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专利名称：一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品中葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法。
背景技术：
食品安全已成为全球关注的焦点，在我国存在着严峻和突出的问题。葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒的重要生物毒素，也是较常用的生物战剂；伏马菌素对玉米及其制品的污染可能与人类食管癌的高发率有关，是国际上认为的一种具有重大卫生学意义的真菌毒素。目前，并没有一种简单可靠的方法对其进行检测。常用的生物毒素检测方法有HPLC、 GC-MS, ELISA和胶体金免疫层析法等。HPLC和GC-MS由于是实验室确证方法，具有定量检测准确、重复性好，灵敏度高的优点，但操作复杂，需要专业技术人员操作限制了其应用； ELISA和胶体金免疫层析法操作简单快速，但只能适用于大规模筛查，对于定量检测仍存在假阳性。免疫芯片又称蛋白芯片(Protein Chip)，是指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。该技术与传统的检测方法与传统的检测方法相比，有着一定的优越性，因此，日益受到青睐。该研究是以伏马毒素Bi、葡萄球菌肠毒素A、B为检测对象，建立用于伏马毒素 Bl、葡萄球菌肠毒素A、B检测的免疫芯片的技术方法。本研究先将抗原或抗体固定在醛基化玻片表面，利用经戊二醛等试剂处理过的表面带有醛基的玻璃片作为载体，通过载体表面的醛基与抗原或抗体的游离氨基的结合实现抗原或抗体的固定。在检测伏马毒素B1时采用抗体竞争法。检测时将待测物伏马毒素B1与一定量的 Cy3标记的伏马毒素B1-牛血清白蛋白同时加到玻片上。待测物伏马毒素B1与标记的伏马毒素B1-牛血清白蛋白竞争结合玻璃片上固定的抗体。由于标记物是定量的，当待测物浓度越高则结合上的伏马毒素B1越多，而结合上的标记物就越少，从而荧光信号强度就越弱。 反之，荧光信号就越强，从而实现了待测物的测定。最低检测限为lPg/mL的伏马毒素Bp在检测葡萄球菌肠毒素A、B时采用双抗体夹心法。对影响免疫芯片检测结果的实验条件进行了优化，检测时将SEA、SEB加入反应池中，反应后清洗掉未结合的SE，再加入相应的标记抗体，形成固定抗体-待测物-标记抗体的夹心式结构。当待测物越多时，结合上的抗原就多，相应结合上的标记抗体也越多，产生的荧光信号也越强，荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加，当浓度高于一定值时，荧光信号强度趋于一定值。并实现了在同一张芯片上同时检测葡萄球菌肠毒素A、B,按优化后的条件检测SEA、SEB,最低检测限均为 0.001 μ g/mLo本研究表明随着实验的深入及蛋白质芯片各项技术的进步与成熟，免疫芯片技术正成为食品安全快速检测中主要发展方向和非常重要的检测手段之一。可以预见这一高新技术将应用于更广的领域
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法。本发明要解决的技术问题是克服现有生物毒素葡萄球菌肠毒素和伏马菌素检测耗时长，步骤繁琐的缺点，先将抗原或抗体固定在醛基化玻片表面，利用经戊二醛等试剂处理过的表面带有醛基的玻璃片作为载体，通过载体表面的醛基与抗原或抗体的游离氨基的结合实现抗原或抗体的固定，将待测生物毒素与标记的毒素完全抗原竞争结合玻璃片上固定的抗体，并进行灵敏，快速的检测。其特征包含以下步骤(1)醛基化玻片的活化(2)兔血清中抗体的提取及浓度测定(3)肠毒素抗体和FB1完全抗原的荧光染料Cy3标记(4)实验条件优化(5)免疫芯片检测所述的免疫芯片检测对象为伏马毒素Bi、葡萄球菌肠毒素A、B中的一种或多种； 所述的伏马毒素Bi、葡萄球菌肠毒素A、B的最低检出浓度达到最低检测限为1 μ g/mL和 0.001 μ g/mLο所述步骤(1)中醛基化玻片的制备步骤如下采用硅烷作为表面活性剂使玻璃片表面氨基化，氨基可以和双功能试剂戊二醛结合，戊二醛与抗体偶合，从而实现识别分子(抗体)的固定。活化步骤如图1所示。所述步骤O)中兔血清中抗体的提取及浓度测定中，兔抗SEA抗体为2. 84mg/mL, 兔抗SEB抗体为3. 2%ig/mL，抗体于_20°C冰箱分装保存。所述步骤(3)中完全抗原的标记及标记物的鉴定中，在实验中用Cy3标记兔抗 SEA,SEB两种抗体，用Cy3标记伏马毒素&-BSA。Cy3染料是一种水溶性的单功能NHS-酯， 激发后可产生很强的荧光，用于标记带有游离氨基的化合物，是目前在芯片中较多使用的一类染料。每管染料可以标记Img蛋白质。每管染料加50μ L的DMF摇勻，于4°C冰箱中避光保存。所述步骤中实验条件优化中，PBS实验条件的优化，选用pH7. 2的0. 01mol/L PBS ；封闭液选用25%胎牛血清为封闭液；抗体的固定时间选定为Ih ；封闭时间选择为池； 抗原抗体反应时间选择为池。本发明的优点提供了一种检测生物毒素的免疫芯片，简单、快速，应用范围广，稳定性高等优点，而且节约实验成本，为快速检测生物毒素葡萄球菌肠毒素和伏马菌素提供了一种简单实用的新方法，为建立免疫芯片高通量的生物毒素检测技术平台奠定了基础。


图1为醛基化玻片的活化。图2为对不同浓度SEA ( μ g/mL)检测芯片图。图3对不同浓度SEB ( μ g/mL)检测芯片图。图4对不同浓度FB1 ( μ g/mL)检测芯片图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 制备可同时检测SEA和SEB的免疫蛋白芯片
实验方法如下(1)按照图1对醛基化玻片进行活化。(2) 2兔血清中抗SEA、SEB抗体的提取及浓度测定2. 1称取400g分析纯(AR)结晶硫酸铵，溶解于预热到70_80°C的500ml蒸馏水中， 搅拌2小时左右，冷却至室温，底部便有结晶析出，此液即为饱和硫酸铵溶液。用氨水调PH至7.0。2. 2取上述饱和硫酸铵溶液10ml，调节PH值至5 6，过滤后取7ml，加入蒸馏水 :3ml，配置成饱和度为70%的硫酸铵溶液。2. 3在0. 5ml的家兔血清中不断搅拌滴入0. 5ml的70%的硫酸铵溶液，然后将此混合液置于4°C下过夜沉淀。继而在4°C下ISOOg离心30min，去上清。经倾析和弃去上清液，用蒸馏水在不断搅拌下加至0. 5mL，再不断搅拌滴入0. 5ml的70%的硫酸铵溶液，室温下沉淀4小时，1800g离心30min，去上清。再加蒸馏水至0. 5ml，加70%的硫酸铵溶液 0. 5mL，4°C离心去上清。2. 4得到的蛋白溶液对反复更换的0. 145mol/L NaCl溶液(PH8. 0)进行透析，直到不含硫酸根为止。注对提取后抗体浓度依据下面的公式进行测定蛋白浓度C(mg/ml) = 1. 45XOD280-O. 74XOD260(OD260代表核酸在260nm处的光密度)(OD280代表蛋白质在^Onm处的光密度)2. 5经测定兔抗SEA抗体为2. 8%ig/mL，兔抗SEB抗体为3. 2%ig/mL，抗体于_20°C 冰箱分装保存。(3) SEA、SEB肠毒素抗体和FB1-BSA的荧光染料Cy3的标记3. 1. 1将待标记的抗体和完全抗原溶于0. 01mol/L, pH7. 2的磷酸盐缓冲溶液中， 浓度为lmg/mL。 3.1.2将上述抗体和完全抗原取200 μ L，加入IOyL DMF混勻的Cy3染料混合好， 密封，通过轻轻摇晃或将带盖的试管放到旋涡混合器轻轻震荡以达到充分的混合。在混勻的过程中要防止抗体溶液产生泡沫，将小瓶在室温下放置30-40min，每IOmin摇勻一次。3. 1. 3准备好kphadex G-50凝胶过滤柱，用0. 01mol/L, pH7. 2的PBS缓冲液在 4°C层析柜进行柱的预平衡。3. 1.4将标记好的的抗体和完全抗原溶液加到凝胶过滤柱中进行过滤，分离用 Cy3标记兔抗SEA、SEB和FB1-BSA时，快速移动的红色领头部分即是标记有Cy3的抗体和完全抗原。3. 1. 5将标记好的抗体完全抗原分装保存于4°C冰箱中。(4)三种毒素抗体在芯片上的固定4. 1用O.Olmol/L pH7. 2的PBS分别稀释三种毒素抗体，然后用点样仪将三种抗体点样加于醛基化玻片的表面，每点约^iL,于37°C饱和湿度下放置0. 5h，然后用洗液冲洗5 次，每次10s，再用蒸馏水冲洗2 5次，晾干。4. 2在固定三种抗体的格中滴加封闭液，37°C饱和湿度下放置0. 5h，然后用蒸馏水冲洗2次，每次10s，晾干，4°C保存。
实施例2 葡萄球菌肠毒素的免疫芯片检测方法(1)加入标准品在芯片的各检测格中分别滴加20μ L不同浓度的SEA、SEB毒素溶液，37°C温育池， 冲洗同上，然后再加入Cy3标记的兔抗SEA、SEB抗体，37°C温育2h，按上法冲洗，扫描仪扫描。(2)信号的荧光检测及数据处理抗原抗体反应或抗体竞争反应完毕后，用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000B检测，荧光信号定量采用软件GenePix Pro 4. 0进行分析。扫描结果如图2和图3所示。实施例3 对伏马菌素FB1的免疫芯片检测方法(1)将待测物FB1 (分别取不同浓度FB1 1，10，50，100，200 μ g/ml)，与一定量的 Cy3标记的FB1-BSA等量混勻，取22 μ 1的混合液滴加于固定有抗FB1抗体的玻璃片格中， 于37°C饱和湿度下放置浊，然后用PBS洗液冲洗5次，用蒸馏水冲洗3次，晾干。(2)信号的荧光检测及数据处理抗原抗体反应或抗体竞争反应完毕后，用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000B检测，荧光信号定量采用软件GenePix Pro 4. 0进行分析。扫描结果如图4所示。
权利要求
1.一种葡萄球菌肠毒素和伏马菌素的免疫芯片检测方法，所述的免疫芯片检测对象为伏马毒素Bi、葡萄球菌肠毒素A、B中的一种或多种；其特征是包括如下步骤(1)醛基化玻片的活化采用硅烷作为表面活性剂使玻璃片表面氨基化，氨基可以和双功能试剂戊二醛结合， 戊二醛与抗体偶合，从而实现识别分子(抗体)的固定。(2)兔血清中抗体的提取及浓度测定·2.1称取400g分析纯(AR)结晶硫酸铵，溶解于预热到70-80°C的500ml蒸馏水中，搅拌2小时左右，冷却至室温，底部便有结晶析出，此液即为饱和硫酸铵溶液。用氨水调 PH 至 7. 0。·2. 2取上述饱和硫酸铵溶液10ml，调节PH值至5 6，过滤后取7ml，加入蒸馏水:3ml， 配置成饱和度为70%的硫酸铵溶液。·2. 3在0. 5ml的家兔血清中不断搅拌滴入0. 5ml的70%的硫酸铵溶液，然后将此混合液置于4°C下过夜沉淀。继而在4°C下ISOOg离心30min，去上清。经倾析和弃去上清液，用蒸馏水在不断搅拌下加至0. 5ml，再不断搅拌滴入0. 5ml的70%的硫酸铵溶液，室温下沉淀 4小时，1800g离心30min，去上清。再加蒸馏水至0. 5ml，加70%的硫酸铵溶液0. 5ml,4°C 离心去上清。·2. 4得到的蛋白溶液对反复更换的0. 145mol/L NaCl溶液(PH8. 0)进行透析，直到不含硫酸根为止注对提取后抗体浓度依据下面的公式进行测定蛋白浓度 C(mg/ml) = 1.45XOD280-O. 74XOD260(OD260代表核酸在^Onm处的光密度)(OD280代表蛋白质在280nm处的光密度)·2.5经测定兔抗SEA抗体为2. 8%ig/mL，兔抗SEB抗体为3. 2%ig/mL，抗体于_20°C冰箱分装保存。(3)肠毒素抗体和FB1完全抗原的荧光染料Cy3标记·3.1. 1将待标记的抗体和完全抗原溶于0. 01mol/L, pH7. 2的磷酸盐缓冲溶液中，浓度为 lmg/mL0·3. 1. 2将上述抗体和完全抗原取200 μ L，加入10 μ L DMF混勻的Cy3染料混合好，密封， 通过轻轻摇晃或将带盖的试管放到旋涡混合器轻轻震荡以达到充分的混合。在混勻的过程中要防止抗体溶液产生泡沫，将小瓶在室温下放置30-40min，每IOmin摇勻一次。·3·. 1. 3准备好S印hadex G-50凝胶过滤柱，用0. 01mol/L，pH7. 2的PBS缓冲液在4°C层析进行柱的预平衡。·3. 1. 4将标记好的的抗体和完全抗原溶液加到凝胶过滤柱中进行过滤，分离用Cy3标记兔抗SEA、SEB和FB1-BSA时，快速移动的红色领头部分即是标记有Cy3的抗体和完全抗原。·3. 1. 5将标记好的抗体完全抗原分装保存于4°C冰箱中。(4)实验条件优化实验条件优化中，PBS实验条件的优化，选用pH7. 2的0. 01mol/L PBS ；封闭液选用25% 胎牛血清为封闭液；抗体的固定时间选定为Ih ；封闭时间选择为池；抗原抗体反应时间选择为池。(5)免疫芯片检测 5. 1加入标准品在芯片的各检测格中分别滴加20 μ L不同浓度的毒素溶液，37°C温育池，冲洗同上，然后再加入Cy3标记的相对应的抗体，37°C温育池，冲洗，扫描仪扫描。 (2)信号的荧光检测及数据处理抗原抗体反应或抗体竞争反应完毕后，用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000B检测，荧光信号定量采用软件GenePix Pro 4. 0进行分析。
全文摘要
本发明涉及一种葡萄球菌肠毒素(SEA、SEB)和伏马菌素(AFB1)的免疫芯片检测方法，实现了在同一张芯片上的同时检测。检测AFB1是在醛基化玻璃片表面固定其单抗，并与一定量的Cy3标记的完全抗原同时加到芯片上，采用竞争法进行免疫芯片的技术研究。在检测SEA、SEB时采用双抗体夹心法，并进行了实验条件的优化，检测时将SEA、SEB加入反应池中，反应后清洗掉未结合的SE，再加入相应的标记抗体，形成固定抗体-待测物-标记抗体的夹心式结构，荧光信号强度随待测物浓度的增加而增加。该方法操作简单，灵敏快速，成本低廉，结果获得稳定可靠，整个检测过程仅耗时1～2小时，为多种生物毒素的快速检测提供了新方法。
文档编号G01N33/552GK102455356SQ201010523848
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者刘楠, 左小霞, 高志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所