专利名称：Sfrp-3在评价心力衰竭中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种评估个体心力衰竭的方法，该方法包括以下步骤a)测量从个 体获得的样品中标记分泌型卷曲相关蛋白3(SFRP_3)的浓度，b)任选测量样品中一种或 多种其它心力衰竭标记的浓度，并通过将步骤(a)中测定的浓度以及任选的在步骤(b)中 测定的浓度与对照样品确立的所述一种或多种标记的浓度进行比较，来评估心力衰竭。 还公开了 SFRP-3作为标记蛋白评估心力衰竭的用途，包括SFRP-3的标记组合，以及用 于测量SFRP-3的试剂盒。
背景技术：
心力衰竭(HF)是�：Υ笾诮】档囊桓鲋匾侍猓⑶胰涨餮现�。例如，在美 国，大约5百万患者患有HF，并且每年超过550000名患者被首次诊断为HF(载于 American Heart Association, Heart Diseaseand Stroke Statistics 2008 Update, Dallas, Texas, American HeartAssociation(2008))。同样，美国统计数据表明，对于每年1200万 至1500万个诊所就诊次数和650万个住院日而言，HF是主要原因。从1990年至1999 年，每年以HF作为主要诊断结论住院治疗的患者数量从大约81万增长至超过100万，以 HF作为主要或次要诊断结论的人数从240万增至360万。在2001年，接近53000名患 者死于HF作为主因的疾病。心力衰竭主要是老年人的病症，因此，人们普遍认为“人口 老龄化”也促使HF发病率增加。在年龄大于65岁的人群中，HF的发病率接近10%0。 仅仅在美国，2005年由HF引起的直接和间接损失总共估计约为$279亿，并且每年在治 疗HF的药物上花费大约为$29亿(参照上述引用的AHA-统计数据)。心力衰竭心力衰竭的特征是心脏泵出身体所需血液量的能力丧失。衰竭并不意味着心脏 停止泵送，而是指不能有效地泵出血液。NYHA[纽约心脏协会(New York Heart Association)]和 ACC/AHA[美国心脏病学 十办会 / 美国 A、脏协、会(American Associationof Cardiology/American Heart Association)]者β建
立了 HF的功能分类以评价该疾病的进程。NYHA分类方案有四级疾病状态1级为在 任何行为程度下均无症状，2级为在重体力行为下有症状，而III级和IV级分别在轻度行 为和无行为下有症状。在四阶段的ACC/AHA方案中，阶段A为无症状但有发展为HF的危险。阶段 B有心脏功能紊乱的证据而无症状。在阶段C中，有心脏功能紊乱的证据并伴有症状。 在阶段D中，患者尽管受到最大程度的治疗但仍有症状。HF的病原学 在医学上，必须将心力衰竭(HF)理解为一种复合型疾病。它可能由触发事件而 引起，比如心肌梗死(心脏病发作)，或者是其它病因的后续，比如高血压、糖尿病或心 脏畸形(例如心瓣膜病)。心肌梗死或其它的HF病因会导致心脏泵送能力的初始减退， 例如因为损伤心肌。由于一种或多种代偿机制的激活，可能不会感觉不到这种泵送能力 的减退。但是，已经发现HF的进展与患者的血液动力状态无关。因此，由疾病所引起的损害性变化已经出现发展，而患者甚至仍无症状。事实上，在HF早期阶段维持正常心血管功能的代偿机制，实际上可能最终促进了疾病的进展，例如因为对心脏及其功能施 加有害作用从而维持足够水平的血流循环。HF出现的一些更重要的病理生理变化有(i)下丘脑_垂体_肾上腺轴的活化， ( )全身性内皮功能紊乱和Gii)心肌重塑。⑴专门针对拮抗下丘脑-垂体-肾上腺轴活化的治疗包括β -肾上腺素能阻滞 剂(B-阻滞剂)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、某些钙通道阻滞剂、硝酸盐和内皮 素-1阻滞剂。钙通道阻滞剂和硝酸盐虽然产生临床改善，却没有明确显示出能延长生存 期，而B-阻滞剂和ACE抑制剂已经表现出明显延长寿命，醛留酮拮抗药也是如此。使 用内皮素-1阻滞剂的实验研究已展示出有益效果。( )全身性内皮功能紊乱是HF的一种公知特征，在左心室功能紊乱体征出现时 会明显表现。内皮功能紊乱对于心肌微循环与心脏肌细胞的密切关系十分重要。该证 据表明微血管功能紊乱明显促发肌细胞功能紊乱，并且导致进行性心肌衰竭的形态学变 化。依据潜在的病理生理学，有证据表明内皮功能紊乱可能由NO的相对缺乏所引 起，而NO的相对缺乏可以归结为NADH依赖性氧化酶引起的血管O2生成增加和随后的 NO过度清除。潜在的提高O2生成的作用因素包括升高的交感紧张性、去甲肾上腺素、 血管紧张素II、内皮素-1和TNF-Ci。此外，相对于TNF-Ci水平，一种关键的抗炎细 胞因子IL-IO的水平过低。现在，人们认为，TNF-Ci与相关的促炎细胞因子(包括IL-6 和可溶性TNF-α受体)的水平升高，通过引起心肌收缩性降低、双心室膨大和血压过低 而在HF的发展中起着重要作用，并且可能涉及内皮细胞活化和功能紊乱。人们还认为 TNF-α可能在严重HF患者中发生肌肉消瘦的这种至今仍无法解释的现象中起作用。对 少数患者使用可溶性TNF受体疗法的初步研究已显示了对于NYHA功能分类及患者健康 状况(依据对生活质量指数的测量)的改善。(iii)心肌重塑是一个复杂过程，其伴随着从无症状向有症状的心力衰竭转 变，并可被描述成心肌内的一系列适应性改变，例如心室形状、质量和体积的改变 (Piano, M.R.等人，J.Cardiovasc.Nurs. 14 (2000) 1-23 ； Molkentin，J.D., Ann.Rev. Physiol.63 (2001) 391-426)。心肌重塑的主要内容是肌细胞生物学的改变，如肌细胞肥 大，因为坏死或凋亡而引起的肌细胞损失，胞外基质的改变和左心室腔的几何学改变。 还不清楚心肌重塑是否只是受到长期神经激素刺激产生的毒性效应数年之后发生的终末 器官效应，或者心肌重塑是否独立地促使心力衰竭进展。迄今为止的证据提示，适当的 治疗可以减缓或停止心肌重塑的进展。标记和疾病状态如上所述，肌细胞肥大可能代表发展至HF的最初步骤之一。肌细胞肥大的特征 为某些编码收缩蛋白(如P-肌球蛋白重链和肌钙蛋白T(TnT))的基因和一些非收缩蛋白 (如A型和B型利钠肽)的表达升高，细胞体积增加和细胞骨架变化(Piano，M.R.等人， J.Cardiovasc.Nurs.14 (2000) 1-23 ； Molkentin, J.D., Ann.Rev.Physiol.63 (2001) 391-426)。对人类和动物心力衰竭模型的研究表明，在心力衰竭的后期，肌细胞功能降 低。现已表明，导致肌细胞功能紊乱的机制涉及钙处理网络、肌丝和细胞支架的改变(deTombe, P.P., Cardiovasc.Res.37 (1998) 367-380)。例如，在心力衰竭的人类和动物模型 中，肌浆网钙-ATP酶的酶活性降低，而肌膜NaVCa2+交换器的mRNA水平和蛋白水平 都得以提高。而且，在心力衰竭的人类和动物模型中都具有TnT的同种型转换、肌钙蛋 白I(TnI)磷酸化减少、肌纤维肌动球蛋白ATP酶活性降低和微管形成增加。最初，导致心肌重塑的心脏改变是为了补偿心肌病变部分，以维持身体对氧和 营养的需要。但是，心力衰竭的代偿期是有限的，于是在最后，衰竭的心脏不能维持足 够满足身体需求的心输出量。因此，将会从代偿期转变为失代偿期。在失代偿期内，心 脏级联变化持续但不再是有利的，这使得患者的心力衰竭发展为慢性状态并最终死亡。根据“ACC/AHA 2005成年人慢性心力衰竭的诊断和管理的更新指南)” (S. Hunt等人，www.acc.org = ACC/AHA实践指南),如今，在心力衰竭领域内，该疾病进 程被分为如上所述的四个阶段。在阶段A和B中，发现个体处于心力衰竭发展的危险 中，而阶段C和D表示这些患者组显示了心力衰竭的体征和症状。A至D不同阶段定义 的详细说明如上述参考资料中给出，通过引用包括在本文中。心力衰竭的诊断方法评价HF患者唯一最有效的诊断测试是采用全面的2维超声心动图联同多普勒血 流研究，以确定心肌、心脏瓣膜或心包是否出现异常，以及涉及哪些腔室。必须考虑三 个基本问题DLVEF是维持还是减少，2) LV结构是正常还是异常，和3)是否还有其它 可以解释临床表现的结构异常，如瓣膜、心包或右心室的异常？该信息应该由EF的数值 预期、心室尺度和/或体积的测量、壁厚度的测量和腔室的几何结构以及局部室壁活动 的评价来量化。应该评估右心室的大小以及收缩性能。此外还应该半定量地确定心房的 大小并测量左心房的尺度和/或体积。对于EF保持或减少的患者来说，在进行超声心动描记时获得的非侵袭性血液动 力学数据是重要的附加关联指标。综合二尖瓣输入模型、肺静脉输入模型和二尖瓣环流 速的组合定量提供了关于LV充盈和左房压特征的数据。评定三尖瓣回流梯度以及测量下 腔静脉的尺度及其在呼吸过程的反应，可估算收缩肺动脉压和中心静脉压。心搏量可以联合尺度测量和LV流出道的脉冲多普勒加以确定。但是，在没有 HF时，这些参数的任何一项都可能出现异常。这些参数没有一个必然与HF特异关联； 然而，总体正常的充盈模型可排除临床HF。由临床观点来看，该疾病在代偿期和失代偿初期无临床症状(阶段A完全无症 状，阶段B有结构性心脏病但没有HF的体征和症状，参考ACC/AHA实践指南)。直到 彻底进入失代偿期(即依照ACC/AHA指南的阶段C和D)，疾病的外部体征(如气促) 才会出现。现行的诊断方式基于阶段C和D的患者的外部症状。通常，心力衰竭患者接受使用符合心力衰竭特异性机制的药物的标准治疗。没 有诊断性试验能可靠地反映那些特异机制并帮助医师为适当的患者选择适当的药物(和 剂量)(例如ACE抑制剂、AT II、阻滞剂等等)。用标记早期诊断HF 似乎可能仅由生化标记对具有心力衰竭风险的患者进行早期评估，因为有发展 心力衰竭风险的个体在那个阶段仍是没有HF临床症状的。现在尚无确定的生化标记能在 该疾病症状出现前进行可靠评估。现在到了确立HF诊断的时候，该疾病已经有了深度发展。近年来，利 钠肽家族，尤其是心房利钠肽家族和脑利钠肽家族，被证明对评估 HF有重要价值。HF的预后和需求至少部分因为滞后的诊断，50%的HF患者在诊断后两年之内死亡。5年生存率 小于30%。急需有助于心力衰竭早期诊断的新型生化标记。已批准对心力衰竭风险个体(即无心力衰竭临床症状的个体)早期评估的改进方案。近年来，已经将B型利钠肽标记确定为一种监测HF患者疾病进程的良好手段， 并用其评估患者心血管并发症如心脏病发作的风险。然而，对于其它很多诊断方面，单一标记是不够的。尽管NT-proBNP值低是排除HF或LV的非�：玫囊跣栽げ庵副曛担谏鲜龅� 和其它的研究(参考Triepels R.H.等人，Clin.Chem.49，SuppLA (2003) 37-38)中，已发 现心力衰竭的阳性预测值在50-60%的范围内。因此，可用于评估个体心力衰竭风险的标 记具有很高的临床/实践重要性，这样的标记独立具有较高的HF阳性预测率，或者，相 对于单独的NT-proBNP，其组合NT-proBNP具有更好的HF阳性预测率。在这个临床上非常重要并急需的诊断领域中，辅助评估心力衰竭患者的标记对 于取得更深远的技术进步也意义重大。发明_既述现在已发现并确定，标记分泌型卷曲相关蛋白3(SFRP_3)能辅助评估心力衰 竭。在一个实施方案中，它可帮助评估个体是否具有发生心力衰竭的风险。在进一步的 方面，它可以辅助评估疾病的进展。在另一个实施方案中，它可以辅助预测心力衰竭的 发生。在另一个实施方案中，它能辅助评估并选择一种适当的治疗方案以预防或治疗心 力衰竭。本文公开一种评估个体心力衰竭的方法，其包括以下步骤测量从该个体获得 的样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一种或多种其它心力衰竭标记的浓度； 并通过将SFRP-3的浓度和任选的所述一种或多种其它标记的浓度与对照样品确定的所述 一种或多种标记的浓度进行比较，来评估心力衰竭。本发明还涉及使用蛋白SFRP-3作为标记分子在心力衰竭评估中的用途。本文进一步公开了包括SFRP-3和一种或多种其它心力衰竭标记的标记组合在评 估心力衰竭中的用途。本文还提供实施体外评估心力衰竭方法的试剂盒，所述方法包括以下步骤测 量样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一种或多种其它的心力衰竭标记的浓度； 并通过将SFRP-3的浓度和任选的一种或多种其它标记的浓度与用参考群体中确定的所述 一种或多种标记的浓度进行比较，以评估心力衰竭，该试剂盒包括特异性测定SFRP-3所 需试剂和任选特异性测定一种或多种其它心力衰竭标记的所需试剂。本发明的其它方面和优点将通过随后的描述而变得明显。然而，应当理解，当 提及本发明的优选实施方案时，提供的详细描述和具体实施例仅作为示例说明，因为本 领域技术人员由该详细描述显而易见在本发明精神和范围内的各种变化和修改。
发明详述在第一个实施方案中，本发明涉及一种评估个体心力衰竭的方法，其包括以下步骤a)测量从该个体获得的样品中标记SFRP-3的浓度，b)任选测量样品中一种或多 种其它心力衰竭标记的浓度，和c)通过将步骤(a)中测得的浓度和任选的步骤(b)测得 的浓度与对照样品确定的所述一种或多种标记的浓度比较，以评估心力衰竭。在本文中，以下每一个术语都具有与其在本节中相关的意义。本文使用的冠词“一个”或“一种”是指一或超过一(即至少一)的该冠词的 语法客体。例如，“一种抗体”表示一种抗体或一种以上的抗体。表述“一或更多”、“一种或多种”表示1至50，优选1到20，也优选2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12 或 15。本文使用的术语“标记”或“生化标记”是指一种分子，该分子用作分析患者 的测试样品的靶标。在一个实施方案中，这些分子靶标的实例是蛋白质或多肽。在本 发明中用作标记的蛋白或多肽预计包括所述蛋白的天然片段，特别是免疫学可检测的片 段。免疫学可检测的片段优选包含所述标记多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连 续氨基酸。本领域技术人员将认识到，细胞释放的蛋白或细胞外基质中存在的蛋白可能 被损坏，比如在炎症阶段，并且可被降解或者裂解成这样的片段。某些标记以非活性的 形式合成，随后可能通过蛋白水解被活化。本领域技术人员应理解，蛋白质或其片段也 可以作为复合物的一部分存在。这些复合物也可能用作本发明意义上的标记。此外，或 替代地，标记多肽可以带有翻译后修饰。翻译后修饰的实例有糖基化、酰化和/或磷酸 化等等。术语“评估/评价心力衰竭”用于表示本发明的方法将辅助医师评估个体是否 具有发生心力衰竭的风险，或辅助医师在一个或几个其它HF诊断相关方面评估HF患 者。在评估HF个体时，优选的诊断方面有心力衰竭的分期、鉴别诊断急性和慢性心力衰 竭、判断疾病发展的风险、指导选择适当的药物、监控治疗反应和随访HF患者。就本发明而言，“心力衰竭标记”是一种标记，该标记如果与标记SFRP-3组 合，就会为正在进行的诊断增加评估HF的相关信息。对评估HF而言，将所述标记纳入 已包含标记SFRP-3的标记组合，如果在给定特异性下的灵敏度或如果在给定灵敏度下的 特异性可分别提高，则该信息被认为是相关的或具有附加价值。优选地，灵敏度或特异 性的提高分别具有统计学上的显著水平ρ = 0.05、0.02、0.01或更低。优选所述一种或 多种心力衰竭的其它标记选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。本文使用的术语“样品”是指为了进行体外评价而获取的生物样品。在本发 明方法中，样品或患者样品可优选包含任何体液。优选的试验样品包括血液、血清、血 浆、尿液、唾液和关节液。优选样品是全血、血清、血浆或关节液，血浆或血清是最方 便的样品种类。技术人员将会知道，任何这样的评估均在体外进行。然后丢弃患者样 品。患者样品仅仅用于本发明的体外方法，并且患者样品中的物质不会回输给患者身 体。一般地，样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。“将......浓度与对照样品确定的浓度进行比较”的表述仅用于进一步说明对于技
术人员来说显而易见的内容。对照样品可以是内部对照样品或外部对照样品。在一个实 施方案中，使用内部对照样品，即评估受试样品中的标记水平，以及评估取自于同一受试者的一个或更多个其它样品中的标记水平，以确定所述标记水平是否有任何的变化。 在另一个实施方案中，使用外部对照样品。对于外部对照样品，将来自某个体的样品中 标记的存在或数量与另一个体中该标记的存在或数量进行比较，后一体已知患有某种给 定病症或已知具有某种给定病症的风险；或者一个个体已知没有给定病症，即“正常个 体”。例如，患者样品中的标记水平可与已知与HF特定病程有关的水平相比较。通常， 样品标记水平直接或间接与诊断相关，并且例如标记水平用于例如确定个体是否具有HF 风险。或者，样品的标记水平例如可以与已知与以下情况有关的标记水平相比较HF患 者对治疗的反应、急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断、指导选择适当的药物治疗HF、鉴别 疾病发展风险或随访HF患者。根据计划的诊断用途，选择适当的对照样品，并且确定 其中标志物的对照值或参考值。技术人员将认识到，在一个实施方案中这些对照样品是 从参考群体获得的，该群体年龄匹配并且没有混杂的疾病。同时技术人员明了，在对照 样品中确定的标记绝对值将取决于所用的测定。对照(参考)值用来自于适当参考群体 的100位明确表征的个体的优选样品确定。还优选的是，可以选择参考群体由20、30、 50、200、500或1000个个体组成。健康个体为确定对照值的优选参考群体。分泌型卷曲相关蛋白3 (SFRP-3)Wingless(Wnt)蛋白是分泌性信号转导分子的大家族，所述分子调节发育的至 关重要的方面，包括细胞命运特化、增殖、存活、迁移和粘附(参见Nusse，R.，Cell Res.15 (2005) 28-32)。Wnt信号转导由经典途径和非经典途径组成。在经典Wnt信 号转导途径中，链接素是关键介导物。Wnt受体结合活化胞内胞质信号转导分子 Dishevelled,其又失活一般磷酸化β -链接素的蛋白复合体，并靶向其使其降解。然而， 在Wnt刺激时，抑制降解复合体使得高水平的β-链接素在细胞核中累积，在细胞核中其 活化Wnt靶基因的转录。尽管经典Wnt途径介导许多Wnt作用，但某些Wnt调节的过程是非β -链接 素依赖性的。因此，非经典Wnt信号转导经常归结于称为Ca2+/蛋白激酶C(PKC)和 RhoA/JNK途径这两种途径中的一种(参见Veeman，M.T.等人，Developmental Cell 5(2003)367-377)。分泌性卷曲相关蛋白(SFRP)是可溶性蛋白家族。因为其与卷曲(Fz)受体上的 Wnt结合结构域同源，所以SFRP被表征为Wnt拮抗剂。SFRP直接结合Wnt蛋白，并 阻断经典和非经典Wnt信号转导途径。 人SFRP家族包含5个成员。它们同时被发现，以不同的组别命名，但 现在统称为SFRP 1-5。 在1996年，在牛软骨提取物中鉴别出SFRP家族的第一 个成员(现在叫做SFRP-3)，并作为成软骨因子分离(Hoang，B.等人，J.Biol. Chem.271 (1996) 26131-26137,表明了在骨骼形态发生中的作用)。序列比较和系统发 生分析表明，SFRP1、SFRP2和SFRP5密切相关，且亚组中的簇共同分化自由相关的 SFRP-3和SFRP4形成的簇。SFRP折叠成两个独立的结构域。N-末端包含分泌性信号肽，后接富含半胱氨 酸的结构域，该结构域被提出为Wnt结合区。SFRP蛋白的C末端部分的特征在于带正 电荷的残基的区段和邻接的6个半胱氨酸残基。分泌型卷曲相关蛋白3( = SFRP-3)为36kD蛋白，这是一种模蛋白，已知在多种人类组织中分泌，包括胎盘、心脏、脑、骨骼肌、肾脏和胰腺、肺以及肝脏。在文 献中，该分子还被称为FRE ； FRITZ ； FZRB ； FRP 3 ；卷曲相关蛋白；FRZB PEN ； hFIZ ； FRZB 1 ；卷曲相关蛋白 1 ； OASF、OA。迄今还没有明确确定SFRP-3的生物学作用。实验数据涉及SFRP-3的不同作 用，并已由 Bovolenta, P.等人(J.Cell Sci.121 (2008) 737-746)综述。在胎儿和胚 胎发育过程中，SFRP-3主要在骨中表达，这暗示其在骨骼发育中的 作用。最近的研究已揭示，SFRP-3是肿瘤抑制剂候选物。SFRP-3的表达经常被 多种癌症中的启动子过度甲基化沉默。已表明恢复的SFRP-3表达在体外抑制细胞 生长，并在体内抑制肿瘤生长。SFRP-3被描述为在侵袭性癌症中缺失或被下 调，所 述癌症例如乳腺、胃、子宫颈、肝细胞和前列腺肿瘤(Shi，Y.等人，Acta Pharmacal Sin.28(2007) 1499-1504)。已报道SFRP-3的多形性与骨关节炎易感性相关(Rodriguez-Lopez，J.等人， Ann.Rheum.Dis.66 (2007) 1052-1055)。一项检测过载诱导型心力衰竭的研究表明，SFRP-3和SFRP-4的mRNA 水平与促凋亡的Fas/Fas拮抗比率的表达无关(Schumann，H.等人，Cardiovasc. Res.45 (2000) 720-728)。另外，在罹患肌肉萎缩症的患者中检测到SFRP_3mRNA的差异 表达(Chen，Y.-W.等人，J.Cell.Biology 151 (2000) 1321-1336)。几个专利文献涉及将SFRP作为诊断剂、预防剂和治疗剂用于各种完全不同的疾 病的潜在用途。WO 2004/053063涉及在核酸或蛋白水平上差异表达的SFRP-3的检测，用于对 罹患多发性骨髓瘤的患者诊断骨疾病。WO 2006/081379使用免疫测定SFRP-3评价细胞中骨形态发生蛋白(BMP)活性 的存在情况。US 2004/849643要求保护SFRP-3治疗骨病的用途，W02006/130076更具体地
涉及SFRP-3治疗骨关节炎的用途。WO 2007/082733公开了免疫测定血清和或尿液中的循环SFRP-3，以及其任选 用于检测多囊性肾病的诊断应用。WO 2005/070448推测，SFRP-3可以用于诊断和治疗多种多样的免疫和增殖性 疾病。其宣称SFRP-3可以用作卵巢、结肠、胰腺、间皮瘤、乳腺、肾脏、子宫颈和膀 胱肿瘤的治疗剂。另外其宣称，SFRP-3也可以用于治疗炎症或者治疗自身免疫性疾病， 以及用于治疗骨或软骨疾病。WO 2008/031009提供了多种用于与细胞Wnt信号转导和Wnt介导的障碍(包括 癌症)相关的诊断和治疗用途的嵌合Wnt拮抗剂。一种构建物包含SFRP-3的序列。WO 2004/050894描述了筛选治疗充血性心力衰竭的潜在治疗性化合物的方法。 列出了 90种以上的mRNA序列，这些序列涉及心力衰竭的发展和内源性心肌恢复及修 复机制。这些序列提供了筛选潜在治疗性化合物的基础。其中列出的一种基因序列为 SFRP-3的基因序列。WO 1999/000138描述了 SFRP-3治疗阿尔茨海默病的用途。
WO 2007/022515描述了 SFRP-3减少与缺血性病症相关的细胞死亡和/或组织 损伤的用途。WO 2004/103394涉及SFRP-3作为治疗剂在神经再生调节方面的用途。 WO 2004/113513推测了药物组合物中的多种SFRP(例如SFRP-3)调节患者干 细胞的增殖、分化或增殖和分化这二者的用途。应当看到，在先有技术中，并不知道体液中蛋白SFRP-3的存在情况或水平对评 价心力衰竭具有诊断用途。本发明的发明人现在发现并确定，来自个体的体液样品中的SFRP-3测定值升高 代表心力衰竭。将对照组或对照群体中测得的SFRP-3值用于例如确定截止值或参考范围。数 值高于该截止值或超出参考范围及其高端，就表示数值升高了。在一个实施方案中，确定了固定的截止值。根据诊断目标选定截止值。在一个实施方案中，将对照组或对照群体测得的SFRP-3值用于确定参考范围。 在优选的实施方案中，如果测量值高于参考范围的90%，则SFRP-3浓度被认为升高。 在进一步优选的实施方案中，如果测量值高于参考范围的95%、96%, 97%或97.5%， 则SFRP-3浓度被认为升高。在一个实施方案中，对照样品为内部对照样品。在该实施方案中，从研究的个 体中获得系列样品并比较标记水平。这样可能对例如评价疗效有用。本发明的方法基于从个体获得的液体样品，并基于这些样品中的SFRP-3测量。 本文使用的“个体”指单个人类或非人类生物体。因此，在此描述的方法和组合物可应 用到人类和兽医疾病。优选的个体是人。标记SFRP-3优选通过使用特异结合试剂由液体样品特异性测定。特异性结合试剂例如为SFRP-3受体，结合SFRP-3的凝集素或SFRP-3的抗 体。特异性结合试剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲合力。特异性结合试剂 对靶分子优选具有IO8IAnoU甚至更优选IO9IAnol的亲合力。本领域技术人员应理解， 术语特异性用于表示存在于样品中的其它生物分子不能与SFRP-3特异性结合试剂明显结 合。优选地，与非靶分子的生物分子结合的结合亲合力仅仅为与靶分子的亲合力的10% 或更小，更优选仅5%或更小。优选的特异性结合试剂应具有上述亲合力以及特异性的最 低标准。特异性结合试剂优选是与SFRP-3反应的抗体。术语“抗体”指多克隆抗体、 单克隆抗体、这些抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包括抗体结合结构域的遗传构建 体。可以使用任何保留上述特异性结合试剂标准的抗体片段。抗体可通过目 前工艺水平步骤生产，例如 Tijssen 所述(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays, Elsevier Science Publishers B.V.， Amsterdam (1990),全书，特另ll是 43—78 页)。此外，技术人员非常了解基于可用于抗体特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过 这些方法，多克隆抗体的质量及其由此在免疫测定中的性能将得以提高(Tijssen，P.,上 文，108-115 页)。对于在本发明中公开的成果，可以使用在山羊中产生的多克隆抗体。显然也可以使用得自不同物种(例如大鼠、兔子或豚鼠)的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克 隆抗体能以恒定性能按需要的任意量生产，所以它们是开发临床常规测定的理想工具。在本发明的方法中，抗SFRP-3单克隆抗体的产生和使用分别代表其它的优选实 施方案。从天然来源纯化SFRP-3并不容易。SFRP-3的重组生产是获得更高数量SFRP-3 的可选方法。在一个优选实施方案中，使用真核表达系统重组表达生产SFRP-3。真核 表达系统的实例是杆状病毒表达、在酵母中表达以及在哺乳动物表达系统中表达。在一 个优选实施方案中，SFRP-3表达在哺乳动物表达系统中进行。哺乳动物表达系统的实例 为CHO细胞、HEK细胞、骨髓瘤细胞等等。在进一步优选的实施方案中，重组生产的 SFRP-3用作抗原，以生产抗SFRP-3的多克隆或单克隆抗体。也优选利用本文上述方法 重组生产的SFRP-3，通过在SFRP-3免疫吸附剂上进行免疫吸附来纯化多克隆抗体。现在，技术人员应理解，SFRP-3已被鉴定为有效评估HF的标记，可用替代方 法获得与本发明成果相当的结果。例如，可使用产生抗体的替代策略。这样的策略包括 使用合成肽或重组肽，这些肽代表SFRP-3的临床相关免疫表位。或者，可以使用DNA 免疫(又称做DNA接种免疫)。对于测量，将从个体获得的液体样品和SFRP-3的特异性结合试剂在适合形成 结合试剂SFRP-3复合体的条件下温育。这样的条件无须特别指定，因为技术人员即便 没有任何创造性劳动也可以很容易地鉴定这些适当的温育条件。测定结合试剂SFRP-3 复合体的数量并用于HF的评估。技术人员应理解，有许多方法可测定特异性结合试剂 SFRP-3复合体的数量，这些方法在相关教科书中均有详细描述(参见例如Tijssen P.，上 文，Diamandis, E.P.禾口 Christopoulos，T.K.(编辑)，Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))。优选地，以夹心型测定形式检测SFRP-3。在这种测定中，用第一特异性结合 试剂从一侧捕获SFRP-3，另一侧使用带有能直接或间接检测的标记的第二特异性结合试 齐IJ。优选地，在定性(有或无SFRP-3)或定量(确定SFRP-3的量)的免疫测定中使用 抗SFRP-3的抗体。如在实施例部分详细描述的，已经将两种小鼠模型用于通过先进的微阵列和蛋 白组方法鉴定存在于实验动物心脏组织中的mRNA和多肽。然而，这些模型得到至少部 分矛盾的数据，当然，mRNA或相应多肽的组织数据并不能代表这些多肽在循环中的有 或无。在一个模型中被发现差异表达的标记可能不在第二个模型中差异表达，或者，在 又一个模型中甚至显示出矛盾的数据。可以发现差异表达的mRNA与循环中相应多肽的 增强水平不相关。即使蛋白可以在组织中差异表达，但如果从体液中测定，大多数情况 下，这种蛋白没有任何诊断性关联，因为它可能不被释放至循环中，可能变成片段或者 被修饰，例如从细胞或者组织释放时，可能在循环系统中不稳定，可能在循环中不能被 检测，可能对于特定的疾病不是特异性的，等等。令人惊讶的是，本发明的发明人能检测体液样品中的蛋白SFRP-3。更令人惊讶 的是，他们 能证明在这种获自个体的液体样品中SFRP-3的存在情况可以与HF相关联。 使用标记SFRP-3评估HF无需组织和活检样品。测量蛋白SFRP-3的水平在HF领域被 认为是非常有益的。
在一个优选实施方案中，本发明的方法是以血清作为液体样品材料进行的。在 一个更优选的实施方案中，本发明的方法是以血浆作为液体样品材料进行的。在另一个 优选的实施方案中，本发明的方法是以全血作为液体样品材料进行的。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及蛋白SFRP-3作为标记分子从获自个体 的液体样品来评价心力衰竭的用途。用于诊断的理想情况应是其中单一事件或者过程会导致相应疾病的情况，例如 传染病。在其它所有的病例中，正确的诊断可能是很难的，尤其是该疾病的病原学没有 被充分认识时，HF就是这种情况。技术人员应理解，在HF领域，针对某一诊断问题， 没有生化标记在诊断上有100%特异性并同时具有100%灵敏度。相反，生化标记以某种 可能性或者预测值用于评估潜在的诊断问题。技术人员十分熟悉通常用来计算所评价的 诊断指标的相对危险性或者可能性的数学/统计学方法。在常规临床实践中，医师在诊 断、治疗和处置潜在疾病时通常会同时考察各种的临诊症状和生物标志。优选地，在本发明的进一步优选的实施方案中，用于评估HF的方法如下进行 测量SFRP-3和一种或多种其它标记的浓度，并利用SFRP-3和所述一种或多种其它标记 的浓度评估HF。在HF评估中，标记SFRP-3将会在以下一个或更多个方面辅助医师评估个 体患心力衰竭的风险或者评估患有心力衰竭的患者，例如想鉴定心力衰竭的阶段；区分 急性和慢性心力衰竭；判断疾病进程的风险；对选择适当治疗提供指导；监测患者对治 疗的反应；以及监测病程，即随访HF患者。筛选(评估个体是否有发生心力衰竭的风 险)在一个优选的实施方案中，本发明涉及评估个体是否有发展心力衰竭风险的体 外方法，其包括以下步骤测量样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一种或多 种心力衰竭的其它标记的浓度；并通过将该SFRP-3浓度和任选测量的所述一种或多种其 它标记的浓度与所述一种或多种标记浓度的参考值比较，来评价所述个体发生心力衰竭 的风险。从本发明角度上讲，筛选涉及相关个体发生或出现心力衰竭风险的无偏差评 估。而这种筛选在理论上可以对任何样品进行，在临床实践中，这种筛选通常会给予具 有以某种方式发生心力衰竭风险的个体。如上所述，这样的个体可以无临床症状，即他 们没有HF的体征或者症状。在一个优选实施方案中，将对具有发展心力衰竭风险的个体 进行HF筛�。缡粲诎碅CC/AHA实践指南定义的阶段A或B。如上所述，心力衰竭是发达国家中最主要的、花费高的威胁生命的疾病之一。 因为它的高发病率且长时间无症状期，为了干预并阻断该病程(如果可能的话)，对于个 体发生HF风险的鉴定将变得极其重要。只有尽早进行风险评估，才可能阻止HF病程从 无症状期进入有症状期。心力衰竭风险的评估是通过数学/统计学方法进行的，技术人员对这些方法有 充分的认识和理解。优选地，个体患心力衰竭的风险以相对值表示，并按所谓的相对风 险性( = RR)给出。为了计算这种心力衰竭的RR，将SFRP-3的个体数值与在参考群体 中确定的SFRP-3数值进行对比，参考群体优选为不发生心力衰竭的健康个体。还优选 对这种心力衰竭RR的评估基于在研究期内(优选一年或者也可优选两年之内)发展心力衰竭的个体群和在相同研究期内未发展心力衰竭的个体群。在另一个优选实施方案中，本发明涉及标记SFRP-3筛选心力衰竭的用途。如技术人员所知，术语“用作标记”表示通过适当手段对标记分子的浓度进行定量后，用 测得的标记值指示(即标示)疾病的有无或者临床状况的有无。用于定量的适当手段例 如为特异性结合试剂，如抗体。优选地，对怀疑将出现心力衰竭的风险个体实施HF筛选。在该意义上，具有未 来心力衰竭风险的患者是已诊断有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病、肥胖和代谢综 合征的患者。优选地，对患有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病和/或代谢综合征的 个体评估未来心力衰竭的风险。还优选使用标记SFRP-3对按照ACC/AHA实践指南定义的阶段B的个体(即呈 现心脏结构改变但没有显示心力衰竭症状的个体)评估未来心力衰竭风险。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及使用SFRP-3作为HF标记组合中的一 种标记用于筛选HF。在筛选中，SFRP-3的水平升高是个体发生心力衰竭的风险增加的阳性指标。患者的分级在一个优选的实施方案中，本发明涉及辅助对心力衰竭患者分级的体外方法， 其包括以下步骤a)测量样品中标记SFRP-3的浓度，b)任选测量样品中一种或多种心 力衰竭的其它标记的浓度，并通过将在步骤(a)中测定的浓度和任选步骤(b)中测定的 浓度与所述一种或多种标记浓度的参考值进行比较，来对心力衰竭进行分级。优选地， 标记SFRP-3的水平用于辅助将受试个体分入个体组，这些组为临床“正常”(即按照 ACA/ACC分类在阶段A的个体)、具有结构性心脏病但无症状的患者(按照ACA/ACC 分类的阶段B)和心力衰竭患者组(即按照ACA/ACC分类处于阶段C或阶段D的患者)。区别急性心脏事件和慢性心脏病在一个优选的实施方案中，本发明涉及辅助鉴别诊断急性心脏事件和慢性心脏 病的体外方法，其包括以下步骤测量样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一 种或多种心力衰竭的其它标记的浓度；并通过将步骤(a)测定的浓度和任选步骤(b)中测 定的浓度与这个标记或这些标记浓度的参考值进行比较，来确立对急性心脏事件和慢性 心脏病的鉴别诊断。本领域技术人员熟悉“急性心脏事件”和“慢性心脏病”的含义。优选地，“急性心脏事件”涉及心脏的急性状况、疾病或机能紊乱，特别指急 性心力衰竭，例如心肌梗死(MI)或心律失常。根据MI的程度，其可能后续LVD和 CHF。优选地，“慢性心脏病”是心脏功能的减弱，例如，由于心脏缺血、冠状动脉 病或前期的特别小的心肌梗死(也许后续发生进行性LVD)造成。其也可能是由炎性疾 病、心脏瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心脏节奏缺陷 (心律失常)和慢性阻塞性肺病造成的虚弱。因此，慢性心脏病显然也可以包括患有急性 冠状动脉综合征如MI的患者，但他们当前没有急性心脏事件。区分急性心脏事件和慢性心脏病十分重要，因为急性心脏事件和慢性心脏病可 能要求相当不同的治疗方案。例如对于急性心肌梗塞患者，再灌注早期治疗可能极度重要。而对慢性心力衰竭患者进行再灌注治疗，最多是对这个患者无害或仅仅是几乎无害。 在本发明的一个更优选的实施方案中，标记SFRP-3用于鉴别诊断急性和慢性心 力衰竭。评估疾病进展的风险在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种评估HF患者疾病进展风险的体外方 法，其包括以下步骤测量样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一种或多种心 力衰竭的其它标记的浓度；并通过将该SFRP-3浓度和任选测定的所述一种或多种其它标 记浓度与所述一种或多种标记的浓度参考值比较，来确定所述个体疾病进展的风险。目前，很难以合理的可能性评估乃至预言一位诊断患有HF的患者是否具有或 多或少的稳定状态，或疾病是否将会发展，以及患者的健康状态是否可能恶化。在临床 上，心力衰竭的严重性和进展通常通过评估临床症状来确定，或者，使用成像技术(如 超声波心动描记术)鉴定有害变化来确定。在一个实施方案中，心力衰竭的恶化是通过 监测左侧心室射血分数(LVEF)来确定的。LVEF减少5%或更多就被认为是疾病进展或
T^ ο因此，在进一步优选的实施方案中，本发明涉及使用标记SFRP-3评估患有HF 的患者疾病进展风险。在患有HF的患者的疾病进展评估中，SFRP-3水平的升高指示疾 病进展的风险升高。指导选择适当的HF疗法在一个优选的实施方案中，本发明涉及辅助选择适当的HF疗法的体外方法，其 包括以下步骤测量样品中标记SFRP-3的浓度；任选测量样品中一种或多种心力衰竭 的其它标记的浓度，并通过将该SFRP-3浓度和任选测定的所述一种或多种其它标记浓度 与所述一种或多种标记的浓度的参考值比较，来选择适当的疗法。预期标记SFRP-3能辅助医师从目前心力衰竭领域的各种治疗方案中选择最适当 的治疗方案。因此，更优选的实施方案涉及使用标记SFRP-3为HF患者选择治疗方案。监测患者对疗法的反应在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种监测患者对HF治疗反应的体外方 法，其包括以下步骤a)测量样品中标记SFRP-3的浓度，b)任选测量样品中一种或多 种心力衰竭的其它标记的浓度，并通过将步骤(a)测定的浓度和任选步骤(b)测定的浓度 与所述一种或多种标记的浓度的参考值比较，来监测患者对HF疗法的反应。或者，上述用于监测患者对疗法反应的方法可以通过如下实施确定治疗前后 的SFRP-3和任选的一种或多种其它标记的标记水平并对治疗前后的标记水平加以比较。心力衰竭的诊断在临床上是确立的。根据本发明，如果患者达到ACC/AHA实 践指南定义的阶段C或D的标准，则认为HF在临床上是确立的。依据这些指南，阶段 C指患者具有结构性心脏病并有心力衰竭的较早或当前症状。阶段D的患者是具有难治 性心力衰竭的患者，他们需要专门的干预。进一步如上所示，测得的NT-proBNP值与心力衰竭的严重性密切相关。然而， BNP和NT-proBNP在监测患者对疗法的反应上似乎均不理想，参见例如Beck-da_Silva， L.等人，Congest.Heart Fail. 11 (2005) 248-253，quiz 254-255。标记SFRP-3看来适于监测患者对疗法的反应。本发明因此也涉及使用SFRP-3监测患者对疗法的反应。在该诊断领域，标记SFRP-3还可以用于确定在治疗之前的基 线值，并测定在治疗之后的一个时间点或几个时间点的SFRP-3。在HF患者的随访中， SFRP-3的水平升高是有效的HF治疗的阳性指示。标记组合 生化标记可以单独测定，或者，在本发明的一个优选实施方案中，它们可以用 基于芯片或基于珠的阵列技术同时测定。然后用每个标记的截止值独立解释生物标记的 浓度，或将它们组合起来解释，即它们形成标记组合。本领域技术人员知道，可以用不同的方法实施并完成将标记水平与某种可能性 或风险联系起来的步骤。优选地，将标记SFRP-3和一种或多种其它标记的测定值用数 学的方法进行组合，然后将该组合值与潜在的诊断问题关联。可以用任何目前适当的数 学法将标记值与SFRP-3的测量数据组合起来。应用于标记组合的数学算法优选逻辑函数。应用这种数学算法或这种逻辑函数 的结果优选单一值。视潜在的诊断问题而定，该值可以很容易地与例如个体患心力衰竭 的风险关联起来，或者，与例如有益于评估HF患者的其它预定诊断应用关联起来。在一 个优选的方式中，该逻辑函数如下获得a)将个体分成组，例如正常个体组、心力衰竭 风险个体组、急性或慢性心力衰竭患者组等，b)用单变量分析法鉴定这些组之间有显著 相异的标记，c)逻辑回归分析以评估在评估这些不同的组时有用的标记的独立判别值， 和d)构建逻辑函数来组合独立判别值。在这类分析中，所述标记不再是独立的，而是代 表标记组合。在一个优选的实施方案中，如下获得用于组合SFRP-3值和另外至少一个标记值 的逻辑函数a)将个体分别地分入正常组和心力衰竭风险个体组，b)确立SFRP-3的值 和另外至少一个标记的值，C)进行逻辑回归分析，和d)构建逻辑函数来组合SFRP-3的 标记值和另外至少一个标记的值。用于将标记组合与疾病关联的逻辑函数，优选使用通过应用统计学方法开发得 到的算法。适当的统计学方法例如判别分析(DA)(即线性DA、二次方程DA、正则 化DA)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近-相邻分级法)、PLS (偏最小二乘 法)、基于树状法(即逻辑回归、CART、随机Forest法、Boosting/Bagging法)、广义 线性模型(即逻辑回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义加性模型、基于�：� 辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。本领域技术人员应该能够选择适当的统计 方法来评价本发明的标记组合，并藉此获得适当的数学算法。优选用统计学方法来获得 用于评估心力衰竭的数学算法，该统计学方法选自DA(即线性、二次方程、正则化的判 别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近-相邻分级法)、PLS (偏最小二乘 法)、基于树状法(即逻辑回归、CART、随机Forest法、Boosting方法)或广义线性模 型(即逻辑回归)。关于这些统计学方法的详细描述可见于以下的参考文献Ruczinski， I.等人，J.of Computational and GraphicalStatistics 12(2003)475-511 ； Friedman, J.H., J.of the American StatisticalAssociation 84(1989) 165-175 ； Hastie, Τ.等人，The Elements ofStatistical Learning, Springer Verlag (2001) ； Breiman, L.等 人，Classification and regression trees, Wadsworth International Group, California(1984) ； Breiman, L., Machine Learning 45(2001) 5—32 ; Pepe, M.S.， The Statistical Evaluation of Medical Testsfor Classification andPrediction, Oxford Statistical Science Series, 28, Oxford University Press (2003)；禾Π Duda，R.O.等人，Pattern Classification，John Wiley & Sons，Inc.,第 2
版，(2001)。本发明的一个优选实施方案是将优化多变量截止值用于生物标记的潜在组合， 并区分状态A和状态B，例如，分别区分正常个体和心力衰竭风险个体、对治疗有反应 的HF患者和治疗失败的HF患者、急性心力衰竭患者和慢性心力衰竭HF患者、显示疾 病进展的HF患者和未显示疾病进展的患者。受试者工作曲线以下的面积(=AUC)指示诊断程序的有效性或正确性。诊 断方法的正确性最好是由它的受试者工作特征(ROC)来描述(特别见Zweig，M.H.和 Campbell, G.，Clin.Chem.39 (1993) 561-577)。ROC图是从连续改变所观测的整个数据 范围内的判定阈得到的全部灵敏度/特异性配对的绘图。实验室试验的临床效果取决于它诊断的准确性，或取决于将受试者正确分类为 临床相关亚群的能力。诊断准确性能衡量该试验正确区别研究对象两种不同情况的能 力。这两种不同情况例如为健康与疾病或者有疾病进展与没有疾病进展。在每个病例中，ROC曲线图通过在判定阈全范围中绘制灵敏度对1-特异性的 曲线来描述两种分布之间的重叠。y轴是灵敏度，或真阳性分数[按(真阳性测定结果 数)/(真阳性测定结果数+假阴性测定结果数)确定]。这也被称为疾病或病症存在的阳 性。它仅由受影响亚群计算得到。X轴是假阳性分数，或1-特异性[按(假阳性结果 数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)确定]。它是特异性的指标，完全由未受影响亚群 计算得到。因为真假阳性分数通过使用来自两种不同亚群的试验结果完全分开计算，所 以ROC曲线图与样品中的疾病流行性无关。曲线图上的每个点均表示灵敏度/1-特异性 配对，其对应于一个特定的判定阈。辨别力很好的测定(两种结果分布没有重叠)具有 的ROC曲线图穿过左上角，其真阳性分数为1.0或100% (非�：玫牧槊舳�)，假阳性分 数是0(非�：玫奶匾煨�)。对于一个无辨别力的测定(两组的结果分布相同)来说，理 论曲线图是一条从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线在这两个极端之间。(如 果ROC曲线图完全落在45°对角线下，则这种情况很容易补救，即通过颠倒“阳性”标 准，从“大于”到“小于”，或反之亦然)。在性质上，曲线图越接近左上角，测定的 总精度越高。 定量实验室试验的诊断准确性的一个便利目的是通过单一数字来表示它的效 果。最常用的总体量度是ROC曲线下的面积(AUC)。按照惯例，该面积总如果不 是这样，人们可以颠倒判定规则来使它如此)。数值介于1.0 (非�：玫胤挚阶椴馐灾�) 和0.5(两组测试值无明显的分布差异)之间。该面积不仅仅依赖曲线图的特定部分，如 最接近对角线的点或在90%特异性处的灵敏度，而是整个曲线图。这是一个定量的、描 述性的表达式，表示ROC曲线图接近完美(面积=1.0)的程度。总的测定灵敏度取决于特异性，该特异性是实践本文公开的方法所需要的。在 某些优选的设定中，75%的特异性可能是足够的，并且统计方法和结果算法可以基于 该特异性需求。在一个优选的实施方案中，应用于评估个体心力衰竭风险的方法基于 80%, 85%的特异性，或者，还优选90%或95%的特异性。如上所述，标记SFRP-3有助于评估个体发生心力衰竭的风险，还有助于体外诊断性评估患有心力衰竭的患者。因此，一个优选实施方案是使用SFRP-3作为评估心力 衰竭的标记分子。使用包括SFRP-3和一种或多种其它HF标记的标记组合来评估HF患者或评估个体患HF风险代表了本发明的进一步优选的实施方案。在这样的标记组合中，一种或多 种其它的标记优选选自利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。可与SFRP-3测量组合的一种或多种优选的其它HF标记优选是或者选自利钠肽 标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。这些优选的其它标记的测量优选地与SFRP-3的测 量组合，或者形成包括SFRP-3在内的HF标记组合的一部分，以下分别更详细地讨论。利钠肽标记在本发明意义上，利钠肽标记是选自心房利钠肽(ANP)家族的标记，或是选自 脑利钠肽(BNP)家族的标记。心房利钠肽家族或脑利钠肽家族中的多肽标记都源自于相应活性激素的前原形 式。本发明优选的利钠肽标记是NT-proANP、ANP> NT-proBNP、BNP和可用免疫
法检测的其生理片段。技术人员很容易理解，可用免疫法检测的片段必须包括至少一个 表位，以允许特异性检测这样的生理片段。生理片段是天然存在于个体循环中的片段。两种利钠肽家族中的标记代表相应激素原(分别是proANP和proBNP)的片段。 因为对于两个家族的考虑是相似的，所以仅对BNP标记家族作略微详细描述。BNP家 族的激素原，即proBNP，由108个氨基酸组成。proBNP被剪切成为32个C末端氨基 酸(77-108)，其代表有生物活性的激素BNP，和叫做N末端proBNP (或NT-proBNP)的 N末端氨基酸1-76。BNP、N末端proBNP (1-76)以及进一步的分解产物(Hunt，P.J.等 人，Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995) 1175-1183)在血液中循环。完整的前体分子 (proBNP 1-108)是否也存在于血浆中现在还不完全明确。不过有论述(Hunt，P.J.等人， Peptides 18(1997) 1475-1481)指出，proBNP(1-108)在血浆中的低释放量是可检测的， 但由于在其N末端的非�？焖俚木植拷到猓恍┌被崾侨笔У�。现在普遍接受例如对 于NT-proBNP，该分子于氨基酸10至50之间的中心部分代表生理上更稳定的部分。包 括该中心部分的NT-proBNP分子能从体液中可靠测定。基于免疫法检测该NT-proBNP 分子中心部分的方法在WO 00/45176中有详细的公开内容，读者可以参考该文献了解细 节。仅测定NT-proBNP的某一亚组份可能更有利，对此已提出了术语天然NT-proBNP。 关于此NT-proBNP亚组份的详细公开内容见于WO 2004/099253。技术人员将在那里找 到所有必需的指导。优选地，测定的NT-proBNP是(或对应于)使用来自德国Roche Diagnostics 的Elecsys NT-proBNP 测定检测的 NT-proBNP。应用NT-proBNP进行预分析是有效的，这样可使样品转移至中心实验室变得 容易(Mueller，Τ.等人，Clin.Chem.Lab.Med.42 (2004) 942-944)。血样可以在室温下存 储几天，或可邮寄或运输，而没有回收率的损失。相反，将BNP在室温下或4°C储存 48小时可能造成至少20%的浓度损失(Mueller，Τ.等人，上文；Wu，A.H.等人，Clin. Chem.50 (2004) 867-873)。在筛选某些群体的HF中已经对脑源的利钠肽家族(尤其是BNP和NT-proBNP) 进行了彻底的研究。这些标记，尤其是NT-proBNP的发现，是相当鼓舞人心的。NT-proBNP的值甚至在无症状“患者”中升高，明确预示了 “心脏问题”(Gremmler， B.等人，Exp.Clin.Cardiol.8 (2003) 91-94)。这些作者表明，升高的 NT-proBNP 显示了 ‘心-肾不适’的存在，并应该迅速安排进一步检查。与几个其它小组研究人员相一 致，Gremmler等人也发现了 NT-proBNP浓度异常对于排除群体中的HF和排除气喘患 者中的左心室功能紊乱(=LVD)是准确的诊断性试验。阴性BNP或NT-proBNP值排 除HF或LVD的作用被其它组研究人员确证，参考如McDonagh，Τ.Α.等人，Eur.J.Heart Fail.6 (2004) 269-273 ；禾Π Gustafsson，F.等人，J.Card.Fail.ll，增刊 5 (2005) S 15-20。
BNP主要在心室中产生(虽然不是唯一的)，并在壁压力升高时释放。因此， BNP释放的增加主要反映了心室功能紊乱或发生于心房但影响到心室的功能紊乱，例 如，通过流入量减少或血容量过载。与BNP相反，ANP主要从心房产生并释放。因此 ANP的水平可能主要反映心房的功能。ANP和BNP是活性激素，与其相应的非活性对应物NT_proANP和NT-proBNP
相比，具有较短的半衰期。BNP在血液中被代谢，而NT-proBNP则作为完整的分子在 血液中循环，并通过肾脏除去。NT-proBNP的体内半衰期比BNP长120分钟，BNP的 体内半衰期为 20 分钟(Smith，M.W.等人，J.Endocrinol. 167 (2000) 239-246)。因此，取决于时间过程或目标特性，对活性形式或非活性形式的利钠肽进行测 量可能是有益的。在个体心力衰竭风险的评估中，测定的SFRP-3值优选与NT-proANP和/或 NT-proBNP的值相组合。NT-proBNP的值优选与SFRP-3的值相组合。类似的考虑适 用于选择适当的疗法、鉴别疾病进展的风险和监测疾病的过程。SFRP-3用于评估患者对疗法的反应时，优选将其检测与ANP或BNP的测量组 合起来。SFRP-3用来区分急性和慢性心力衰竭时，优选的标记组合包括SFRP-3、ANP 或 proANP 和 BNP 或 proBNP。心肌肌钙蛋白标记术语心肌肌钙蛋白涉及肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的心脏同种型。按上述已说明 的，术语标记也涉及标记分子的生理变异体，如生理片段或复合体。对于心肌肌钙蛋白 标记，已知它们的生理学存在的复合体具有诊断价值，并因此明确包含在本发明内。肌钙蛋白T具有约37.000Da的分子量。发现于心脏组织的肌钙蛋白T同 种型(CTnT)与骨骼肌TnT有相当大的区别，以至于可以生产抗体来判别这两种TnT 同种型。TnT被认为是急性心肌损伤的标记；参见Katus，H.A.等人，J.Mol.Cell. Cardiol.21 (1989) 1349-1353 ； Hamm, C.W.等人，N.Engl.J.Med.327 (1992) 146-150 ； Ohman, E.M.等人，N.Engl.J.Med.335 (1996) 1333-1341 ； Christenson，R.H.等人，Clin. Chem.44 (1998) 494-501 ；禾Π EP 0 394 819。肌钙蛋白I(TnI)是肌钙蛋白复合物的抑制元件，为25kDa，存在于肌肉组织 中。TnI在没有Ca2+时结合肌动蛋白，抑制肌动球蛋白的ATP酶活性。存在于心脏 组织的TnI同种型(cTnl)与骨骼肌TnI有40 %的差异，使得可以用免疫法判别两种同 种型。cTnl的正常血浆浓度小于0.1ng/ml(4pM)。cTnl在心脏细胞死亡后释放进入 血流中；因此，在有急性心肌梗塞的患者中血浆cTnl浓度升高(Benamer，H.等人，Am.J.Cardiol.82 (1998) 845-850)。 肌钙蛋白I和T独特的心脏同种型让它们可以通过免疫法与其它的骨骼肌肌钙蛋 白加以区别。因此，由损伤心肌释放进入血液的肌钙蛋白I和T可以特异性地与心脏组 织损伤相关。现在技术人员也知道，心肌肌钙蛋白可从循环中检出，其可是游离态或者 复合物组成部分(参考例如 US 6,333,397、US 6,376,206 和 US 6,174,686)。在评估个体患心力衰竭的风险以及评估已患心力衰竭的患者的时候，测定的 SFRP-3值优选与肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I心脏同种型的值相结合。与标记SFRP-3 组合使用的优选心肌肌钙蛋白是心肌肌钙蛋白T。炎症标记技术人员对术语炎症标记是熟悉的。优选的炎症标记是白介素_6、C-反应蛋 白、血清淀粉样蛋白A和SlOO蛋白。白介素-6(IL_6)是一种21kDa的分泌性蛋白质，它具有多种生物活性，可分为 参与红细胞生成作用的活性和参与活化先天免疫反应的活性。IL-6是急性期反应物并刺 激多种蛋白(包括粘着分子)的合成。它的主要功能是介导急性期肝脏蛋白的生产，细胞 因子IL-I和TNF-α诱导它的合成。IL_6通常是由巨噬细胞和T淋巴细胞产生。IL_6 的正常血清浓度小于5pg/ml。C-反应蛋白(CRP)是一种同型五聚体Ca2+结合急性期蛋白，具有参与宿主防御 的21kDa亚基。CRP的合成可被IL-6诱导，并被IL-I间接诱导，因为IL-I可以通过肝 血窦的Kupffer细胞触发合成IL-6。在90 %的健康群体中CRP的正常血浆浓度小于3 μ g/ ml(30nM)，在99%的健康个体中小于10 μ g/ml (IOOnM)。例如血浆的CRP浓度可以通 过血清淀粉样蛋白A( = SAA)来测定，血清淀粉样蛋白A是一种11.7kDa的低分子量急 性期蛋白。它主要由肝脏响应于IL-1、IL-6或TNF-Ci刺激合成，并参与调控T细胞依 赖性免疫反应。在急性事件中，SAA的浓度增加至1000倍，达到1毫克/毫升。它可 以用来监测在如囊性纤维化、肾移植排斥、外伤或感染的多种疾病中的炎症。在类风湿 性关节炎的某些病例中已被用于替代CRP，但是SAA仍然没有被广泛认可。SlOO蛋白形成不断扩大的Ca2+结合蛋白家族，该家族现在包括20个以上的 成员。SlOO蛋白的生理性相关结构是一种同二聚体，但有些也可以互相形成异二聚 体，例如S100A8和S100A9。其细胞内功能涵盖调控蛋白质磷酸化、酶活性或涉及细 胞增殖和分化的细胞骨架动力学。因为某些SlOO蛋白也可以从细胞中释放，其胞外 功能现在也已有描述，例如神经元存活、星形胶质细胞增殖、诱导凋亡以及炎性过程 的调控。S100A8、S100A9、异二聚体S100A8/A9以及S100A12已经在炎症中发现， S100A8对慢性炎症应答，而S100A9、S100A8/A9和S100A12在急性炎症中增多。已 发现S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12与有炎性成分的不同疾病有关联，包括 某些癌症、肾同种异体移植排斥、结肠炎，最重要的是与RA有关联(Burmeister，G.和 Gallacchi, G.，Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230 ； Foell, D.等人，Rheumathology 42(2003) 1383-1389)。例如，对于本发明使用的标记组合，在用于评估个体HF风险或 HF患者时，最优选的SlOO标记是S100A8、S100A9、S100A8/A9异二聚体和S100A12。sE-选择蛋白(可溶的内皮性白细胞粘着分子-1，ELAM-1)是一种115kDa的 I型跨膜糖蛋白，只在内皮细胞上并仅受炎性细胞因子(IL-1 β、TNF-α)或内毒素活化后表达。细胞表面的E-选择蛋白是白细胞转动附着至内皮的介导物，该过程是白细胞在炎症位点外渗的必需步骤，由此该蛋白在局部炎性反应中具有重要作用。在健康个体 的血液中存在可溶性E-选择蛋白，这可能是由于表面表达的分子被蛋白酶剪切后生成 的。已有报道称，在许多病理状况下血清中的sE-选择蛋白水平升高(Gearing，A.J.和 Hemingway, I., Ann.N.Y.Acad.Sci.667 (1992) 324-331)。在一个优选实施方案中，本发明涉及将SFRP-3作为HF的标记分子与一种或多 种HF标记分子组合用于对得自个体的液体样品进行HF评价。如上所示，在本发明的优选方法中，SFRP-3的测定值至少与至少另一种选自以 下标记的值组合利钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。在一个优选实施方案中，本发明涉及使用SFRP-3和NT-proBNP的标记组合评 估心力衰竭的用途。在一个优选实施方案中，本发明涉及使用SFRP-3和肌钙蛋白T的标记组合评估 心力衰竭的用途。在一个优选实施方案中，本发明涉及使用SFRP-3和CRP的标记组合评估心力衰 竭的用途。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及包括标记SFRP-3、肌钙蛋白T、 NT-proBNP和CRP的标记组合。在再一个更优选的实施方案中，本发明涉及用于在体外通过生化标记评估HF的 方法的标记组，所述方法包括测量样品中SFRP-3和一种或多种其它HF标记的浓度，并 使用测定的浓度评估HF。本发明的标记组优选用蛋白阵列技术测定。阵列是可寻址的个体标记集合。 这样的标记可以在空间上被寻址，如包含于微量滴定板中或印在平面表面的阵列，其 中每个标记存在于不同的X和Y轴坐标。或者，标记也可根据标签、珠、纳米颗粒 或物理性质来寻址。微阵列可按照普通技术人员已知的方法(参见如US 5,807,522 ； Robinson, W.H.等人，Nat.Med.8 (2002) 295-301 ； Robinson，W.H.等人，Arthritis Rheum.46 (2002) 885-893)制备。本文使用的阵列是指任何具有多种可寻址标记的免疫学 测定。在一种实施方案中，可寻址标记是抗原。在另一个实施方案中，可寻址元件是自 身抗体。微阵列是小型化形式的阵列。本文使用的抗原是指任何可以特异性结合于抗体 的分子。术语自身抗体在本领域已有明确的定义。在一个优选实施方案中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标记SFRP-3和任选的一 种或多种HF的其它标记。在一个优选实施方案中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标记SFRP-3和 NT-proBNP。在一个优选实施方案中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标记SFRP-3和肌钙蛋白 T。在一个优选实施方案中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标记SFRP-3和CRP。在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包括标记SFRP-3、肌钙蛋白T、 NT-proBNP和CRP的蛋白阵列。在再一个更优选的实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包括特异性测定SFRP-3需要的试剂。优选的另一种试剂盒包括特异性测定SFRP-3需要的试剂和测定一种或多 种其它心力衰竭标记需要的试剂，这些标记在HF标记组合中一起使用。以下提供的实施例、序列表和附图用于辅助理解本发明，本发明的真实范围在 权利要求中阐述。需要理解，在未偏离本发明精神的前提下，可以修改所述方法。附图简述
图1野生型小鼠和R9C小鼠的表型分析。(A)野生型小鼠(η = 79)和R9C小 鼠(η = 44)在24周后产生的生存曲线。(B)用超声波心动描记术进行的心脏缩短评估 (=缩短分数)。早在8周龄R9C转基因动物就开始出现明显的功能性损害。图2野生型小鼠和AB小鼠的超声心动图和血液动力学参数。(A)术后2、4和 8周最高压强的变化(mmHg)。 (B)术后2、4和8周左心室射血分数(LVEF)变化百分 数。(实心圆表示数据来源于假手术小鼠，空心圆表示数据来源于主动脉结扎(AB)小 鼠)O图3分别从242例HF患者和118例对照样品中测得的SFRP-3。浓度在y轴上 以ng/ml给出。分别将来源于心力衰竭患者的样品标记为HF (HF=菱形)，将健康对照 标记为NHS (正常人血清=NHS =正方形)。图4分别从临床常规组和扩展对照组的HF样品中检出的SFRP-3值。分别根据 由心力衰竭患者样品(标记HF)和健康对照样品(正常人血清标记= NHS)测得的SFRP-3 计算其浓度。盒须图显示了较低和较高的四分位值(盒)以及最高和最低的值(须)。实施例1心力衰竭的小鼠模型1.1R9C小鼠模型已报道一种遗传性人类扩张型心肌病源于人受磷蛋白(PLN)基因中的Arg9转变 为 Cys(PLN_R9C) (Schmitt，J.P.等人，Science 299 (2003) 1410-1413)。扩张型心肌病患 者的发病一般开始于青春期，随后心脏功能渐进性恶化，导致危险和死亡。该突变的转 基因小鼠模型显示出与患病患者类似的心脏表型，出现扩张型心肌病、心脏收缩力降低 和过早死亡(Schmitt等人，2003，上文)。我们建立了转基因小鼠的存活曲线。PLN-R9C小鼠平均存活仅约20周，少于 15%的存活超过24周(图1A)。在PLN-R9C系中，观察到的最早死亡记录是12周龄， 而仅一只野生型对照鼠在24周死亡。在最早的死亡记录之前，八周被选为疾病‘早期’ 的代表性时间点，同时选择16周，是因为其是8至24周之间的中点(经典DCM)。离 体心脏的详细病理学分析显示了 PLN-R9C小鼠甚至在8周龄时心室和心房扩大的证据。 横切片离体心肌(得自野生型和PLN-R9C小鼠)，然后苏木紫及伊红染色，证据也显示 转基因动物在8周开始左心室扩张或心室壁变�。婺炅湓龀だ┱偶绦又�。对8、16和24周龄的雄性小鼠用超声波心动描记术进行心脏功能测定(汇总于 表1中)。前后壁厚度的超声波心动描记术测定结果显示R9C小鼠在8周时具有显著的 扩张，且在小鼠生存期内持续恶化。收缩性用心脏缩短来 评估(图1B)，也是在8周时 轻微但显著地减低，而更显著的减低在16周时变得明显。所分析的雌性小鼠与雄性显示 相同的结果(数据未显示)。表1
野生型和R9C雄性小鼠在8、16和24周时的超声心动图和血液动力学参数
权利要求
1.一种评估个体心力衰竭的方法，其包括以下步骤a)测量从个体获得的样品中标记分泌型卷曲相关蛋白3(SFRP_3)的浓度，b)任选测量所述样品中一种或多种其它心力衰竭标记的浓度，和c)将步骤(a)测得的浓度以及任选步骤(b)测得的浓度与对照样品确定的所述一种或 多种标记的浓度进行比较，从而评估心力衰竭。
2.权利要求1的方法，其进一步的特征是所述样品选自血清、血浆以及全血。
3.权利要求1和2的任一项的方法，其进一步的特征是所述一种或多种其它标记选自 利尿钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记以及炎症标记。
4.权利要求3的方法，其进一步的特征是所述一种或多种其它标记是NT-pmBNP。
5.权利要求3的方法，其进一步的特征是所述一种或多种其它标记是肌钙蛋白T。
6.蛋白SFRP-3作为标记分子在评估心力衰竭中的用途。
7.包括SFRP-3和一种或多种其它心力衰竭标记的标记组合在评估心力衰竭中的用途。
8.权利要求7的标记组合的用途，其中所述一种或多种其它标记选自利尿钠肽标记、 心肌肌钙蛋白标记和炎症标记。
9.权利要求8的标记组合的用途，其包括至少SFRP-3和NT-proBNP。
10.一种用于实施权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包括特异性测定SFRP-3以 及任选的所述一种或多种其它心力衰竭标记所需要的试剂。
11.权利要求1的方法，其中测量获自心力衰竭风险个体的样品中的标记SFRP-3。
全文摘要
本发明涉及一种体外评估心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤测量样品中标记SFRP-3的浓度，任选测量样品中一种或多种其它心力衰竭标记的浓度，并通过将测定的SFRP-3浓度和任选测定的所述一种或多种其它标记浓度与在对照人群确定的所述一种或多种标记的浓度进行比较来评估心力衰竭。还公开了SFRP-3作为标记蛋白用于评估心力衰竭的用途，包括SFRP-3的标记组合和用于测量SFRP-3的试剂盒。其它优化标记选自利尿钠肽标记、心肌肌钙蛋白标记、炎症标记、NT-proBNP和肌钙蛋白T。
文档编号G01N33/68GK102027374SQ200980116163
公开日2011年4月20日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月30日
发明者A·埃米利, A·格拉莫利尼, D·布洛克, D·麦克伦南, G·赫斯, H·许迪希, P·刘, S·阿拉布, U-H·温许斯-特伦 申请人:多伦多大学董事局, 霍夫曼-拉罗奇有限公司
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