记作 “通过互补碱基配对进行的结合”、“互补的碱基配对”或“通过互补性而结合”。另外，能够互补结合的碱基序列有时也记作相互“具有互补性”、“为互补性”。人工制作的寡核苷酸中所含的次黄嘌呤通过氢键与胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶的结合也包括在互补性的结合中。“含有相对于目标DNA区域为互补性的碱基序列的单链DNA”是指，为了与含有目标DNA区域的单链DNA形成结合物(双链DNA)所需的碱基序列，即，含有与目标DNA区域的碱基序列的一部分互补的碱基序列的碱基序列，有时也记作“互补碱基序列”。
本发明的方法中，在具有目标DNA区域的DNA与特定寡核苷酸“通过互补性而结合”的情况中，也包括构成特定寡核苷酸的特定接合序列的碱基序列的一部分不与具有目标DNA区域的DNA进行碱基配对的情况。例如，也包括构成特定接合序列的碱基中，75%以上、优选80%以上的碱基与具有目标DNA区域的DNA碱基配对，并且能够与同具有目标DNA 区域的DNA具有75%以上、优选80%以上的同源性的寡核苷酸结合的情况。
同样地，在具有目标DNA区域的DNA与检测寡核苷酸“通过互补性而结合”的情况中，也包括构成检测寡核苷酸的检测用接合序列的碱基序列的一部分不与具有目标DNA区域的DNA进行碱基配对的情况。例如，也包括构成检测用接合序列的碱基中，75%以上、优选80%以上的碱基与具有目标DNA区域的DNA碱基配对，并且能够与同具有目标DNA区域的DNA具有75%以上、优选80%以上的同源性的寡核苷酸结合的情况。
另外，在具有目标DNA区域的DNA为基因组中的前述的重复序列的情况下，由于重复序列是具有同源性的一组碱基序列，因而具有目标DNA区域的DNA与特定接合序列的互补性碱基配对，存在出现下述情况的可能性碱基序列的一部分与具有目标DNA区域的DNA 无法碱基配对。本发明的方法中，在具有目标DNA区域的DNA为LINE序列或SINE(Alu)序列等重复序列的情况下，作为特定接合序列，也包括能够与具有80%以上的同源性的碱基序列通过互补性而结合的特定接合序列。
本发明的方法中，“显示同源性的碱基序列”是指，具有序列同源性的碱基序列。本发明的方法中，在未记载序列同源性的比率的情况下，是指具有75%以上、优选80%以上的序列同源性的碱基序列。具体而言，“与序列号1显示同源性的碱基序列”是指，序列号 1的碱基序列或与序列号1的碱基序列具有75%以上的序列同源性的碱基序列，优选具有 80 %以上的序列同源性的碱基序列。
作为本发明方法中的“支撑体”，只要是后述的检测复合物能够结合的支撑体，则材质、形状没有特别限制。例如，形状适合使用目的即可，可以列举管状、检测板状、过滤器状、盘状、珠状等。另外，材质可以是通常的免疫测定法用支撑体所用的材质，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚砜、聚丙烯腈、尼龙等合成树脂、或者在所述合成树脂中引入磺基、氨基等反应性官能团而得到的物质。另外，也可以是玻璃、多糖类或其衍生物(纤维素、硝酸纤维素等)、硅胶、多孔陶瓷、金属氧化物等。
22 “检测复合物”是指，所述被测寡核苷酸、所述检测寡核苷酸、所述特定寡核苷酸和所述支撑体结合而成的复合物。制备检测复合物时，具体而言，例如在含有被测寡核苷酸的基因组DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因组DNA的情况下，优选预先用适当的限制性内切酶处理，将DNA片段化)或被测寡核苷酸水溶液(0. lpmol/10 μ 1)中加入5 μ L 0. 02 μ M 的生物素化的特定寡核苷酸作为与被测寡核苷酸通过互补性而结合的特定寡核苷酸，然后各加入5 μ L与被测寡核苷酸通过互补性而结合的检测寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ)，再加入 20 μ L IOOmM 的 MgCl2 和 10 μ 1 最适 10 X 缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAc、 IOOmM Mg0Ac2、5mM二硫苏糖醇)，然后向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，在支撑体的存在下、在95°C加热10分钟，并在70°C保温10分钟后，再在50°C保温10分钟，然后在37°C进行10分钟冷却处理，由此形成被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物即可。
将这样形成的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物转移到作为支撑体的链霉亲和素培养皿中，在室温下静置30分钟，由此使其结合到支撑体上即可。然后，进行残留溶液的除去和洗涤。以200μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(lmMKH2P04、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，形成以链霉亲和素培养皿为支撑体的检测复合物。
作为“与支撑体结合”的方法，例如将特定寡核苷酸利用通常的基因工程的操作方法或市售的试剂盒、装置等固定于支撑体上即可(结合在固相上)。具体而言，可以列举将特定寡核苷酸的5’末端生物素化后，将所得的生物素化的特定寡核苷酸固定于用链霉亲和素包被的支撑体(例如，用链霉亲和素包被的PCR管、用链霉亲和素包被的磁珠、用链霉亲和素部分包被的层析条等)上的方法。
另外，还可以列举在特定寡核苷酸的5’末端侧共价结合具有氨基、醛基、硫醇基等活性官能团的分子后，将其通过例如5个甘油三酯串联连接而成的物质等间隔物、交联剂等共价结合于表面经硅烷偶联剂等活化的玻璃、二氧化硅或耐热性塑料制的支撑体上的方法。另外，还可以列举在玻璃或硅制的支撑体上直接自特定寡核苷酸的末端侧进行化学合成的方法。
上述方法中，同时添加被测寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸、检测寡核苷酸，获得该被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合物，然后，利用该结合物中的生物素化特定寡核苷酸进行固定(选择)，但是，其顺序并没有特别限制。即，也可以先将生物素化特定寡核苷酸固定于链霉亲和素培养皿(支撑体)上，然后，添加被测寡核苷酸和检测寡核苷酸，获得被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合物，从而进行固定(选择)。
另外，在获取所述被测寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合物并加以选择的情况下， 可以通过预先将所得的被测寡核苷酸的5’末端或3’末端生物素化，并实施与上述同样的方法，而使被测寡核苷酸与检测寡核苷酸的结合物直接结合到支撑体上，从而进行选择。
本发明的方法中，作为检测寡核苷酸、后述的复合检测寡核苷酸的识别功能，可以在这些寡核苷酸上结合有与作为支撑体使用的微粒相同的微粒。作为微粒，可以列举乳胶珠、胶体金(金纳米粒子)等。在本发明的方法中使用同一种类的微粒作为支撑体和检测寡核苷酸的识别功能的情况下，在作为支撑体的微粒上固定被测寡核苷酸，并且，通过被测寡核苷酸与检测寡核苷酸的互补结合而形成检测复合物，由此能够以微粒的凝聚体的形式检测作为支撑体的微�：图觳夤押塑账嵘辖岷系奈⒘！４耸保绻⒘Ｎ榻褐椋蚩梢酝ü嵌鹊谋浠觳饽厶�。另外，如果微粒为胶体金(金纳米粒子)，可以通过色调变化(由粉色到紫色)检测凝聚体。
另外，目标DNA区域上存在多个与“检测用接合序列”互补的碱基序列的情况下， 通过在目标DNA区域结合多个结合有微粒的检测寡核苷酸，能够使支撑体凝聚。此时，即使不添加特定寡核苷酸而实施，也能够得到与添加特定寡核苷酸的情况同样的结果。因此，本发明的方法也包括在目标DNA区域上存在多个能够与检测寡核苷酸所能结合的“检测用接合序列”互补结合的碱基序列的情况下，不添加特定寡核苷酸就能够检测微粒的凝聚的方法。
同样，目标DNA区域上存在多个与“特定接合序列”互补的碱基序列的情况下，通过在目标DNA区域结合多个结合有微粒作为支撑体的特定寡核苷酸，能够使支撑体凝聚。 此时，即使不添加检测寡核苷酸而加以实施，也能够得到与添加检测寡核苷酸的情况同样的结果。因此，本发明的方法也包括在目标DNA区域上存在多个能够与特定寡核苷酸的特定接合序列互补结合的碱基序列的情况下，不添加检测寡核苷酸就能够检测微粒的凝聚的方法。
另外，可以将微粒凝聚体的检测量作为与被测寡核苷酸中所含的目标DNA区域在样本中的量相关的指标。
“检测用接合序列”与“特定接合序列”的区别仅在于其为检测寡核苷酸中所含的碱基序列还是特定寡核苷酸中所含的碱基序列，因此，各个该检测寡核苷酸和该特定寡核苷酸是能够同时结合到被测寡核苷酸上的寡核苷酸。即，“检测用接合序列”也可以作为“特定接合序列”来利用，“特定接合序列”也可以作为“检测用接合序列”来利用。
例如具体而言，分别设定序列号4和序列号12的碱基序列为能够与序列号1结合的“特定接合序列”和“检测用接合序列”，将序列号4所示的特定接合序列生物素化并作为特定寡核苷酸，另外，在序列号12所示的检测用接合序列上连续合成检测序列而制作序列号5所示的检测寡核苷酸，使用该特定寡核苷酸和该检测寡核苷酸，能够检测序列号1所示的碱基序列。另一方面，分别设定序列号12和序列号4的碱基序列为能够与序列号1结合的“特定接合序列”和“检测用接合序列”，将序列号12所示的特定接合序列生物素化并作为特定寡核苷酸，在序列号5所示的检测用接合序列的碱基序列上连续合成检测序列而制作检测寡核苷酸，使用该特定寡核苷酸和该检测寡核苷酸，同样能够检测序列号1所示的碱基序列。同样地，作为能够与序列号1结合的“特定接合序列”和“检测用接合序列”的组合，可以列举序列号8和序列号14的碱基序列，作为能够与序列号2结合的“特定接合序列”和“检测用接合序列”的组合，可以列举序列号6和序列号13的碱基序列，作为能够与序列号3结合的“特定接合序列”和“检测用接合序列”的组合，可以列举序列号10和序列号15的碱基序列。
构成能够与被测寡核苷酸结合而构成检测复合物的特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的“特定接合序列”和“检测用接合序列”，可以作为能够与可形成检测复合物的被测寡核苷酸互补结合的碱基序列的组合来处理，使用其中一个作为特定接合序列时，使用其余的一个作为检测用接合序列即可。
本发明方法中的“复合检测寡核苷酸”是指，与被测寡核苷酸互补结合、并且具有识别功能的多个寡核苷酸结合(复合)而成的核苷酸。作为该复合检测寡核苷酸的形态，可以是各个寡核苷酸通过由所具有的相互互补的碱基序列构成的接合碱基序列结合而成的复合检测寡核苷酸，或者也可以是构成复合检测寡核苷酸的各个寡核苷酸全部或其一部分被甲基化。本发明的方法中，有时也将至少一部分被甲基化的复合检测寡核苷酸称为甲基化复合检测寡核苷酸。另外，甲基化复合检测寡核苷酸可以是包含甲基化寡核苷酸的复合检测寡核苷酸。在使甲基化寡核苷酸互补结合而形成复合检测寡核苷酸的情况下，甲基化复合检测寡核苷酸可以是例如仅由甲基化寡核苷酸结合而成的甲基化复合检测寡核苷酸， 也可以是甲基化寡核苷酸与未甲基化(非甲基化)的寡核苷酸组合结合而成的甲基化复合检测寡核苷酸，各个寡核苷酸的数量没有特别限制。
“甲基化寡核苷酸”是指，构成寡核苷酸的核苷酸的碱基被甲基化的寡核苷酸，本发明中可以是人工合成的甲基化寡核苷酸。另外，也可以通过将人工合成的寡核苷酸、基因组DNA片段化所得到的寡核苷酸用甲基转移酶修饰来制备。已知若干种甲基转移酶(甲基化酶)将寡核苷酸中的“CpG”中的胞嘧啶的5位甲基化，作为这样的甲基转移酶的具体例， 可以列举&81甲基化酶、Dmntl甲基化酶等。另外，由于基因组DNA是部分甲基化的，因而将从细胞等获取的基因组DNA片段化时，有时可以获得在基因组中被甲基化的区域作为甲基化寡核苷酸。另外，胞嘧啶的5位被甲基化的甲基化寡核苷酸，可以是使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶而人工合成的甲基化寡核苷酸。此时，不仅能够将“CpG”的胞嘧啶而且能够将所有的胞嘧啶(例如，5’ -CA-3’、5’ -CT-3’、5’ -CC-3’等)均合成为5-甲基胞嘧啶。
"DNA甲基化酶”是将DNA中的碱基甲基化的酶，从哺乳动物细胞、细菌等已分离出多种DNA甲基化酶。DNA甲基化酶根据底物的碱基的种类分类为腺嘌呤甲基化酶、胞嘧啶甲基化酶等几种。胞嘧啶甲基化酶是识别DNA碱基序列中的特定序列并将该序列附近的胞嘧啶甲基化的酶，根据所识别的碱基序列已知有不同的胞嘧啶甲基化酶。
另外，DNA甲基化酶所催化的DNA的甲基化反应多数是从称为限制性修饰系统的原始的免疫系统中发现的。限制性修饰系统是指，在细菌中起作用的、通过将整个基因组定期甲基化从而使其不被识别特定序列的限制性内切酶(限制性核酸内切酶)消化、并且使外源DNA(特别是噬菌体)被限制性内切酶消化的功能来保护微生物基因组免受噬菌体感染的系统。已知作用于基因组的甲基化的酶，将胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，多数将嘌呤残基的 6位的氮(N6)或5位的碳(⑶)甲基化。这样的酶中，作为将胞嘧啶的C5甲基化的胞嘧啶甲基化酶，已知有ksl (M. SssI)甲基化酶、AluI甲基化酶、HhaI甲基化酶、HpaII甲基化酶、MspI甲基化酶、HaeIII甲基化酶等。另外，这些将胞嘧啶的C5位甲基化的酶所识别的碱基序列不同，识别CpG的胞嘧啶甲基化酶仅有ksl。
作为人基因组中的DNA的甲基化反应，就表观遗传(不依赖基因序列而产生基因表达的多样性的机制)而言，已知CpG的胞嘧啶的5位(C5)的甲基化，作为这样的胞嘧啶甲基化酶，已知DNA甲基转移酶。作为DNA甲基转移酶，已知DnmtI甲基转移酶。
由于人细胞中CpG序列的胞嘧啶的C5位被甲基化，因而在人为地将基因组甲基化的情况下，通过使用SssI，可以将与人细胞内的甲基化相同的序列(CpG)的相同的胞嘧啶的相同的位置甲基化。
为了利用胞嘧啶甲基化酶得到甲基化的DNA，具体而言例如如下实施即可。在DNA
25试样中加入最适IOX缓冲液(NEBuffer2 (NEB公司制))5 μ L、S-腺苷蛋氨酸(3. 2mM, NEB 公司制)0. 5 μ 1、胞嘧啶甲基化酶ksl (NEB公司制)0. 5 μ L，然后在该混合物中加入灭菌超纯水使液量为50 μ L，并在37°C孵育30分钟即可。
本发明的方法中，在构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸相互互补地串联结合(连接)的情况下(有时也称为“串联型”)，将构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中具有通过互补性与被测寡核苷酸结合的检测用接合序列的寡核苷酸称为第1 寡核苷酸。
第1寡核苷酸具有第1接合碱基序列，所述第1接合碱基序列是具有所述检测用接合序列且能够与第2寡核苷酸的互补接合序列互补结合的接合碱基序列，所述第2寡核苷酸是不与被测寡核苷酸的所述检测用接合序列以外的碱基序列互补结合而能够与第1 寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
另外，将具有含有能够与第1接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第1接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第2寡核苷酸。第2寡核苷酸具有第2 接合碱基序列，所述第2接合碱基序列是具有所述互补第1接合碱基序列且能够与第3寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第3寡核苷酸是不与第1接合序列以外的被测寡核苷酸和第1寡核苷酸互补结合而能够与第2寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。将具有含有能够与第2接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第2接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第3寡核苷酸。
同样地，将具有含有能够与第N接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第N接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第(N+1)寡核苷酸。第(N+1)寡核苷酸具有第(N+1)接合碱基序列，所述第(N+1)接合碱基序列是具有该互补第(N)接合碱基序列且能够与第(N+幻寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第(N+幻寡核苷酸是不与第N接合序列以外的被测寡核苷酸和第1寡核苷酸至第N寡核苷酸的寡核苷酸互补结合而能够与第(N+1)寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。将具有含有能够与第(N+1)接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第(N+1)接合碱基序列的寡核苷酸 (包括甲基化寡核苷酸)称为第(N+幻寡核苷酸。
同样地，将具有含有能够与第(N-I)接合碱基序列互补结合的碱基序列的互补第 (N-I)接合碱基序列的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)称为第N寡核苷酸。第N寡核苷酸具有第N接合碱基序列，所述第N接合碱基序列是具有该互补第(N-I)接合碱基序列且能够与第(N+1)寡核苷酸互补结合的接合碱基序列，所述第(N+1)寡核苷酸是不与第(N-I) 接合序列以外的被测寡核苷酸、第1寡核苷酸至第(N-I)寡核苷酸的寡核苷酸互补结合而能够与第N寡核苷酸互补结合的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)。
另外，在不存在第(N+1)寡核苷酸的情况下，将第N寡核苷酸称为末端寡核苷酸， 该第N寡核苷酸可以不具有第N接合碱基序列。
S卩，本发明方法中的复合检测寡核苷酸的一种形态，是将第1寡核苷酸至末端寡核苷酸通过接合碱基序列与互补接合碱基序列的互补结合连接而成的复合检测寡核苷酸。 另外，在复合检测寡核苷酸仅由第1寡核苷酸形成的情况下，根据上述，该第1寡核苷酸可以不具有接合碱基序列，并且可以为甲基化寡核苷酸。
接合碱基序列与互补接合碱基序列，只要是能使寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)互补结合的碱基序列即可，可以位于该寡核苷酸的末端，也可以位于中间。
另外，第N接合碱基序列优选具有如下特征不与互补第N接合碱基序列以外的碱基序列互补结合，并且也不妨碍互补第N接合碱基序列以外的、任意的互补结合。第N接合碱基序列优选不与互补第N接合碱基序列以外的、包括构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸、样本中所含的核酸、被测寡核苷酸及特定寡核苷酸在内的其它寡核苷酸的碱基序列互补结合。
本发明的方法中，在构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸能够相互互补地分枝(除串联之外)结合(连接)的情况下(有时也称为“分枝型”)，构成复合检测寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)中，在第N寡核苷酸上可以存在多个接合碱基序列。例如， 在第N寡核苷酸上存在M个接合碱基序列的情况下，分别将其称为第(N，l)接合碱基序列、 第(N, 2)接合碱基序列、第(N, 3)接合碱基序列、…、第(N, (M-I))接合碱基序列、第(N，M) 接合碱基序列，将通过互补性与该接合碱基序列结合的寡核苷酸分别称为第((N+l)，l)寡核苷酸、第((N+l)，2)寡核苷酸、第((N+l)，3)寡核苷酸、…、第((N+l)，(N-I))寡核苷酸、 第((N+1)，M)寡核苷酸。此时，例如在不存在第((N+2)，l)寡核苷酸的情况下，第((N+1), 1)寡核苷酸为末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+l)，l)接合碱基序列。
另外，同样地，在第(N，1)寡核苷酸上存在多个接合碱基序列的情况下，例如在第 (N，l)寡核苷酸上存在L个接合碱基序列的情况下，将其分别称为第(N，l，l)接合碱基序列、第(N, 1,2)接合碱基序列、第(N, 1,3)接合碱基序列、…、第(N，l，(L-I))接合碱基序列、第(N，l，L)接合碱基序列，将通过互补性与该接合碱基序列结合的寡核苷酸分别称为第((N+l)，l，l)寡核苷酸、第((N+l)，l，2)寡核苷酸、第((N+l)，l，3)寡核苷酸、…、第 ((N+l)，l，(L-I))寡核苷酸、第((N+1)，1，L)寡核苷酸。此时，例如在不存在第((N+2)，l， 1)寡核苷酸的情况下，第((N+l)，l，l)寡核苷酸为末端寡核苷酸，且可以不存在第((N+1)， 1,1)接合碱基序列。
分枝型的复合寡核苷酸，不仅包括复合检测寡核苷酸为分枝型的情况，而且也包括存在多种第1寡核苷酸、被测寡核苷酸上结合多个作为第1寡核苷酸的寡核苷酸(包括甲基化寡核苷酸)的情况。此时，在被测寡核苷酸上存在M个第1寡核苷酸的情况下，只要为具有能够与被测寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(1，1)接合序列、第(1，2)接合序列、第(1，3)接合序列…第(1、M)接合序列的第(1，1) 寡核苷酸、第(1，幻寡核苷酸、第(1，；3)寡核苷酸…第(1、M)寡核苷酸即可。另外，在第1 寡核苷酸上存在M个第2寡核苷酸的情况下，只要为各自具有能够分别与第1寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(2，1)接合序列、第(2，2)接合序列、第(2，3)接合序列…第(2，M)接合序列的第(2，1)寡核苷酸、第(2，2)寡核苷酸、 第(2，；3)寡核苷酸…第(2、M)寡核苷酸即可。
另外，在第N寡核苷酸上存在M个第N+1寡核苷酸的情况下，只要为各自具有能够分别与第N寡核苷酸上的第1连接序列、第2连接序列…第M连接序列互补结合的第(N+1， 1)接合序列、第(N+1,2)接合序列、第(N+1,3)接合序列…第(N+Ι,Μ)接合序列的第(Ν+1， 1)寡核苷酸、第(N+1,2)寡核苷酸、第(N+1,3)寡核苷酸…第(N+1、M)寡核苷酸即可。
另外，在第(N，M)寡核苷酸上存在P个第N+1寡核苷酸的情况下，只要是各自具有分别能够与第(N，M)寡核苷酸上的第(N+1，M，1)连接序列、第(N+1，M，2)连接序列…第(N+1，M，P)连接序列互补结合的第(N+1，M，1)接合序列、第(N+1，M，2)接合序列、第(N+1, M，3)接合序列…第(N+1, M, P)接合序列的第(N+1, M，l)寡核苷酸、第(N+1, M，2)寡核苷酸、第(N+1，M，3)寡核苷酸…第(N+1,M, P)寡核苷酸即可。
另外，在第(Ν，Μ，…，X)寡核苷酸上存在P个第Ν+1寡核苷酸的情况下，只要是各自具有分别能够与第(N，Μ，…，X)寡核苷酸上的第(N+Ι,Μ,…，X，l)连接序列、第(Ν+1， Μ，…，Χ，2)连接序列…第(Ν+1，Μ，…，X，P)连接序列互补结合的第(N+Ι,Μ,…，X，l)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，2)接合序列、第(N+l，Μ，…，Χ，3)接合序列…第(N+l，Μ，…， Χ，Ρ)接合序列的第(Ν+1，Μ，…，X，l)寡核苷酸、第(Ν+1，Μ，…，X，2)寡核苷酸、第(Ν+1， Μ，…，Χ，3)寡核苷酸…第(Ν+1，Μ，…，X，P)寡核苷酸即可。
如上所述，将复合检测寡核苷酸进行各种组合能够提高灵敏度，可以根据检测所需的灵敏度或精度来调整各寡核苷酸、末端寡核苷酸的组合。
另外，在一个寡核苷酸上存在多个接合碱基序列的情况下，这些接合碱基序列可以相同，也可以不同。具体而言，例如，上述第(N，l)接合碱基序列、第(Ν，2)接合碱基序列、第(Nd)接合碱基序列的碱基序列可以全部相同，也可以是各自不同的碱基序列。连接接合序列与互补连接碱基序列、以及接合碱基序列与连接碱基序列，只要是能够相互互补结合的碱基序列即可，具体而言，只要具有90%以上的同源性即可，通常为5 lOObp、优选10 50bp。碱基序列优选以不与基因组互补结合的方式进行设计，更优选为人工合成的DNA。为了简便地确认所设计的接合碱基序列和连接碱基序列等不与基因组互补结合，用 PubMeD等公共机构等的基因组数据库进行Blast检索，确认不存在显示80%以上的同源性的碱基序列即可。
即，“复合检测寡核苷酸”通过连接碱基序列和互补连接碱基序列的互补结合与被测寡核苷酸连接，从而形成检测复合物。检测复合物可以是一个被测寡核苷酸上结合有检测寡核苷酸的复合物，或者也可以是多个复合检测寡核苷酸结合成的复合物。复合检测寡核苷酸可以是甲基化复合检测寡核苷酸。另外，多个复合检测寡核苷酸结合在一个被测寡核苷酸上的情况下，各个复合检测寡核苷酸可以是相同的复合检测寡核苷酸，也可以是不同的复合检测寡核苷酸。另外，被测寡核苷酸上的连接碱基序列，可以是多种连接碱基序列各存在一个，也可以是一种连接碱基序列存在多个。
本发明的第一步骤获得的“作为具有目标DNA区域的DNA的被测寡核苷酸”，可以是单链DNA。从样本中以单链DNA形式获得被测寡核苷酸的方法可以是任意方法。具体而言，目标DNA区域可以通过如下方法获得在基因组DNA水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1，基因组DNA的情况下，优选预先用适当的限制性内切酶处理，将DNA片段化)或被测寡核苷酸水溶液(0. lpmol/ΙΟμ 1)中加入最适IOX缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2,5mM 二硫苏糖醇)10 μ 1，然后向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为 100μ L，在95°C加热10分钟，并在4°C进行骤冷处理即可。也可以不使用缓冲液而仅用灭菌超纯水调节为100 μ L，在95°C加热10分钟，并在4°C进行骤冷处理。另外，目标DNA区域为病毒基因组DNA (单链DNA)或由逆转录酶从RNA合成的DNA等、在样本中可能以单链DNA 或与RNA的杂交体形式存在的DNA的情况下，优选同样地在缓冲液或灭菌超纯水的溶液中， 在95°C加热10分钟，并在4°C进行骤冷处理。
本发明的方法中，所谓“形成含有该被测寡核苷酸、该检测寡核苷酸、该特定寡核苷酸和该支撑体的检测复合物”，例如，是指在含有被测寡核苷酸的基因组DNA水溶液 (0. lpmol/10 μ 1，基因组DNA的情况下，优选预先用适当的限制性内切酶处理，将DNA片段化)或被测寡核苷酸水溶液(0. lpmol/10 μ 1)中，加入5yL 0. 02 μ M的生物素化的特定寡核苷酸作为与被测寡核苷酸通过互补性而结合的特定寡核苷酸，然后加入5μ L与被测寡核苷酸通过互补性而结合的检测寡核苷酸水溶液(0. 02 μ Μ),再加入20 μ L IOOmM的MgCl2 禾口 10 μ 1 最适 10 X 缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM 二硫苏糖醇)，然后向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，在95°C加热10分钟，并在 70°C保温10分钟后，再在50°C保温10分钟，然后在37°C进行10分钟冷却处理即可。
将这样形成的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物转移到作为支撑体的链霉亲和素培养皿中，在室温下静置30分钟，由此获得检测复合物即可。然后， 进行残留溶液的除去和洗涤。以200μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(lmMKH2P04、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，得到以链霉亲和素培养皿为支撑体的检测复合物。
第三步骤是利用第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸的识别功能对其进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测的步骤。作为第三步骤的“利用第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸的识别功能对其进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测”的方法，具体而言，例如在所述检测寡核苷酸为甲基化寡核苷酸的情况下，在结合有所述被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物的链霉亲和素培养皿中添加甲基化DNA抗体作为检测分子，使其与检测复合物中所含的检测寡核苷酸结合。然后，除去残留溶液，用洗涤缓冲液进行洗涤，得到检测复合物。更具体而言，例如，在固定有前述的方法具体例中得到的被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物的培养皿中，以IOOyL/孔的比例添加制备为Iyg/ mL的甲基胞嘧啶抗体(lmg/mL)，并在室温下静置1小时。然后，进行残留溶液的除去和洗涤。以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HP047H20U54mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作，得到与检测复合物结合的甲基胞嘧啶抗体。
此外，具体而言，例如，使与甲基化DNA抗体结合的铕(以下，有时也记作“Eu”)标记的抗体(二次抗体)与结合有甲基化DNA抗体的检测复合物结合，添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光即可。代替Eu标记，也可以使用 FITC标记。另外，FITC标记的抗体(二次抗体)也可以再与HRP标记的FITC抗体结合， 并利用HRP的酶活性进行检测。在利用HRP的酶活性进行检测的情况下，添加底物(R&D公司、#DY999)并在室温下孵育后，添加终止溶液(Stop Solution) (1M H2SO4, 50 μ L/孔)，测定450nm(参比值650nm)的吸光即可。另外，也可以使用结合有可通过酶循环法进行检测的底物的抗体作为二次抗体。
更具体而言，例如，在前述的方法具体例中得到的结合有甲基化DNA抗体的检测复合物(支撑体为链霉亲和素培养皿)中，以IOOyL/孔的比例添加制备为0.25 μ g/mL 的小鼠IgG抗体Eu-Nl (Perkin Elmer公司制)，在室温下静置1小时后，除去残留溶液，以 200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4, 3mMNa2HP0 7H20、154mM NaCl pH7. 4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作。以200 μ L/孔添加增强溶液，搅拌后在室温孵育45分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下进行测定(延迟时间(lag time) 400 毫秒，积分 Qntegration) 400 毫秒)。
另外，在前述的方法具体例中得到的结合有甲基化DNA抗体的检测复合物(支撑体为链霉亲和素培养皿)中，以100 μ L/孔的比例添加制备为2μ g/mL的FITC标记的小鼠IgG抗体(山羊)，在室温下静置1小时后，除去残留溶液，以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有0.05% Tween20的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、 154mM NaClpH7.4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作。再以100 μ L/孔的比例在链霉亲和素包被的培养皿中添加抗FITC的二次抗体(例如，HRP标记抗FITC抗体，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司制)，并在室温下孵育。以200 μ L/孔的比例添加洗涤缓冲液[例如，含有 0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7.4)]，并除去溶液。重复数次该洗涤操作。以100 μ L/孔的比例添加底物(R&D公司、#DY999)，并搅拌约10秒钟。在室温下孵育，添加终止溶液(IMH2SO4, 50 μ L/孔)，并搅拌约10秒钟。在30分钟以内测定450nm(参比值650nm)的吸光(优选避光)。
本发明可以用于下述场合。
例如，在癌症等的诊断中，通过血液中的游离DNA的定量，可以作为定期体检中的筛选检查来利用。另外，在感染症等的诊断中，通过致病的细菌、病毒的DNA、以RNA为模板而制作的DNA的定量或检测，可以提供感染症的病原菌、致病病毒、食物中毒菌的简易的确定方法。另外，现有技术中，这些血液中的游离DNA、微生物来源的DNA或以RNA为模板而合成的DNA，在实施PCR等将DNA扩增后进行定量或检测。但是，通过使用本发明的方法，即使不进行PCR等繁杂的方法也能够进行DNA的定量或检测。
作为血液、尿等生物试样中所含的蛋白质、低分子生物物质的检测或定量方法，通用免疫学测定方法。该免疫学测定方法中，利用层析法的所谓免疫层析法操作简单，检验所需的时间也短，因此，目前广泛用于例如医院的临床检查、研究室的检验试验等多种场合。 另外，近年来，开始使用通过将标记的DNA(基因)在层析条上展开，并使用能够捕获目标 DNA(基因)的探针进行杂交来检测目标DNA(基因)的、所谓的杂交层析法。该方法也操作简便，检验所需的时间也短，因此目前开始广泛用于医院的临床检查、研究室的检验试验等场合。本发明测定方法，在概念上使上述的免疫层析法与杂交层析法的混合方法成为可能。本发明的测定方法中，关于复合物形成和复合物获取的顺序没有特别限制，因此可以使用各种方法。具体而言，例如可以如下实施。
例如，在刚结束第二步骤后的试样中添加生物素化特定寡核苷酸和具有识别功能的检测寡核苷酸，使包含目标DNA区域的甲基化的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化特定寡核苷酸结合，形成包含目标DNA区域的单链DNA、具有识别功能的检测寡核苷酸与生物素化特定寡核苷酸的结合物结合在支撑体上的检测复合物。将所得的试样滴加(导入)到层析条的导入部时，所述检测复合物由于毛细管现象沿展开部移动，并被预先用链霉亲和素包被的部分捕获。然后，基于检测寡核苷酸的识别功能对所得的复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测或定量，由此能够对具有目标DNA区域的DNA进行检测或定量。
也可以在目标DNA区域中设定能够与多个检测用碱基序列互补结合的碱基序列 (使用能够与目标DNA区域上的各个不同的碱基序列互补结合的检测寡核苷酸)，依次检测或定量各目标DNA区域，另外，为了与多个目标DNA区域形成检测复合物，即便使用同时检测基因组中的重复序列、重复基因或多个不同的基因的、能够与基因组中存在多个的目标 DNA区域互补结合的检测寡核苷酸，也能够飞跃性地提高检测灵敏度。
另外，在存在多个具有多个目标DNA区域的DNA的情况下，各个具有目标DNA区域的被测寡核苷酸、与该被测寡核苷酸互补结合的各个特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的结合物，如果在其它被测寡核苷酸、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的存在下也能够形成，则也可以同时检测多个具有目标DNA区域的DNA。
检测寡核苷酸和特定寡核苷酸，具有例如以下所示的任一碱基序列。
(1)序列号1表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (2)序列号1表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (3)序列号2表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (4)序列号2表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (5)序列号3表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (6)序列号3表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (7)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (8)序列号4表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (9)序列号5表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (10)序列号5表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (11)序列号6表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (12)序列号6表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (13)序列号7表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (14)序列号7表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (15)序列号8表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 (16)序列号8表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列 例如，与序列号1表示的碱基序列具有80%以上的序列同源性的碱基序列，在人基因组中约有观0个拷贝，与序列号2表示的碱基序列具有80%以上的同源性的碱基序列， 在人基因组中约有260个拷贝，与序列号3表示的碱基序列具有80%以上的同源性的碱基序列，在人基因组中约有820个拷贝。因此，如果能够在各个碱基序列中设定检测用接合序列和特定接合序列，与在基因组中仅存在一种的序列中设定检测用接合序列和特定接合序列的情况相比，理论上能够将基因组的检测灵敏度提高260 820倍。
作为实施使检测寡核苷酸、生物素化特定寡核苷酸与作为目标DNA区域或由目标 RNA区域制作的DNA的被测寡核苷酸的结合物结合到支撑体上而获得检测复合物的过程的
31方法，并不限于前述的方法，只要是使用免疫抗体法的方法即可。例如，ELISA法中，使用与层析条法同样的原理，因而可以按照记载的顺序实施使被测寡核苷酸、特定寡核苷酸与检测寡核苷酸形成结合物并结合到支撑体上的过程。
本发明方法的第一步骤中，优选利用存在高浓度钠盐的体系来抽提样本DNA。具体而言，作为本发明方法的第一步骤中用于获得样本DNA的DNA抽提操作中使用的溶液(例如，缓冲液)中的钠盐的浓度，可以列举至少50mM以上、优选IOOmM以上。更具体而言，可以列举50mM以上且IOOOmM以下、优选IOOmM以上且IOOOmM以下、更优选IOOmM以上且200mM 以下。另外，如果是含有钠离子的盐，则可以是包括NaCl、NaC03> Na2SO4等在内的任何一种盐，可以优选列举NaCl。
本发明为一种挑选癌症患者来源的样本的方法，其中，包括如下步骤当使用受试者来源的样本并通过发明1 13中任一项所述的方法定量或检测的DNA的定量结果或检测结果、与使用健康人来源的样本并通过相同方法定量或检测的DNA的定量结果或检测结果之间存在显著差异时，将受试者来源的样本评价为癌症患者来源的样本，并基于该评价的结果确定癌症患者来源的样本。作为该发明的优选方式，可以列举样本为哺乳动物来源的血清的发明、以及具有目标DNA区域的DNA为哺乳动物来源的血清中的具有目标DNA区域的游离DNA的发明。如果利用这些发明，则通过血液检查应该能够简便地确定癌症患者。
在此，“癌症患者”表示发生了癌症的受试者，作为癌症，包括肺癌(非小细胞肺癌、 小细胞肺癌)、食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌、直肠癌、肝癌(肝细胞癌、胆管细胞癌)、 胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、结肠癌、肛门癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巣癌、外阴癌、阴道癌、前列腺癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、上颂窦癌、舌癌、(鼻、口、 下)咽癌、喉癌、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓增生异常综合症、甲状腺癌、脑肿瘤、骨肉瘤、皮肤癌(基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌)等在人及哺乳类的脏器中发生的实体癌和在人及哺乳类的血液中发生的非实体癌的任何一种癌。
这样的本发明中的甲基化寡核苷酸等，作为检测用试剂盒的试剂是有用的。另外， 本发明的方法的专利保护范围也包括利用该方法的实质性原理而得到的前述的检测用试剂盒形态的应用。
实施例 以下，通过实施例详细地说明本发明，但是本发明不限于这些实施例。
实施例1 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20μ L、限制性内切酶)(SpI 10U、XspI的最适IOX缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的LINEl区域中设计的目标DNA区域(X、序列号1、相当于 Genbank收录号M80340所示的碱基序号1142-1473的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域X结合的、 含有序列号4所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸Bi，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域X、通过互补性与目标DNA区域X结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号5所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ1，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 X 5'- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACG TGAAGAA TGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAAT GAAATGA AGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACT ATGTGAA AAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACAC TCTGCAG GATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC-3，(序列号 1) <5’末端生物素化寡核苷酸> Bl :5，-GGCTCCTGAGGCTTCTGCAT-3，(序列号 4) <甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Ml :5，-TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 5) 添加上述所得的基因组DNA的反应液30 μ L、特定寡核苷酸溶液10 μ L、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM二硫苏糖醇)10 μ LUOOmMMgCl2溶液10yL、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板(strip)中，在室温下放置约30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L 洗涤缓冲液[含 0. 05 % Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaClpH7. 4)]洗涤 3 次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
其结果如图1所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A(人血液来源的基因组DNA 500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例2 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20μ L、限制性内切酶)(SpI 10U、XspI的最适IOX缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的LINEl区域中设计的目标DNA区域(Y、序列号2、相当于 Genbank收录号M80340所示的碱基序号26924958的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域Y结合的、 含有序列号6所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸B2，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域Y的、通过互补性与目标DNA区域Y结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号7所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ2，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 Y 5'- TAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAGCCGCTCAACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGA ATGACTA CTGGGTACATAACGAAATGAAGGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAACGAGAACAAAGACACCAC ATACCAG AATCTCTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGGGAAATTTATAGCACTAAATGCCTACAAGAGAAAG CAGGAAA GATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAAC -3，(序列号 2) <5’末端生物素化寡核苷酸> B2 :5，-CCAGTAGTCATTCAGGAGCAG-3，(序列号 6) 〈甲基化寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
M2 :5，-TGAGTGAGATTCTTAATCCTGAGNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 7) 添加上述所得的基因组DNA的反应液30 μ L、特定寡核苷酸溶液10 μ L、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM二硫苏糖醇)10 μ LUOOmMMgCl2溶液10yL、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(S卩，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约 30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液 [含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaClpH7. 4)] 洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImMKH2PO4、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L 洗涤缓冲液[含 0. 05 % Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaClpH7. 4)]洗涤 3 次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图2所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA 500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例3 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
35 溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20μ L、限制性内切酶)(SpI 10U、XspI的最适IOX缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的LINEl区域中设计的目标DNA区域(X、序列号1、相当于 Genbank收录号M80340所示的碱基序号1142-1473的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域X结合的、 含有序列号8所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸B3，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域X的、通过互补性与目标DNA区域X结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号5所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ1，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 X 5'- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACG TGAAGAA TGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCMTGGAAGATGAAATGAAT GAAATGA AGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACT ATGTGAA AAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACAC TCTGCAG GATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC-3 ‘(序列号 1) <5’末端生物素化寡核苷酸> Β3 :5，-TCAGGTACACCAATCAGACGTA-3，(序列号 8) <甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Ml :5，-TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 5) 添加上述所得的基因组DNA的反应液30 μ L、特定寡核苷酸溶液10 μ L、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM二硫苏糖醇)10 μ LUOOmMMgCl2溶液10yL、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约 30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液 [含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaClpH7. 4)] 洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图3所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA 500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例4 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20μ L、限制性内切酶)(SpI 10U、XspI的最适IOX缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的LINEl区域中设计的目标DNA区域(X、序列号1、相当于 Genbank收录号M80340所示的碱基序号1142-1473的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域X结合的、 含有序列号8所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸B3，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域X的、通过互补性与目标DNA区域X结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号9所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ3，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 X 5'- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACG TGAAGAA TGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAAT GAAATGA AGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACT ATGTGAA AAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACAC TCTGCAG GATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC-3，(序列号 1) <5’末端生物素化寡核苷酸> B3 :5，-TCAGGTACACCAATCAGACGTA-3，(序列号 8) <甲基化寡核苷酸>N表示甲基化胞嘧啶。
M3 :5，-ATCGGCTCCTGAGGCTTCTGNANANANANANANANANANANANA-3'(序列号 9) 添加上述所得的基因组DNA的反应液30 μ L、特定寡核苷酸溶液10 μ L、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM Mg0Ac2、5mM二硫苏糖醇)10 μ LUOOmMMgCl2溶液10yL、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约 30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液 [含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaClpH7. 4)] 洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImMKH2PO4、3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L 洗涤缓冲液[含 0. 05 % Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaClpH7. 4)]洗涤 3 次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图4所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例5 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20μ L、限制性内切酶)(SpI 10U、XspI的最适IOX缓冲液 (200mM Tris-HCl pH 8. 5、IOOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、IOOOmM KCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的LINEl区域中设计的目标DNA区域(X、序列号1、相当于 Genbank收录号M80340所示的碱基序号1142-1473的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域X结合的、 含有序列号8所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸B3，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域X的、通过互补性与目标DNA区域X结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号5所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Ml，并且，作为通过互补性与目标DNA区域X结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号9所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ3，分别制备各检测寡核苷酸的浓度为0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 X 5'- TAGAATATCCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACCAAGGCTCGAGAACTACG TGAAGAA TGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAAT GAAATGA AGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTCCAAGAAATATGGGACT ATGTGAA AAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACAC TCTGCAG GATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATC-3 ‘(序列号 1) <5’末端生物素化寡核苷酸> Β3 :5，-TCAGGTACACCAATCAGACGTA-3，(序列号 8) <甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Ml :5，-TAAGCACTTCTCTGTATTGGATATNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 5) <甲基化寡核苷酸>N表示甲基化胞嘧啶。
M3 :5，-ATCGGCTCCTGAGGCTTCTGNANANANANANANANANANANANA-3'(序列号 9) 添加上述所得的反应液30yL、特定寡核苷酸溶液10yL、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约 30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液 [含有 0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)] 洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[PerkinElmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图5所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA 500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例6 对于自Clontech公司购入的人血液来源的基因组DNA，制备以下的TE缓冲溶液各两份。
溶液A 人血液来源的基因组DNA 500ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液B 人血液来源的基因组DNA 50ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液C 人血液来源的基因组DNA 5ng/20 μ L TE缓冲溶液 溶液D 人血液来源的基因组DNA 0ng/20 μ L TE缓冲溶液(阴性对照液) 将上述制备的各溶液20 μ L、限制性内切酶MspI 4U、MspI的最适IOX缓冲液 (IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、500mM NaCl) 5 μ 1 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ 1。将该反应液在37°C孵育1小时。
在作为人转座子已知的Alu区域中设计的目标DNA区域(Z、序列号3、相当于 Genbank收录号AF458110所示的碱基序号178-262的区域)，在人基因组DNA上存在多个。 作为用于获得该目标DNA区域的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域Z结合的、 含有序列号10所示的碱基序列的5’末端生物素化寡核苷酸B4，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE 缓冲溶液。另外，作为用于检测目标DNA区域Z的、通过互补性与目标DNA区域Z结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号11所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ4，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 Z :5， _ CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAG GAGATCG AGACCATCC-3，(序列号 3) <5’末端生物素化寡核苷酸> Β4 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列号 10) <甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Μ4 5，-GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 11) 添加上述所得的反应液30yL、特定寡核苷酸溶液10yL、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C加热10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板中，在室温下放置约 30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液 [含有 0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)] 洗涤3次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公
41司制、0. 05μ g/mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图6所示。人血液来源的基因组DNA的溶液A(人血液来源的基因组DNA 500ng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA 50ng)和溶液C (人血液来源的基因组DNA 5ng), 与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong:对照溶液)相比荧光强度增加，其程度是浓度依赖性的。
本实施例中表明，目标DNA区域被特定寡核苷酸和具有甲基胞嘧啶抗体可结合的部位的检测寡核苷酸选择而形成复合物，通过对其进行检测和定量，能够检测和定量目标 DNA区域。另外还表明，通过检测和定量目标DNA区域，能够进行基因组DNA的检测和定量。
实施例7 作为血清样品，如下所述制备人血液来源的基因组DNA(人基因组DNA、#636401、 Clontech公司)的TE缓冲溶液与采自大鼠(Wistar Hannover)的血清的混合液各四份。
血清样品A 人血液来源的基因组DNA 100ng/10yL TE缓冲溶液+大鼠血清 10 μ L 血清样品B 人血液来源的基因组DNA 10ng/10yL TE缓冲溶液+大鼠血清10 μ L 血清样品C 人血液来源的基因组DNA lng/10 μ L TE缓冲溶液+大鼠血清10 μ L 血清样品D 人血液来源的基因组DNA 0ng/10yL TE缓冲溶液+大鼠血清 10 μ L (阴性对照液) 对上述制备的血清样品A D，以各两份进行以下所示的处理1或处理2。
处理1 将血清样品20μ L、缓冲液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmMMgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 4 μ L混合，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为40 μ L，并混合。然后， 将该PCR管在95°C保温10分钟、在4°C保温10分钟后，恢复到室温。以9100g离心10分钟后，回收上清。
处理2 将血清样品20μ L、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐(pH 7. 9), IOOmMMg(OAc)2, 5mM DTT, 660mM KOAc) 4 μ L混合，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为40 μ L，并混合。然后，将该PCR管在95°C保温10分钟、在4°C保温10分钟后，恢复到室温。以9100g离心10 分钟后，回收上清。
将通过上述处理1或处理2制备的溶液20 μ L、限制性内切酶MspI4U、MspI的最适 10X 缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、IOmM二硫苏糖醇、500mM NaCl) 5 μ L 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ L，制备各反应液。将该反应液在37°C孵育1小时。
作为用于获得在作为人转座子已知的Alu区域中设计的、含有序列号3所示的碱基序列的目标DNA区域(Z、序列号3、相当于Genbank收录号AF458110所示的碱基序号178-262的区域)的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域Z结合的、含有序列号 10所示的碱基序列的5’末端生物素标记寡核苷酸B4，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 Z :5， _ CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAG GAGATCG AGACCATCC-3，(序列号 3) <5’末端生物素标记寡核苷酸> Β4 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列号 10) 作为用于检测目标DNA区域Z的、通过互补性与目标DNA区域Z结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号11所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸Μ4，制备0. 2pmol/10 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Μ4 5，-GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 11) 添加上述所得的反应液30yL、特定寡核苷酸溶液10yL、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C保温10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板(Mr印taWell、 #11645692001、Roche公司)中，在室温下放置约30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含有0.05% Tween20的磷酸缓冲液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 · 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)]洗涤 3 次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 · 7H20U54mM NaCl pH 7. 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[PerkinElmer公司制、0. 05μ g/mL 含 0. 1% BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含有 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO ·7Η20、154ι Μ NaCl pH 7.4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图7和图8所示。在处理1的情况下，人血液来源的基因组DNA的溶液A(人血液来源的基因组DNA lOOng)、溶液B(人血液来源的基因组DNA IOng)和溶液C(人血液来源的基因组DNA Ing)，与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong 对照溶液)相比荧光强度呈浓度依赖性增加(图7)。另一方面，在处理2的情况下，人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA IOOng)与溶液D (人血液来源的基因组DNA Ong 对照溶液)相比荧光强度增加，但溶液B(人血液来源的基因组DNA IOng)和溶液C(人血液来源的基因组DNAlng)中未见荧光强度的增加。
本实施例中表明，通过形成、选择甲基胞嘧啶抗体、甲基化寡核苷酸与5’末端生物素标记寡核苷酸的复合物，并利用甲基胞嘧啶抗体的功能检测复合物中的甲基胞嘧啶抗体，能够以良好的灵敏度检测、定量血清中的人基因组DNA。另外，与处理2相比，通过处理 1能够以更好的灵敏度检测血清中的人基因组DNA。
实施例8 作为血清样品，如下所述制备人血液来源的基因组DNA(人基因组DNA、#636401、 Clontech公司)的TE缓冲溶液与购自Kohjin生物公司的人血清(不同个体人血清 individual human serums)的混合液各四份。
血清样品A 人血液来源的基因组DNA 10ng/10 μ L TE缓冲溶液+人血清40 μ L 血清样品B 人血液来源的基因组DNA lng/10 μ L TE缓冲溶液+人血清40 μ L 血清样品C 人血液来源的基因组DNA 0ng/10 μ L TE缓冲溶液+人血清40 μ L (阴性对照液) 对上述制备的血清样品A D，以各两份进行以下所示的处理1或处理2。
处理1 将血清样品50μ L、缓冲液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmMMgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 20 μ L混合，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后， 在95°C保温10分钟、在4°C保温10分钟后，恢复到室温。以9100g离心10分钟后，回收上清。
处理2 将血清样品50μ L、缓冲液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmM MgCl2, IOmM DTT, IOOOmM NaCl) 10 μ L混合，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为100 μ L，并混合。然后， 在95°C保温10分钟、在4°C保温10分钟后，恢复到室温。以9100g离心10分钟后，回收上清。
将通过上述处理1或处理2制备的各溶液20yL、限制性内切酶MspI 2U、MspI 的最适 IOX 缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、500mM NaCl) 5 μ L混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ L。将该反应液在37°C孵育1小时。
作为用于获得在作为人转座子已知的Alu区域中设计的、含有序列号3所示的碱基序列的目标DNA区域(Z、序列号3、相当于Genbank收录号AF458110所示的碱基序号 178-262的区域)的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域Z结合的、含有序列号 10所示的碱基序列的5’末端生物素标记寡核苷酸B4，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 Z :5，- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCG AGACCATCC-3，(序列号 3) <5’末端生物素标记寡核苷酸> B4 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列号 10) 另外，作为用于检测目标DNA区域Z的、通过互补性与目标DNA区域Z结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号11所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸M4，制备0. 2pmol/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈甲基化寡核苷酸〉N表示甲基化胞嘧啶。
Μ4 5，-GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 11) 添加上述所得的反应液30yL、特定寡核苷酸溶液10yL、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C保温10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板(Mr印taWell、 #11645692001、Roche公司)中，在室温下放置约30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20的磷酸缓冲液 (ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 · 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)]洗涤 3 次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. 1 % BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含有0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05 μ g/mL 含 0· BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO ·7Η20、154mMNaCl pH 7. 4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
结果如图9和图10所示。在处理1和处理2的任何一种处理的情况下，人血液来源的基因组DNA的溶液A (人血液来源的基因组DNA IOng)和溶液B (人血液来源的基因组 DNA Ing)，与溶液C (人血液来源的基因组DNAOng 对照溶液)相比荧光强度均呈浓度依赖性增加。
本实施例中表明，通过形成、选择甲基胞嘧啶抗体、甲基化寡核苷酸与5’末端生物素标记寡核苷酸的复合物，并利用甲基胞嘧啶抗体的功能检测复合物中的甲基胞嘧啶抗
45体，能够以良好的灵敏度检测、定量血清中的人基因组DNA。另外，与处理2相比，通过处理 1能够以更好的灵敏度检测血清中的人基因组DNA。
实施例9 作为血清样品，使用以下所示的人血清。
自 Kohjin生物公司购入的人血清(不同个体人血清 批号 N51438(健康人) N51439(健康人) N51441(健康人) 自ProMedDx公司购入的人血清(不同个体人血清) 批号 11171268健康人、56岁、男性) 11171292健康人、62岁、男性) 11171297健康人、67岁、男性) 11171314健康人、75岁、男性) 11171327健康人、70岁、男性) 11202510健康人、67岁、女性) 11202522健康人、64岁、女性) 11202527健康人、52岁、女性) 11202615健康人、75岁、女性) 11202618健康人、78岁、女性) 10958886健康人、56岁、男性) 10958979健康人、39岁、男性) 10958980健康人、45岁、男性) 10960268健康人、37岁、男性) 10960272健康人、50岁、男性) 10960276健康人、30岁、男性) 10960285健康人、39岁、男性) 11003457健康人、38岁、男性) 11003479健康人、51岁、男性) 11003480健康人、48岁、男性) 11324997健康人、59岁、男性) 11325001健康人、61岁、男性) 10325022健康人、61岁、男性) 11325032健康人、60岁、男性) 11325062健康人、69岁、男性) 10870623乳腺癌患者、33岁、女性) 10929521乳腺癌患者、阳岁、女性) 10989644乳腺癌患者、45岁、女性) 11209430乳腺癌患者、80岁、女性) 10929514乳腺癌患者、57岁、女性) 10843055乳腺癌患者、59岁、女性) 10984680乳腺癌患者、64岁、女性) 11209428乳腺癌患者、阳岁、女性) 10840414肺癌患者、54岁、女性) 10929506肺癌患者、55岁、男性) 11091955肺癌患者、76岁、女性) 11103346肺癌患者、66岁、女性) 11142322肺癌患者、62岁、女性) 11152564肺癌患者、67岁、男性) 11152571肺癌患者、67岁、男性) 11153198肺癌患者、69岁、女性) 11209435肺癌患者、61岁、男性) 11230621肺癌患者、71岁、女性) 11153192肺癌患者、59岁、男性) 10715942肺癌患者、64岁、男性) 10840422肺癌患者、78岁、女性) 10935547前列腺癌患者、83岁、男性) 11000243前列腺癌患者、78岁、男性) 11071226前列腺癌患者、84岁、男性) 对上述的血清样品进行以下所示的处理。
将血清样品20μ L、缓冲液(500mM Tris-HCl (pH 7. 5), IOOmMMgCl2, IOmM DTT， IOOOmM NaCl) 4 μ L混合，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为40 μ L，并混合。然后， 将该PCR管在95°C保温10分钟、在4°C保温10分钟后，恢复到室温。以9100g离心10分钟后，回收上清。
将通过上述处理制备的各溶液20 μ L、限制性内切酶MspI 2U、MspI的最适IOX缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、100mM MgCl2UOmM 二硫苏糖醇、500mM NaCl)5yL 混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为50 μ L0将该反应液在37°C孵育1小时。
作为用于获得在作为人转座子已知的Alu区域中设计的、含有序列号3所示的碱基序列的目标DNA区域(Z、序列号3、相当于Genbank收录号AF458110所示的碱基序号 178-262的区域)的特定寡核苷酸，合成通过互补性与目标DNA区域Z结合的、含有序列号 10所示的碱基序列的5’末端生物素标记寡核苷酸B4，制备0. 2pmoL/10 μ L的TE缓冲溶液。
〈目标DNA区域〉 Z :5，- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAG GAGATCG AGACCATCC-3，(序列号 3) <5’末端生物素标记寡核苷酸〉 B4 :5，-GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3，(序列号 10) 作为用于检测目标DNA区域Z的、通过互补性与目标DNA区域Z结合的检测寡核苷酸，合成12个部位可结合甲基胞嘧啶抗体的、含有序列号11所示的碱基序列的甲基化寡核苷酸M4，制备0. 2pmol/10 μ L的TE缓冲溶液。
<甲基化寡核苷酸>Ν表示甲基化胞嘧啶。
Μ4 5，-GATTACAGGCGTGAGCCACCNANANANANANANANANANANANA-3，(序列号 11) 添加上述所得的反应液30yL、特定寡核苷酸溶液10yL、检测寡核苷酸溶液 10yL、缓冲液(330mM Tris-乙酸盐 pH 7. 9、660mM KOAcUOOmM MgOAc2、5mM 二硫苏糖醇)10 μ L、IOOmM MgCl2溶液10 μ L、lmg/mL BSA溶液10 μ L，再向该混合物中加入灭菌超纯水使液量为IOOyL,并混合。然后，为了使目标DNA区域与特定寡核苷酸形成双链，并且同时使目标DNA区域与检测寡核苷酸形成双链(即，形成含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物)，将上述混合液在95°C保温10分钟，迅速冷却到70°C，并在该温度保温10分钟。然后，冷却到50°C并保温10分钟，再在37°C保温10分钟，然后恢复到室温。
将所得的反应液100 μ L转移到经链霉亲和素包被的8孔条板(Mr印taWell、 #11645692001、Roche公司)中，在室温下放置约30分钟，将含有目标DNA区域、特定寡核苷酸和检测寡核苷酸的检测复合物通过生物素-链霉亲和素结合固定在8孔条板上。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含有0.05% Tween20的磷酸缓冲液 (ImMKH2PO4,3mM Na2HPO4 · 7H20、154mM NaCl pH 7. 4)]洗涤 3 次。
在各孔中添加100 μ L甲基胞嘧啶抗体[Aviva Systems Biology公司制、0. 5 μ g/ mL 含 0. BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO4 ·7Η20、154ι Μ NaCl ρΗ7· 4)溶液]， 在室温下放置1小时。然后，通过倾析除去溶液，将各孔用200 μ L洗涤缓冲液[含0.05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl ρΗ7· 4)]洗涤 3 次。
然后，以100 μ L的比例在各孔中添加Eu-Nl标记小鼠IgG抗体[Perkin Elmer公司制、0. 05 μ g/mL 含 0· BSA 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO · 7H20、154mM NaCl pH7. 4)溶液]后，在室温下放置1小时。放置后，通过倾析除去溶液，将各孔用200yL洗涤缓冲液[含 0. 05% Tween20 的磷酸缓冲液(ImM KH2PO4,3mM Na2HPO ·7Η20、154mMNaCl pH 7. 4)]洗涤3次。
以150 μ L的比例在各孔中添加增强溶液(Perkin Elmer公司制)并混合，在室温下振荡约5分钟。然后，在激发340nm/荧光612nm下测定荧光。
通过实时PCR对上述酶处理(MspI处理)所得到的溶液中的DNA进行定量。
如下所述制备MspI处理的人基因组DNA溶液作为浓度测定用标准样品。制备人血液来源的基因组DNA (人基因组DNA、#636401、Clontech公司)的5ng/μ L TE缓冲溶液，将该溶液20 μ L、限制性内切酶MspI 2U、MspI的最适10X缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5、 IOOmM MgCl2UOmM 二硫苏糖醇、500mM NaCl) 5 μ L混合，并向其中加入灭菌超纯水使液量为 50 μ L，制备用于各处理的反应液。将该反应液在37°C孵育1小时。用TE缓冲液将所得的反应液进行稀释，制备 10_5、10_4、10_3、10_2、10—1、1、lOng/5 μ L 溶液。
为了扩增在作为人转座子已知的Alu区域中设计的目标DNA区域(Ζ、序列号3、相当于Genbank收录号AF458110所示的碱基序号178-262的区域)并通过实时PCR进行定量，设计正向引物(F)和反向引物(R)。
〈目标DNA区域〉 Z :5，- CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCGGATCACGAGGTCAG GAGATCG AGACCATCC-3，(序列号 3) 〈正向引物〉 F :5，-GGTGGCTCACGCCTGTAATC-3，(序列号 16) 〈反向引物〉 R 5' -GGATGGTCTCGATCTCCTGAC-3‘(序列号 1了) 作为PCR的反应液，使用如下反应液将作为模板的上述制备的MspI处理的人基因组DNA溶液5μ L或上述制备的浓度测定用标准样品、分别含有序列号16和序列号 17所示的碱基序列的引物的5 μ M溶液各1. 5μ L、SYBR Green I (Lonza公司)0. IX量、 终浓度各 2mM 的 dNTP 2. 5 μ L、10 XPCR 缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 3、500mM KCl, 15mM MgCl2^O. 01 % 明胶(Gelatin)) 2· 5 μ L、耐热性 DNA 聚合酶(AmpliiTaq Gold，5U/ UL, ABI公司)0. 125 μ L混合，向其中加入灭菌超纯水使液量为25 μ L。实时PCR使用 Mx3005P (Stratagene公司)实施。将该反应液在95°C保温10分钟后，以95 °C /30秒、 61°C /30秒、72°C /45秒为1个循环，重复40个循环，由此扩增目标DNA区域。根据该实时 PCR的结果，对血清样品中的DNA进行定量。
结果如图11和图12所示。将本方法的测定值与实时PCR定量的值进行比较时， 显示出相关性(相关系数R = 0. 88)(图11)。另外，将59岁以下的人血清样品的定量结果按癌症患者和健康人进行比较，结果显示癌症患者的血清中DNA浓度升高(图12)。
产业实用性 根据本发明，可以提供简便地定量或检测具有目标DNA区域的DNA的方法等。
序列表自由文本 序列号4 为固定化而设计的生物素化3S核苷酸 序列号5 设计的寡核苷酸 序列号6 为固定化而设计的生物素化3S核苷酸 序列号7 设计的寡核苷酸 序列号8 为固定化而设计的生物素化3S核苷酸 序列号9 设计的寡核苷酸 序列号10 为固定化而设计的生物素化3S核苷酸 序列号11 设计的寡核苷酸 序列号12 设计的寡核苷酸 序列号13 设计的寡核苷酸 序列号14 设计的寡核苷酸 序列号15 设计的寡核苷酸 序列号16 为进行扩增而设计的3S核苷酸 序列号17 为进行扩增而设计的3S核苷酸
权利要求
1.一种DNA的定量或检测方法，所述DNA为样本中所含的、具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，所述方法的特征在于，包括如下步骤(1)第一步骤，制备含有被测寡核苷酸的样本，所述被测寡核苷酸为具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA;(2)第二步骤，将第一步骤中制备的样本中含有的被测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的检测寡核苷酸、能够与该被测寡核苷酸互补结合的特定寡核苷酸和能够与该特定寡核苷酸结合的支撑体混合，形成含有该被测寡核苷酸、该检测寡核苷酸、该特定寡核苷酸和该支撑体的检测复合物；和(3)第三步骤，利用检测寡核苷酸的识别功能对第二步骤中形成的检测复合物中所含的检测寡核苷酸进行检测，由此对所述具有目标DNA区域的DNA进行定量或检测。
2.如权利要求1所述的方法，其中，检测寡核苷酸为包含多个甲基化位点的、含有多个寡核苷酸的复合检测寡核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，检测寡核苷酸的识别功能为与检测寡核苷酸的甲基化DNA结合的甲基化DNA抗体的识别功能。
4 如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，含有构成基因组中的重复序列的碱基序列或其一部分。
5.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，是含有基因组中的重复基因或假基因的碱基序列或其一部分的DNA。
6.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，具有基因组中存在多个的目标DNA区域的DNA，是含有分类为LINE或Alu序列的碱基序列的DNA。
7.如权利要求4所述的方法，其中，构成基因组中的重复序列的碱基序列含有以下所示的任一碱基序列(1)序列号1表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(2)序列号2表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、或(3)序列号3表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
8.如权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸具有以下所示的任一碱基序列(1)序列号1表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(2)序列号1表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(3)序列号2表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(4)序列号2表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(5)序列号3表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(6)序列号3表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(7)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(8)序列号4表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(9)序列号6表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(10)序列号6表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(11)序列号8表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(12)序列号8表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(13)序列号10表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(14)序列号10表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(15)序列号12表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(16)序列号12表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(17)序列号13表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(18)序列号13表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(19)序列号14表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(20)序列号14表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(21)序列号15表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、或(22)序列号15表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
9.如权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，特定寡核苷酸具有以下所示的任一碱基序列(1)序列号1表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(2)序列号1表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(3)序列号2表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(4)序列号2表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(5)序列号3表示的碱基序列的部分序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(6)序列号3表示的碱基序列的部分序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(7)序列号4表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(8)序列号4表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(9)序列号6表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(10)序列号6表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(11)序列号8表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(12)序列号8表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(13)序列号10表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(14)序列号10表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(15)序列号12表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(16)序列号12表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(17)序列号13表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(18)序列号13表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(19)序列号14表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(20)序列号14表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、(21)序列号15表示的碱基序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列、或(22)序列号15表示的碱基序列的互补序列或与其具有80%以上的序列同源性的碱基序列。
10.如权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸为含有甲基化胞嘧啶的甲基化寡核苷酸。
11.如权利要求1 10中任一项所述的方法，其中，检测寡核苷酸的识别功能为甲基胞嘧啶的检测、利用甲基化DNA抗体进行的检测或利用甲基胞嘧啶抗体进行的检测。
12.如权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，样本为下述任何一种样本(a)哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液或组织裂解液、(b)从由哺乳动物来源的血液、体液、粪尿、体分泌物、细胞裂解液和组织裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的DNA、(c)以从由哺乳动物来源的组织、细胞、组织裂解液和细胞裂解液组成的组中选择的一种物质中抽提的RNA为模板制作的DNA、(d)从细菌、真菌或病毒中抽提的DNA、或(e)以从细菌、真菌或病毒中抽提的RNA为模板制作的DNA。
13.如权利要求1 12中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的生物来源DNA 样本为下述任意一种具有目标DNA区域的DNA (a)预先用不以目标DNA区域作为识别切割位点的限制性内切酶进行消化处理后得到的 DNA、(b)预先进行纯化后得到的具有目标DNA区域的DNA、(c)血液中的具有目标DNA区域的游离DNA、(d)微生物基因组来源的具有目标DNA区域的DNA、或(e)利用逆转录酶从RNA生成的具有目标DNA区域的DNA。
14.如权利要求1 13中任一项所述的方法，其中，第一步骤中用于制备样本DNA的 DNA抽提操作中使用的溶液中的钠盐的浓度为IOOmM以上、IOOOmM以下。
15.如权利要求1 13中任一项所述的方法，其中，第一步骤中用于制备样本DNA的 DNA抽提操作中使用的溶液中的钠盐的浓度为IOOmM以上、200mM以下。
16.一种挑选癌症患者来源的样本的方法，其中，包括如下步骤当使用受试者来源的样本并通过权利要求1 15中任一项所述的方法定量或检测的 DNA的定量结果或检测结果、与使用健康人来源的样本并通过相同方法定量或检测的DNA 的定量结果或检测结果之间存在显著差异时，将受试者来源的样本评价为癌症患者来源的样本，并基于该评价的结果确定癌症患者来源的样本。
17.如权利要求16所述的方法，其中，样本为哺乳动物来源的血清。
18.如权利要求16 17中任一项所述的方法，其中，具有目标DNA区域的DNA为哺乳动物来源的血清中的具有目标DNA区域的游离DNA。
全文摘要
本发明涉及样本中所含的具有目标DNA区域的DNA的定量或检测方法等。
文档编号G01N33/53GK102186991SQ20098014074
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月18日 优先权日2008年8月19日
发明者冨原祥隆, 佐藤日出夫, 樽井弘和 申请人:住友化学株式会社
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