专利名称：与疾病相关的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于获得来自个体的与疾病相关的核酸信息的方法。本发明涉及用于获得关于个体核酸的信息和关于疾病之核酸特别是与疾病相关的致病性微生物核酸信息的方法。本发明还提供了用于该方法的一种固定了探针的基底(substrate)，特别是固定了探针的芯片。
通过从患者中获得样品(诸如血)，且从样品中提取核酸，则可获得该患者固有的核酸。如果将该患者固有的核酸进一步经过基因分析，可得关于该患者体质易感性的信息，诸如该患者对疾病的易感性，药剂的功效，和/或副作用的产生。结果，可获得患者特异性的信息。这类根据个体患者设计的治疗被称为“个性化的医疗护理(因人而异的医疗护理)”。
长久以来一直期望开发基于获自患者的标本，从而提出更准确和方便的适于疾病的医疗方案的方法。
所有文献及专利出版物在此全文引入作为参考。
本发明涉及获自个体与疾病之核酸信息的相关联。在此处公开的实施方案中，个体患有与致病性微生物相关的疾�。绮《�、细菌、酵母或支原体。且本发明涉及获自个体中存在的致病性微生物的核酸与个体核酸的信息的相关联。
因此，一方面，本发明提供了获得与个体特定疾病相关的核酸信息的方法，尤其是与治疗个体疾病的应答相关的核酸信息的方法，以及获得与来自存在于个体中的致病性微生物产生的特定疾病相关的核酸信息的方法。本发明还涉及用于鉴定来自个体和来自致病性微生物核酸的特定核酸探针。在一些实施方案中，核酸探针被固定在基底(如芯片)上。本发明还涉及用于此方法中的固定了探针的基底，如固定了探针的芯片。其它基底，如DNA毛细管电泳装置，一些种类的珠，膜基检测、微滴定板、电极、一些种类的基于半导体的装置、一些种类的波导材料、表面胞质共振(SPR)、石英晶体微平衡(QCM)和质谱也可用于本发明。此外，等位基因特异性寡核苷酸杂交、限制性方法(微滴定诊断凝胶电泳)、连接方法(挂锁(padlock)探针、寡核苷酸连接检测、染料标记的寡核苷酸连接)、核苷酸掺入(微测序、模板介导的染料末端检测)和介入分析也可用于本发明，其它在溶液中的普通杂交技术也可用于本发明，诸如扩增方法(聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，链置换扩增(SDA)，环介导的等温扩增(LAMP)，等温及嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)，分支DNA)等均可用于检测个体和致病性微生物。
从个体获取的含有核酸的样品包括全血、血液、血清、白细胞、尿、排泄物、精液、唾液、活检样品、培养的细胞和痰。优选的样品是血。样品优选地含有来自该个体的与治疗疾病的应答相关的核酸，以及存在于该个体中的致病性微生物的核酸，其中所述致病性微生物与疾病相关。如需要，样品可经过诸如匀浆和提取的预处理。预处理可由本领域技术人员根据样品的类型适当地选定。
在一个示例性实施方案中，首先从人中获得全血样，然后利用市售的人类基因组提取试剂盒(例如，QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(商品名，由QIAGEN制造，东京，日本))，从该全血样中获得来自人类基因组的核酸，以及来自存在于人中的病毒基因组的核酸。在一些实施方案中，将可能含有靶序列的核酸扩增。然后，将如此获得的扩增产物通过与固定了探针的芯片杂交，随后检测结合到芯片的核酸来分析。通过这种方法，获得了关于来自个体的与特定疾病相关之核酸的信息，以及与特定疾病相关的，来自存在于该个体的致病性微生物之核酸的信息。
在上述方法中，作为个体的例子，可使用人类。但是，个体不限于人类。根据本发明的一个方面，“个体”可为任何一种脊椎动物，包括哺乳动物如灵长类，包括人，狗，猫，牛，山羊，猪，绵羊和猴。其中，人为最适合的个体。根据本发明的一个方面，个体可为健康的或患有某种疾病。但是，一般地，如果用于患有由致病性微生物和该个体中某种核酸序列的类型所引起的疾�。痉⒚鞯姆椒ǹ筛行У厥褂�。此处所用的术语“特定疾病”包括与一种致病性微生物(例如病毒、细菌、酵母或支原体)相关的疾病以及肿瘤疾�。叛〉兀侵赣胫虏⌒晕⑸锵喙氐募膊。叛≌庋募膊。浞⑸椭瘟菩Ч娲嬖谟诨加懈眉膊〉母鎏逯械暮怂崂嘈停�/或具有该核酸的基因表达与否之不同而不同。但是，并不特别限定所述疾病。
术语“靶核酸”如此处所用是指含有待检测和/或分析的序列的核酸。
根据本发明的一个方面，至于来自待提取的个体的核酸，可使用任何核酸，只要其来自一种个体。更具体地，核酸可为DNA、RNA和基因组DNA中的任一种。至于来自待提取的致病性微生物之核酸，可使用任何核酸，只要它来自靶致病性微生物，且更具体的，DNA或RNA。
一种用于从样品提取核酸成分的方法不限于前述方法。可使用利用酚-氯仿的液-液提取法、利用一种载体的固-液提取法，等。或者，可使用(但不限于)市售的用于核酸提取的试剂盒，称为QIAamp(QIAGEN制造)，基因组DNA纯化试剂盒(Promega制造)，或SMAI测试(Sumitomo Metal Co.，Ltd制造)。如此提取的核酸可经过或不经过诸如PCR的扩增。
在当提取的核酸成分为RNA时，RNA可直接用作测试核酸。或者，利用反转录酶从RNA制备的cDNA可用作测试核酸。在这种情况中，来自个体的核酸以及来自致病性微生物的核酸可以混合物形式使用，无需分离。更具体的，这些核酸可利用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒按照前述方法提取，用反转录酶处理，然后经过PCR扩增。
根据本发明的一个方面，扩增可利用任一已知的扩增方法进行，只要其普遍用于扩增核酸。扩增优选通过聚合酶链反应(以下称为PCR)的方法进行。如果样品含有足够量的核酸，则扩增步骤可省略。
根据本发明的一个方面，一种固定了探针的基底(如固定了探针的芯片)包含具有不同碱基序列的且固定于基底上的第一种探针和第二种探针。第一种探针用于检测来自与特定疾病相关的致病性微生物之特异性核酸序列的存在。第二种探针用于检测来自个体的特异性核酸的存在。
这种固定了探针的基底特别有利，因为来自两种不同来源(诸如个体和致病性微生物)的核酸可利用相同基底同时分析。这种固定了探针的芯片由本发明人首次公开。根据本发明，这种固定了探针的基底作为本发明的一个方面来提供。
在本发明的固定了探针的芯片上，第一种探针用于检测来自样品(如来自人类患者的全血样本)中所含致病性微生物之核酸序列的存在与否。至于探针，该探针具有相应于来自致病性微生物之染色体DNA或基因(RNA)的碱基序列，所述致病性微生物可感染靶生物(如，人类患者)。此外，可使用相应于cDNA，cRNA，各个染色体DNA，RNA，cDNA和cRNA的片段，或每一片段的互补序列作为第一种探针。
此外，包含于样品中的致病性微生物的量可利用第一种探针测定，即，一种具有相应于来自于致病性微生物的核酸序列、核酸序列的片段，或核酸或其片段之互补序列之碱基序列的探针。
预期，第一种探针不仅用于检测包含于样品中的致病性微生物的存在，而且用于检测致病性微生物的基因突变的存在。
由样品中致病性微生物表达的核酸(RNA)可用第一种探针测量，即，一种具有相应于来自致病性微生物的核酸序列、核酸序列的片段、或核酸或其片段之互补序列之碱基序列的探针。在这种情况中，探针可定性或定量检测RNA，cDNA，或cRNA。
在一个其中致病性微生物为病毒的实施方案中，由于病毒在生长期表达大量特定基因，如果可测定表达模式(数量，质量)，则可评估药剂的功效。
根据本发明的一个方面，用在固定了探针的芯片中的第二种探针是相应于来自个体且关于疾病的染色体DNA或基因(RNA)。此外，可使用相应于cDNA，cRNA，各个染色体DNA，RNA，cDNA和cRNA的片段，或每一片段的互补序列作为第二种探针。与“疾病相关的”个体核酸定义为一种存在于个体细胞之染色体中的核酸序列，且其预示对治疗的应答。更具体地，核酸序列预示个体对疾病的易感性，药剂的功效和/或副作用的发生。
由于存在第二种探针，就可能检测特定核酸序列的存在，特定基因的表达量，以及在个体中基因的表达模式。
期望的是，根据本发明的第一种探针和第二种探针具有至少11个碱基，优选至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个碱基的序列。如果待固定于基底上的碱基序列的长度过长，则难以区分单碱基的变化。相反，如果待固定于基底上的碱基序列的长度过短，则难以确定样品中含有的碱基序列。
至于第一种或第二种探针，可使用寡核苷酸，如核糖核酸(RNA)，脱氧核糖核酸(DNA)，肽核酸(PNA)，甲基磷酸酯核酸，或S-oligo；或多核苷酸，如cDNA和cRNA。
根据本发明的一个方面，通过将包含前述碱基序列的第一种探针和第二种探针固定于基底上制备固定了探针的基底，所述基底由基板、多孔材料(Beattie，et al.，Clin.Chem.，41，700(1995))、微滴定板(Kawai et al.，Anal.Biochem.，209，63(1993))、珠(Mirkin et al.，Nature，382，607(1996))、球形材料、颗粒材料、磁性材料或磁性珠(Miller et al.，J.Magnet.Magn Mater 225，138(2001))，DNA毛细血管电泳芯片(Chou，et al.，PNAS，96，11(1999)，膜基分析(Lemieux et al.，Molecular Breading，4，277(1998))，一些基于半导体的装置(Thewes，etal.，2002 IEEE Internation Solid-State Circuits Conference，350(2002))，一些波导材料(Piunno，et al.，Anal.Chem.Acta.，288，205(1994))，SPR(Nelson et al，Anal.Chem.，731，(2001))，QCM(Ito et al.，Anal.Chim.Acta，327，29(1996))，和质谱(Amexis et al，PNAS，98，12097(2001)形成。用于固定核酸的基底的质量、大小和形状不特别限定。具有任何质量、大小和形状的材料均可用作基底，只要它可固定核酸。通过固定了探针的基底的方法检测样品中的核酸序列，例如通过从获自个体之样品中提取核酸成分，以获得测试核酸，将测试核酸与固定了探针的基底(如固定了探针的芯片)接触，并检测固定了探针的基底上的探针与测试核酸之间的杂交反应。
为检测固定了探针的芯片上的探针与样品中的核酸成分之间的杂交反应，本发明构思了(1)一种利用标记物的方法，和(2)一种利用电化学手段的方法。
(1)在利用标记物的方法中，测试核酸事先用一种荧光染料(如FITC，Cy3，Cy5或罗丹明)；一种酶(如生物素、半抗原、氧化酶或磷酸酶)；或电化学反应性物质(如二茂铁或醌类)标记。或者，另一种用这类标记物标记的探针用于检测杂交反应。可同时使用多种标记物。
(2)在使用电化学手段的方法中，固定了探针的芯片用作电极，方法是利用导电性材料用于形成用来固定探针的固定了探针之芯片的基底。在这种情况中，除了前述电极，还使用相对电极和参比电极来检测杂交反应，方式如常规电化学检测方法。至于参比电极，可使用普通参比电极，诸如由银和氯化银形成的电极或由汞和氯化汞形成的电极。固定了探针的芯片可如下形成将具有不同碱基序列的探针固定在不同导电基底上，并在相同基板(base plate)上排列这些导电基底。如果使用这种固定了探针的芯片，检测可准确进行。在这种情况中，可检测哪一个电化学信号是来自哪一个电极。
在一些实施方案中，由样品提取的核酸成分与固定了探针的芯片上所固定的探针之间的杂交反应可如下进行。杂交反应在具有范围0.01-5的离子强度和pH范围5-10的缓冲液中进行。杂交反应溶液可含有添加剂(如硫酸葡聚糖)作为杂交加速剂、鲑精DNA、牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂。将从样品中提取的核酸成分加入缓冲溶液，于90℃或更高温度下加热变性。可在变性后立即将固定了探针的芯片插入，或在迅速冷却到0℃后插入。或者，杂交反应可通过将杂交反应溶液滴加到基底上进行。反应可伴随搅拌或在振荡反应溶液的条件下进行以增加反应速度。反应可在范围从10-90℃的温度下进行约1分钟或过夜。杂交反应结束后，取出电极，用具有范围0.01-5的离子强度和pH范围从5-10的缓冲液洗涤。
(1)在使用标记物的方法中，杂交反应的存在通过检测标记的碱基序列或包含在样品中的第二种探针的标记物来检测，方法是利用根据标记物的类型适当选择的检测装置。更具体地，在使用荧光标记的情况中，可使用荧光检测仪。
(2)在使用电化学手段的方法中，检测如下进行。在基底洗涤后，将一种双链识别物质加到电极的表面，所述双链识别物质能选择性结合一种双链部分。此处所用的双链识别物质不特别限定，可包括例如，双链嵌入剂，如hoechst 33258，吖啶橙，奎吖因，道诺霉素，金属嵌入剂，和二吖啶(bisacridine)；三嵌入剂(trisintercalator)；以及多嵌入剂(polyintercalator)。此外，这类嵌入剂可事先用一种电化学活泼的金属复合物(如二茂铁或viologen)修饰。这类DNA结合物质的浓度随嵌入剂的类型之不同而不同，但是，一般在1ng/mL-1mg/mL范围内。在这种情况中，使用具有范围0.01-5的离子强度和pH范围5-10的缓冲液。在电极与双链识别物质反应后，洗涤，并经过电化学测量。
电化学测量这样进行施加至少一种能使双链识别物质电化学反应的电势，随后测量由双链识别物质产生的电流。电势可通过以恒定速率交换或以脉冲方式施加。或者，可施加恒定电势。在利用装置如稳压器，或数字万用表或振荡器控制电流和电压的同时测量反应电流。靶核酸的浓度可用标准曲线从基于如此获得的电流计算得出。
利用电极的碱基序列检测装置包括核酸提取部分、核酸反应部分、双链识别物质反应部分、电化学测量部分和洗涤部分。
电化学方法中另一种用于测量杂交反应的DNA芯片在下面的文件中公开。Hashimoto et al.报道了用DNA探针和电化学活性染料修饰的金电极进行序列特异性基因检测。来自染料的阴极电流与靶DNA浓度相关。Wang et al.报道了不含指示剂的电化学DNA杂交生物传感器。传感器形式(format)包括将肌苷替换的(无鸟苷)探针固定于碳膏电极，以及通过靶的鸟苷氧化峰出现对双链形成的直接计时电位滴定检测。这些文件在此引入作为参考。
在电化学测量中，不必需用标记物标记样品。由于检测可通过测量电信号进行，不需要用于检测荧光的复杂系统。因此，电化学测量系统的体积如需要可被减小。
根据本发明的一个方面，在一个简单的过程中，不仅可获得关于某种疾病的个体患者之核酸序列的信息，还可获得关于感染患者的致病性微生物之核酸序列的信息，其来自获自该患者的样品(如血)。
根据本发明的一个方面，固定了探针的基底用于评估针对患有某种疾病的个体之适当的治疗方法。固定了探针的基底包括固定在同一基底上的第二种探针和第一种探针，第二种探针可用于获得关于与疾病相关联的核酸序列的信息，所述核酸存在于个体的细胞之染色体上。第一种探针可用于获得与该疾病相关的致病性微生物之核酸序列的信息。利用固定了探针的基底，可以一种简单的方法同时获得来自个体以及来自从该个体获取的样品的致病性微生物之关于特定疾病的信息，和/或预示对特定疾病治疗的应答的信息。
在一些实施方案中，方法和固定了探针的基底可用于评估丙型肝炎治疗的功效。另一些实施方案中，方法和固定了探针的基底用于评估AIDS的治疗(HIV的滴度和突变)。另一种实施方案是方法和固定了探针的基底用于评估乙型肝炎的治疗(HBV滴度、类型和突变)。
丙型肝炎的治疗功效可利用根据本发明一个方面的方法来评估。下面以举例的方式描述该实例。
已知丙型肝炎例如会发展为肝硬化，进一步成为肝癌。作为丙型肝炎的一种治疗方法，已知施用干扰素(此后称为IFN)。干扰素α和β常用于治疗。但是，IFN的功效变化较大。例如，干扰素仅对约20-30％的日本来源之人类患者有效。即使IFN对人类患者有效，IFN还存在对人类患者的强副作用的问题。这种IFN功效的变化据信是由于感染患者的丙型肝炎病毒(此后称为HCV)的基因型(见，J.Clin.Microbiol.，34，2516(1996))以及病毒的量不同，以及感染该病毒之患者的核酸序列的不同。基于HCV基因组不同区域之核苷酸与推定的氨基酸序列的比较，至少已报道了6种主要基因型(Forns et al.，J.Clin.Microbiol.，34，2516(1996)，Andonov et al.，J.Clin.Microbiol.，33，254(1995)。
根据本发明的一个方面，评估IFN对丙型肝炎的功效。术语“干扰素(IFN)”如此处所用包括干扰素α，β，γ和/或ω。例如，如果感染患者的丙型肝炎病毒是Ib型(在日本所见的主要类型)，则IFN不甚有效。这意味着血清中HCV-RNA、HCV-抗体、GOP和GTP的浓度不因IFN治疗而降低。但是，如果病毒类型是2a，则IFN的功效很高。这意味着血清中HCV-RNA、HCV-抗体、GOP和GTP的浓度因IFN治疗而降低。另一方面，如果病毒的量达到106拷贝/ml或以上，则IFN的功效低。因此，为在核酸水平上核查感染患者的病毒的基因型和量，使用根据本发明的第一种探针。
例如，作为一种用于检测样品中丙型肝炎病毒(HCV)之核酸序列是否存在的探针，使用相应于HCV-RNA、HCV-RNA片段、HCV-RNA互补序列或其片段的碱基序列。期望的，本发明的探针具有至少11个碱基，优选具有至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个碱基，用于检测HCV-RNA的基因型或突变。另一方面，长于至少30个碱基，优选至少约40，50，60，70，80，90，100，200，500，1000个碱基的探针优选用于检测HCV基因组。11-30的长度为适当的芯片形式，比30碱基更长的探针可适于一般的杂交形式。例如，具有相应于如SEQ ID NO1，2，3，和4及其互补序列的碱基序列之探针可以使用。这些序列几乎在所有HCV基因型中均保守(Andonov，et al，J.Clin.Microbiol.33，254(1995)。
至于本发明的第一种探针，优选使用不仅能检测样品中致病性微生物存在与否，而且能检测致病性微生物的基因突变的探针。在丙型肝炎的例子中，据报道，IFN的功效随HCV病毒的核酸序列之位点特异性突变的存在与否而变化(Nagayama，et al，Hepatology，31，745(2000))。作为用于检测包含于样品中HCV病毒的核酸序列之位点特异性突变之第一种探针的例子，可使用这样的探针，其具有用来确定HCV多蛋白之位于第434，580，938，962，1176或2774位的氨基酸的碱基序列(如Hepatology，31，745(2000)所述)。肝细胞癌(HCC)患者的HCV-1b基因组序列比那些来自无症状携带者(ASC)的更倾向于具有更多的突变型残基。如果使用这样的探针，在可准确评估IFN针对丙型肝炎的功效。
如上述，已报道了IFN治疗的功效随着HCV基因型的不同而不同。因此，第一种探针可以是相应于HCV-RNA、HCV-RNA片段、HCV-RNA互补序列或其片段的碱基序列。更具体地，第一种探针可选自用于特异性检测HIV1型(SEQ ID NO5)、2型(SEQ ID NO6)和3型(SEQ ID NO7)的基因型之探针，这取决于待检测的基因型。换言之，用于检测HCV的第一种探针可以是一种具有相应于由SEQ ID NO5，6，或7及其互补序列中任一个所示序列的序列之核酸。
当使用能检测基因型的探针时，如果相应于不同基因型的探针被固定在同一基底上，可准确进行检测。
样品中的致病性微生物之基因型可如下检测。在一种实施方案中，将致病性微生物的核酸序列首先利用特异于基因型的引物经过PCR，然后利用一种固定化的通用探针检测基因型。在此使用的通用探针一般定义为一种能检测所有丙型肝炎病毒而无论其基因型如何的探针(Andonov et al.，J.Clin.Microbiol.，33，254(1995)。
在丙型肝炎的情况中，利用如SEQ ID NO8或9所示碱基序列作为有义链，且利用如SEQ ID NO10(对于基因型1a)、SEQ ID NO11(对于基因型1b)、SEQ ID NO12(对于基因型2)或SEQ ID NO13(对于基因型3a)所示的碱基序列作为反义链。此后，利用如通用探针和SEQ ID NO15所示的碱基序列进行检测。
样品中致病性微生物的量可利用第一种探针测量，所述第一种探针具有相应于来自致病性微生物的核酸序列的碱基序列，或者相应于核酸的片段的碱基序列，或其互补序列。
据报道，在丙型肝炎中，IFN治疗的功效取决于血液中HCV的量(J.Clin.Microbiol.，33，254(1995))。对于血清中携带HCV超过106拷贝/ml的患者，IFN不甚有效(Yeh et al，J.Med.Biol.，66，48(2002))。作为评估病毒量的探针，可使用相应于HCV-RNA、HCV-RNA片段或者每个HCV-RNA互补序列或其片段的碱基序列。如果样品中的核酸被用荧光素标记物标记，病毒的量(即病毒的浓度)是这样测量的利用固定了探针的芯片上的探针与核酸杂交，随后测量荧光标记物的荧光强度。在电化学方法的情况中，病毒的浓度是这样获得的将固定了探针的芯片上的探针与核酸杂交，随后测量由该芯片产生的电流值。
在本发明固定了探针的芯片上，如果前述探针(SEQ ID NO5，6和7)用作第一种探针，则可能获得关于致病性微生物(如感染个体的病毒)的基因型、病毒的量、是否存在定点突变、以及表达的基因之质量和种类的信息。结果，如果表达病毒是1b基因型(其为在日本患者中主要所见的)，IFN不甚有效，而当病毒是2a基因型时，IFN有效。另一方面，如果病毒的量达到106拷贝/ml或以上，则认为IFN的功效低。因此，其可能用于评估针对个体的IFN治疗的功效。
本发明人已报道了另一种用于确定针对丙型肝炎的IFN功效的方法，见日本专利申请2001-62371和2001-62372。在该方法中，IFN治疗的功效是这样确定的利用了存在于编码MxA蛋白的人类基因的启动子区域(此后称为MxA启动子区域)的特异性单一核苷酸多形性(以后称为SNP)。对于在MxA启动子区域带有特定类型的SNF之患者，IFN有效。因此，IFN治疗的有效性可通过检查SNP的存在来评估。因此，在一个实施方案中，用于检测个体核酸的第二种探针用于在MxA启动子区域检测SNP。
根据上述发现，在MxA启动子区域之-88位(以下称为“MxA-88”)为G/G时，IFN治疗的有效性较低，而在为G/T和T/T的情况中有效性高。另一方面，在MxA启动子区域之-123位(以下称为“MxA-123”)为C/C时，IFN治疗的有效性较低，而在为C/A和A/A的情况中有效性高。基于这些事实，评估了IFN治疗的有效性。术语“-88位”以及“-123位”是当MXA基因的转录起始位点认为是+1时的相对位置。WO 01/71007
图1显示了MxA基因启动子区域的核苷酸序列。
因此，根据本发明的一个方面，针对丙型肝炎的IFN治疗功效可如下评估，方法是利用固定了探针的芯片在获自个体的样品中进行关于HCV的基因分析，以及进行关于来自个体的编码MxA蛋白的基因之启动子区域的基因分析，所述芯片包含固定于其上的第一种探针和第二种探针，其中第一种探针用于检测HCV基因的存在与否，并进一步检测HCV的基因型或基因突变，第二种探针用于检测在来自个体的编码MxA蛋白之基因的启动子区域中存在的SNP碱基类型。结果，可容易地预示IFN治疗的功效。
此外，至于一种评估针对丙型肝炎的IFN治疗功效的方法，已知一种通过核查编码甘露糖结合凝集素(以下称为MBL)的基因之两个SNP位点用于评估IFN治疗功效的方法(M.Matsushita et al.，J.Hepatology，29；695-700，1998)。MBL是引发免疫系统的关键因子，且具有遗传多形性。基因型“XB”的一组MBL不应答IFN。Laursen报道了MBL的序列(Immunology，93，421(1998)。该文件在此引入作为参考。关于编码甘露糖结合凝集素的基因之基因分析可单独进行，或与关于编码MxA蛋白之基因的启动子区域之基因诊断一起进行。
影响IFN功效的MBL多形性在如下位置存在MBL基因的启动子区域的-221位置(以下称为“MBL-221”)，以及MBL基因的外显子1之第52，54和57位密码子。术语“-221位置”是当MXA基因的转录起始位点认为是+1时的相对位置。
C和G是可能占据MBL基因的221位的碱基。当C占据221位时，MBL基因的基因型称为“X”。当G占据221位时，MBL基因的基因型称为“Y”。这一命名是根据Madsen et al.(Madsen HO，Garred P，Thiel S，Kurtzhals JAL，Lamm LU，Ryder LP，et al.，″Theinteraction between promoter and structural gene controls theminimum serum level of a human mannan-binding protein″，J.Immunol.1995；1553013-20)。该文献在此引入作为参考。
MBL基因外显子1的第52，54，和57位密码子存在于结构基因，即，胶原样结构域中。密码子52之可能的序列(基因型)是CGT或TGT。根据Madsen命名法，前者的基因型被归为A型，后者被归为D型。类似地，密码子54之可能的序列(基因型)是GGC或GAC。前者的基因型为A型，后者为B型。同样，密码子57之可能的序列(基因型)是GGA或GAA。前者的基因型为A型，后者为C型。在所有密码子中，A型是野生型的等位基因，B、C和D型是突变型的等位基因。在当所有密码子52、54和57的等位基因为A型时，与其他至少一个密码子52、54和57的等位基因不是A型的情况相比，IFN的功效较高。
相比于其他类型的患者(即Y非A-YA杂合以及Y非A-Y非A同型纯合类型，其MBL-221位是Y型，且密码子52、54和57的等位基因不是A型)而言，IFN对YA-YA同型纯合型患者(所述患者的MBL-221位为Y型，且密码子52、54和57的等位基因为A型)的作用更有效。反过来说，IFN对Y非A-YA杂合以及Y非A-Y非A纯合同型类型患者的作用不如对YA-YA同型纯合型患者的作用有效。
由上述发现，可确定适当的第二种探针。在其中疾病为丙型肝炎，药剂为IFN的实施方案中，用于与个体核酸杂交的第二种探针(包括用在固定了探针的芯片上的)是检测如下述的MxA启动子的SNP之探针。在其中疾病为丙型肝炎，药剂为IFN的实施方案中，用于与个体核酸杂交的第二种探针(包括用在固定了探针的芯片上的)是检测与下述IFN功效相关的MBL多形性的探针。
具有单核苷酸多形性(SNP)(存在于每个这种碱基序列的第455位和420位)的人MxA基因的启动子区域与IFN治疗的功效相关。因此，由SEQ ID NO16，17，18，19，37，38，39和40所示的碱基序列，各自包括人类MxA基因的启动子区域。
在又一实施方案中，第二种探针可选自如下(at455)，如序列表中SEQ ID NO16所示的碱基序列；(bt455)，一种通过修饰(at455)所示的序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了455位的碱基)或向其上添加至少一个碱基；用于检测MBL多形性的修饰的探针保留了与编码MBL之个体核酸杂交的能力。利用修饰了的探针之杂交条件不同于一般探针。期望地，根据本发明的修饰的探针具有至少11个碱基，优选至少12个碱基，更优选至少13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29甚至30个碱基的序列，用于检测HCV、RNA的基因型或突变。另一方面，长于至少30，优选至少约40，50，60，70，80，90，100，200，500，1000碱基的探针也优选用于检测HCV基因组。11-30的长度适于芯片形式，超过30个碱基的更长探针可适于一般的杂交形式；(ct455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的441位-455位碱基的序列；(dt455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的449位-459位碱基的序列；(et455)，一种选自(at455)-(dt455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；
(ag455)，一种由序列表中SEQ ID NO17所示的碱基序列；(bg455)，一种通过修饰(ag455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(cg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的441位-455位碱基的序列；(dg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的449位-459位碱基的序列；(eg455)，一种选自(ag455)-(dg455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa455)，一种由序列表中SEQ ID NO18所示的碱基序列；(ba455)，一种通过修饰(aa455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(ca455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的441位-455位碱基的序列；(da455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的449位-459位碱基的序列；(ea455)，一种选自(aa455)-(da455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ac455)，一种由序列表中SEQ ID NO19所示的碱基序列；(bc455)，一种通过修饰(ac455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了455位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(cc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的441位-455位碱基的序列；(dc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的449位-459位碱基的序列；(ec455)，一种选自(ac455)-(dc455)的碱基序列的碱基序列的互补序列。
由SEQ ID NO16，17，18，19，37，38，39和40所示的碱基序列各自包括一个人MxA基因的启动子区域。在每一这些碱基序列的455位和420位存在的单一核肽多形性(SNP)与IFN治疗的功效相关联。
SEQ ID NO16-19的碱基序列相同，除了455位之外。SEQ IDNO16的序列之455位为胸腺嘧啶。SEQ ID NO17的序列之455位为鸟嘌呤。SEQ ID NO18的序列之455位为腺嘌呤。SEQ ID NO19的序列之455位为胞嘧啶。
具有由SEQ ID NO16所示核酸序列(其中455位为胸腺嘧啶)的HCV患者用IFN治疗有效，而缺乏该序列的HCV患者用IFN治疗无效。为更具体描述，与具有由SEQ ID NO16的核酸序列(其中455位为胸腺嘧啶)以及SEQ ID NO17的核酸(其中455位为鸟嘌呤)组成的异型杂合的HCV患者(称为“G/T异型”)相比，或与具有由SEQ ID NO17的核酸序列(其中455位为胸腺嘧啶)组成的同型纯合型HCV患者(称为“T/T同型”)相比，具有由SEQ ID NO17的核酸序列(其中455位为G)组成的同型纯合型HCV患者(称为“G/G同型”)用IFN治疗不甚有效，或者，与T/非T异型或T/T同型的HCV患者相比，具有由MxA基因启动子区域(其中455位不是胸腺嘧啶)组成的同源纯合型HCV患者(称为“非T/非T同型”)用IFN治疗不甚有效。非T/非T同型的组合之例子包括G/G、G/A，G/C，A/A，A/C和C/C。T/非T的组合之例子包括T/G，T/A，和T/C。
由SEQ ID NO37-40所示的碱基序列相同，除了425位碱基。SEQ ID NO37的425位是腺嘌呤。SEQ ID NO38的425位是胞嘧啶。SEQ ID NO39的425位是胸腺嘧啶。SEQ ID NO40的425位是鸟嘌呤。
在本发明的固定了探针的芯片中，如果碱基序列由SEQ ID NO16所示，其含有具有胸腺嘧啶的一个SNP位点，则碱基序列片段或任一互补序列(at455)-(et455)用作第二种探针(用于检测来自个体的核酸的序列)，从而可在治疗之前知道碱基序列(包括来自个体的人MxA基因之启动子区域)的SNP位点是否为胸腺嘧啶。这样，可评估用于个体的IFN治疗的功效。
如果在IFN治疗前确定了一个HCV患者之SNP位点的碱基(所述SNP位点属于包含人MxA基因之启动子区域的碱基序列)，则可评估IFN是否对该HCV患者有效。
在本发明的固定了探针的芯片中，如果用如下任一种序列作为第二种探针由含有鸟嘌呤SNP位点的SEQ ID NO17所示的碱基序列，该碱基序列的片段，或任一互补序列(ag455)-(eg455)，由含有腺嘌呤SNP位点的SEQ ID NO18所示的碱基序列，该碱基序列的片段，或任一互补序列(aa455)-(ee455)，和由含有腺嘌呤SNP位点的SEQ ID NO19所示的碱基序列，该碱基序列的片段，或任一互补序列(ac455)-(ec455)，用于检测来自个体的核酸之序列，则可能鉴定来自个体包含人MxA基因的启动子区域之碱基序列的SNP位点的碱基。这样，可评估IFN治疗对个体的功效(见日本专利申请Nos.2001-62371和2001-62372)。
在其中疾病是丙型肝炎而药剂是IFN的实施方案中，用于与个体核酸杂交的第二种探针(包括用在固定了探针的芯片上的)是选自如下的探针(aa420)，一种由序列表中SEQ ID NO37所示的碱基序列；(ba420)，一种通过修饰(aa420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(ca420)，一种含有SEQ ID NO37所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(da420)，一种选自(aa420)-(ca420)的碱基序列的碱基序列的互补序列。
(ac420)，一种序列表中SEQ ID NO38所示的碱基序列；
(bc420)，一种通过修饰(ac420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(cc420)，一种含有SEQ ID NO38所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dc420)，一种选自(ac420)-(cc420)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(at420)，一种由序列表中SEQ ID NO39所示的碱基序列；(bt420)，一种通过修饰(at420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(ct420)，一种含有SEQ ID NO39所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dt420)，一种选自(at420)-(ct420)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ag420)，一种由序列表中SEQ ID NO40所示的碱基序列；(bg420)，一种通过修饰(ag420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换数个碱基(除了420位碱基)或向其上添加至少一个碱基；(cg420)，一种含有SEQ ID NO40所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dg420)，一种选自(ag420)-(cg420)的碱基序列的碱基序列的互补序列。
一个带有由SEQ ID NO37所示核酸序列(其中425位是腺嘌呤)的HCV患者用IFN治疗有效，而一个不带有SEQ ID NO37的序列的HCV患者用IFN治疗则不甚有效。序列与IFN功效的关系几乎与当SNP位点存在于455位上的情况相同。
此外，在已证实可用IFN有效治疗的疾病是丙型肝炎的情况中，本发明的第二种探针可选自下述的序列(i)-(t)。这些序列(i)-(t)适于确定MBL-221的类型和密码子52，54和57的多形性的存在。
含有MBL-221和密码子52，54和57的MBL基因之序列示于SEQ ID NO41-56。MBL-221存在于这些序列的425位。
外显子1始于每一这类序列的646位。密码子52存在于868-870位。密码子54存在于874-876位。密码子57存在于883-885位。密码子52，54和57的SNP分别存在于868位，875位和884位。
(i)SEQ ID NO41-44的核酸片段，各自含有MBL-221的SNP位点，且各自含有相应于418-432位的核酸序列。
(j)SEQ ID NO41-44的核酸片段，各自含有MBL-221的SNP位点，且各自含有相应于421-430位的核酸序列。
(k)(i)和(j)片段的互补序列。
(l)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子52，54和57的SNP位点，且各自含有相应于868-885位的核酸序列，例如含有如SEQ ID NO45-56所示核酸的片段。
(m)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子52和54的SNP位点，且各自含有相应于868-876位的核酸序列，例如含有如SEQ ID NO45-56所示核酸的片段。
(n)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子54和57的SNP位点，且各自含有相应于874-885位的核酸序列，例如含有如SEQ ID NO45-56所示核酸的片段。
(o)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子54的SNP位点，且各自含有相应于874-876位的核酸序列，例如含有如SEQ IDNO45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列869-880位的片段。
(p)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子52的SNP位点，且各自含有相应于868-870位的核酸序列，例如，含有如SEQ IDNO45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列864-873位的片段。
(q)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子57的SNP位点，且各自含有相应于883-885位的核酸序列，例如，含有如SEQ IDNO45-56所示核酸的片段，特别是，含有序列880-890位的片段。
(r)SEQ ID NO45-56的核酸片段，各自含有密码子54的SNP位点，且各自含有包含875位的核酸，其中存在密码子54的SNP位点，例如，含有如SEQ ID NO45-56所示核酸的片段。
(s)由(i)-(m)所示的且具有长度为11-30个碱基的核酸片段。
优选地，对于MBL基因，探针序列含有至少420至430位，864-874位，870-880位和879-889位。对于MxA基因，探针序列含有至少450-466位。
(t)由(i)-(m)所示的核酸片段，其为(除了SNP位点)经删去、替换或添加一个或多个核苷酸的修饰的核酸。
在本文所附的序列表中的各个序列中，“N”和“n”代表腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤胞嘧啶中的任一个碱基。
在本发明的固定了探针的芯片中，由个体表达的核酸(RNA)可通过本发明的第二种探针测量，换言之，通过具有相应于来自个体的核酸序列、其片段、或核酸序列(或其片段)的互补序列之碱基序列的探针测量。在这种情况中，可检测或定量核酸序列。(其是RNA，cDNA或cRNA)。例如，由于IFN的功效随个体的体质易感性的不同而不同，如果基因的表达模式(即表达的基因的质量和数量)可测量，则可能评估当IFN实际施用时的功效。
根据本发明的一个方面，靶疾病不特别限定。任何疾病均可为靶，只要其可由致病性微生物诱发。本发明包括与致病性微生物相关的疾病。本发明也包括癌性疾病。
例如，可预测IFN治疗对于除了丙型肝炎之外的任一疾病的功效，只要其已知用IFN治疗有效。这类例子包括，但不限于，由病毒感染引起的感染性疾病，所述病毒包括诸如(甲、乙、丁、戊、己、庚)丙型肝炎病毒，HIV，流感病毒，疱疹病毒，腺病毒，人多瘤病毒，人乳头瘤病毒，人细小病毒，流行性腮腺炎病毒，人轮状病毒，肠病毒，日本乙型脑炎病毒，登革热病毒，风疹病毒，和HTLV；以及由细菌感染引起的感染性疾病，诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，溶血链球菌，致病性大肠杆菌，小肠炎弧菌，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，弯曲杆菌(Campylobacter)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，痢疾杆菌，沙门氏菌(Salmonellae)，耶尔森菌(Yelsinia)，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，李斯特杆菌属(Listeria)，钩端螺旋体属(Leptospira)，军团菌属(Legionella)，螺旋菌，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，立克次体，衣原体属，疟原虫，痢疾阿米巴原虫，和致病性真菌，以及由寄生虫和真菌(Eumycetes)引起的疾病。
此外，针对癌性疾病的IFN治疗功效可估计。癌性疾病包括遗传性疾�。油つ赶赴觯瞿赶赴觯易逍越岢ο⑷猓糯苑窍⑷饨岢Π窬宋霾。易逍匀橄�(胸)癌，着色性干皮�。莅谇话彻馨赴岢Π伟认侔伟鬃聪侔橄僦琢觯虻乐琢觯行陨称髦琢觯陨称髦琢觯し糁琢觯侨饬觯侨砉侨饬觯籽。馨土龊褪堤辶�。
根据本发明待检测的致病性微生物并不特别限定。例如，致病性微生物(如HCV)可在评估IFN治疗的功效中使用。但是，可以使用任何致病性微生物，只要其与已证实IFN治疗有效的疾病相关。如果一种致病性微生物可直接或间接与疾病相关联或与疾病的症状相关联，则此致病性微生物与该疾病相关。
这类致病性微生物的例子包括病毒，诸如(甲、乙、丁、戊、己、庚)丙型肝炎病毒，HIV，流感病毒，疱疹病毒，腺病毒，人多瘤病毒，人乳头瘤病毒，人细小病毒，流行性腮腺炎病毒，人轮状病毒，肠病毒，日本乙型脑炎病毒，登革热病毒，风疹病毒，和HTLV；以及细菌，诸如金黄色葡萄球菌，溶血链球菌，致病性大肠杆菌，小肠炎弧菌，幽门螺杆菌，弯曲杆菌，霍乱弧菌，痢疾杆菌，沙门氏菌，耶尔森菌，淋病奈瑟球菌，李斯特杆菌属，钩端螺旋体属，军团菌属，螺旋菌，肺炎支原体，立克次体，衣原体属，疟原虫，痢疾阿米巴原虫，和致病性真菌，以及寄生虫和真菌。
IFN治疗功效与疾病以及个体固有基因的相关性已用举例的方式描述。
但是，本发明不限于实施例。
在一些实施方案中，个体对获得性免疫缺损综合征(IDS)的易感性可从存在于个体中的人免疫缺损病毒(以下称为HIV)以及来自个体的基因的分析来预测。此外，分析了HIV基因和/或其拷贝(如，cDNA)的基因型和HIV基因的特定多形性。基于这些所得信息，可预测下列药剂的功效，包括蛋白酶抑制剂(如ritnavil(RTV)或噻喹努佛(SQV))和反转录抑制剂(如adifothymine(AZT)或双脱氧腺苷(ddl))。在一些实施方案中，个体对水痘或带状疱疹的易感性可通过对个体中存在的水痘、带状疱疹病毒和来自个体的基因分析来预测。或者，可分析抗病毒剂(如无环鸟苷)的功效。另一方面，如果确定了流感病毒的基因型，拷贝数和个体的基因型，可预测个体对流感的易感性和诸如Tamifulu的抗病毒剂的功效。当提取的核酸成分是HCV-RNA时，可使用HCV-RNA作为测试核酸。或者，HCV-RNA被用反转录酶转化为cDNA，然后用作测试核酸。
在使用能检测某种基因型的探针时，如果相应于不同基因型的多重探针被固定于同一基底上，可进行准确检测。下面的实施例意在阐明而不是限制本发明。实施例1描述了用于从人类受试者提取核酸的方法1.用于从人类患者提取人类基因组核酸以及病毒基因组核酸的方法从各个HCV患者中获取大约3ml血，至于含有EDTA2K的空血液收集管中。然后，利用QIAamp DNA B1ood Midi试剂盒(由QIAGENGmbH制造并销售)的方法从血液样品中提取核酸。在所得提取物中所含的HCV基因组RNA经过反转录反应。更具体地，从获得的提取物中获取等份，向其中加入六脱氧核糖核苷酸混合物(获自Takara K.K.)和M-MLV反转录酶(得自Life Technologies Inc.)，然后反应在42℃下进行30分钟。
2.关于HCV基因组RNA用人类基因组核酸提取试剂盒提取的提取率的研究当提取HCV基因组RNA时，一般用血清替代全血。在污染物如蛋白质被最大程度去除后，利用胍缓冲液等提取HCV基因组RNA。但是，在本发明的方法中，HCV基因组RNA与人类基因组RNA同时提取。因此，本发明人研究了利用用于全血的人类基因组核酸提取试剂盒，当与人类基因组RNA同时从全血中提取时，HCV基因组RNA的提取率。
比较了两种方法。一种是利用SepeGeneRV-R(得自SankoJunyaku K.K.)，从血清(100μL)中提取HCV基因组RNA的普通方法。另一种是利用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(QIAGENGmbH)从全血中提取HCV基因组RNA的方法，简称为“QIAamp方法”。用QIAamp方法提取的HCV基因组RNA进一步经过反转录酶反应，然后用乙醇沉淀纯化。用和不用乙醇沉淀的QIAamp方法之HCV基因组RNA的提取率加以比较。
利用HCV基因组RNA的5’UTR序列通过竞争性PCR(K.Chayama et al.，J.Gastroenterol.Hepatol.8，S40-44，1993)评估提取率。结果示于表1表1 HCV基因组核酸的提取方法的比较以及提取率
由上述结果，显然利用QIAamp方法比用普通方法之HCV基因组RNA提取率低大约10倍。因此推定HCV RNA不能由QIAamp方法从含有极低病毒浓度的血液样品中提取。因此，认为QIAamp方法之，建议通过QIAamp方法定性确定病毒。
如上述利用反转录反应获得的样品经过扩增方法以同时扩增人类基因组核酸和其中所含的HCV基因组RNA。
使用引物MxAF01和MxAR02用于扩增人类基因组。引物nc2(K.Chayama et al.，J.Gastroenterol.Hapatol.8，S40-44，1993，nt27-45)和引物33(Okamoto et al.，Jpn.J.Exp.Med 60，215-222，1990)用于扩增HCV基因组RNA。在单一试管中进行扩增。人类基因组核酸和HCV基因组RNA的扩增通过重复50次如下循环反应进行94℃30秒，55℃30秒以及2℃1秒。在进行PCR之前进行94℃预处理4分钟，在PCR后72℃下进行7分钟的后处理。引物序列MxAF015’-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3’MxAR025’-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3’NC25’-CCTGTGAGGAACTACTGTC-3’335’-GGTGCACGGTCTACGAGACC-3’结果，扩增了人类基因组DNA(大小610bp)和HCV基因组RNA(大小300bp)。由此，证实了从人类基因组DNA和病毒基因组RNA的提取步骤到基因组核酸的特定区域之扩增步骤以相同方式同时进行。
根据本发明，通过从个体提取的样品可简便、快速地评估该疾病的治疗。
此外，根据这一实施方案，可从个体中获取的单一样品中得到许多信息。因此，可防止有时在样品检测过程中发生的样品混杂的问题。或者，当处理极端危险的样品时，可防止从相比于常规情况而言极端危险的样品中的污染物扩散。同时，可最大程度降低由危险样品引起意外的风险。实施例2描述用于评估IFN治疗功效的DNA芯片在第一个地方，从人类患者血液样品中获取人染色体DNA和HCV-RNA。利用SEQ ID NO20和21所示的引物扩增135bp的人染色体DNA片段。用反转录酶处理HCV-RNA以制备cDNA。
前述步骤中获得的核酸样品通过由Phamacia Inc.制造并销售的试剂盒用FITC标记。
图1显示根据实施例2的DNA芯片的示意图。基底2是用聚赖氨酸包被的盖玻片。基底2上，点样各自为200nL的第二种和第一种探针，并干燥(图1中，第一种和第二种探针用参考号1-5显示)。在这种情况中，由SEQ ID NO22，23，24，25和26所示的序列用作第二种探针。由SEQ ID NO5，6和7所示的序列用作第一种探针。然后，用UV射线照射DNA芯片以将探针固定在基底2上。SEQ ID NO22-25的碱基序列分别为SEQ ID NO16-19的碱基序列的片段，各自含有455位的SNP位点。SEQ ID NO5-7的碱基序列是用于检测HCV病毒基因型(即1，2，3型)的探针。
用FITC标记的核酸溶解在2xSSC-1mmol/L EDTA溶液中。如此制备的核酸置于体积为20μL的反应室中，用固定了探针的盖玻片覆盖。在50℃进行反应12小时后，用0.2xSSC-1mmol/L EDTA溶液洗涤固定了探针的芯片两次。此后，测量从盖玻片发射的荧光强度。
结果，仅有SEQ ID NO22的探针的点发射明显的荧光。结果，来自人核酸且包含于血液样品中的MxA-88基因型被确定为T/T同型。此外，包含于血液样品中的病毒被确定为2型HCV病毒。由所得的荧光强度，确定病毒浓度为106拷贝/ml或以下。基于这些事实，评估IFN可有效作用于提供样品的患者。实施例3描述了用于评估IFN治疗功效的PNA芯片从患者血液样品中获取人类染色体DNA和HCV-RNA。利用SEQ ID NO20和21的引物扩增人类染色体DNA的135bp片段。另一方面，用反转录酶处理HCV-RNA以制备cDNA。利用如此获得的cDNA作为模板，以及SEQ ID NO10，11，12，13和14所示的引物(其为反义引物)进行PCR。
图2显示了实施例3的PNA芯片。如下制备固定了探针的芯片。将10个金电极13用接头14固定在玻璃基底12上。芯片上，将第一种PNA探针和第二种PNA探针(各自为200nl，用图中参考号7-11表示)点样于基底，静置1个小时。在这种情况中，由SEQ ID NO27，28，29，30和31所示的序列用作第二种PNA探针，其N末端已经用半胱氨酸修饰。由SEQ ID NO32，33，34，35和36所示的序列用作第一种PNA探针。SEQ ID NO27-30的碱基序列为包括由SEQ IDNO16-19所示序列的片段，各自具有碱基序列的455位SNP位点。SEQ ID NO32-36的碱基序列用于检测HCV病毒的基因型，即1a，1b，2a，2b，和3a。
随后，将样品溶解入2xSSC-1mmol/L EDTA溶液中。所得溶液置于20μL反应室中，用固定了探针的芯片覆盖。在50℃反应1小时，用0.2xSSC-1mmol/L EDTA溶液洗涤固定了探针的芯片两次。向该芯片逐滴加入10μmol/L的Hoechst 33258溶液。金电极13、其相对电极和参比电极已经被固定在固定了探针的芯片上。通过向金电极和相对电极之间施加电压，测量由Hoechst 33258的氧化电流。
结果，观察到获自金电极13的电流明显改变，所述电极上固定了具有SEQ ID NO27，28和34所示的序列之探针。由此，确定了来自人核酸且包含于样品中的MxA-88基因型为G/T异型。此外，包含于样品中的病毒被确定为2a型。因此，估计IFN可有效作用于从中获取样品的患者。
参考示于图3中的流程解释了一种基于病毒类型以及MBL和MxA基因型评估IFN治疗功效的方法。
用于评估IFN功效的流程图始于步骤3a，其中将样品(如血液样品)从待用IFN治疗的个体中获取。如需要，如此获得的样品可通过提取等方法纯化。随后，确定病毒类型以及MxA-88、MxA-123、MBL-22的基因型，和MBL胶原样结构域的密码子54。
随后，评估步骤到达3b。如果在步骤3a中存在1型病毒，步骤到达3c。如果在步骤3b中仅有2型病毒，则步骤到达3d。
在步骤3c中，通过检索数据表2(其中IFN的功效与基因型相关联)，可确定在步骤3a中确定的相应于MBL和MxA基因型的IFN功效。结果，评估了IFN治疗的功效。全部评估过程就此完成。
在步骤3d中，通过检索数据表3(其中IFN的功效与基因型相关联)，可确定在步骤3a中确定的相应于MBL和MxA基因型的IFN功效。结果，评估了IFN治疗的功效。完整的评估过程就此结束。
此处所用的数据表含有与基因型相关的对IFN的敏感性数据。
数据表2和3的数据分别示于表2和3。此处以举例的方式显示数据表2，3以及表2，3。可使用任何数据表和表，只要它们显示IFN与基因型之间的相关性。例如，表2显示IFN功效与患有1型HCV病毒的患者之基因型之间的关系。另一方面，表3显示了IFN功效与病毒的基因型之间的关系。待用的表可仅表示数据所需的项目。或者，表中可与数据所需项目一起包括其他项目。在实施例4的步骤3c和3d中，表2和3被引用作为数据表，其事先通过选择关于各个步骤之数据的必需项目而制成。但是，表2和3可结合为一个表。或者，表可显示除了数据必需项目以外的其他项目。为更具体描述，待示于表中的项目可如下选择。例如，待在步骤3c中使用的表如果包括了用1型HCV感染的患者之“基因型”，“有效患者百分率”以及“非有效患者百分率”就足够了。待在步骤3d中使用的表如果包括了用2型HCV感染的患者之“基因型”，“有效患者百分率”以及“非有效患者百分率”就足够了。但是，待列于表中的项目不仅限于此。实施者可任意选择待列于表中的项目。
示于表2和3中的数据值表示基因型与IFN敏感性或IFN功效的相应度。但是，基因型与IFN敏感性的相应度不一定必需用数字值表示。基因型与IFN功效之间的相关性可用任意方法表示，例如诸如○，×，和△的符号，和诸如1，2，3，4和5的评分(简化数字值)，只要其可表达相关性。
表2
(续)
表2
表3IFN治疗对病毒类型的影响
如果根据本发明研究了数据的许多项目，可更准确评估IFN治疗的功效。此外，如果使用根据本发明一个方面的方法和固定了探针的芯片，关于靶核酸的信息可从样品中方便、迅速和准确的获得。本发明前述方面是以举例的方法描述的，因此不限制本发明。
本发明的其他优点和改进对本领域技术人员显而易见。因此，本发明的较宽的范围不局限于此处显示和表述的具体细节和代表性实施方案。因此，可进行多种修饰而不偏离本发明所附权利要求书及其等同物定义的较宽的发明构思之精神和范围。
序列表<110>KABUSHIKI KAISHA TOSHIBAHASHIMOTO，KojiHASHIMOTO，MichieMISHIRO，ShunjiOOTA，Yasuhiko<120>与疾病相关的核酸的检测<130>01S1691P<150>JP 2001-90053<151>2001-3-27<150>JP 2001-284112<151>2001-9-18<160>72<210>1<211>21<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)<400>1ccctgtgagg aactwctgtc t<210>2<211>21<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>2ggtgcacggt ctacgagacc t 21<210>3<211>26<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>3tctagccatg gcgttagtry gagtgt 26<210>4<211>26<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>4cactcgcaag caccctatca ggcagt 26<210>5<211>18<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>5cgctcaatgc ctggagat 18<210>6<211>18<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>6cactctatgc ccggccat 18<210>7<211>18<212>PNA<213>丙型肝炎病毒<400>7cgctcaatac ccagaaat 18<210>8<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>8cgcgcgacta ggaagacttc20<210>9<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>9cgcgcgacgc gcaaaacttc20<210>10<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>10tgccttgggg ataggctgac20<210>11<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>11gagccatcct gcccacccca20<210>12<211>20<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>12gccccatgaa 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权利要求
1.一种用于获得如下信息的方法关于患有特定疾病的个体的核酸之第一种信息，和关于存在于所述个体中的致病性微生物之核酸的第二种信息，其中致病性微生物与特定疾病相关，包括(a)将该个体的核酸提取物与固定了探针的基底反应，其中所述基底包含第一种探针和第二种探针，第一种探针检测致病性微生物的特异性核酸序列的存在，其中所述致病性微生物与所述疾病相关，第二种探针检测该个体之特异性核酸序列的存在；以及(b)由(a)所述反应，通过检测与第一种探针结合的核酸存在与否以获得第一种信息，且通过检测与第二种探针结合的核酸存在与否以获得第二种信息。
2.权利要求1的方法，其中所述个体的核酸与疾病治疗的应答相关，且其中来自所述致病性微生物的核酸与来自该个体的核酸之存在与该疾病的治疗的应答相关联。
3.权利要求1的方法，其还包括将来自个体的核酸提取物进行扩增，以在步骤(a)反应之前获得扩增的核酸。
4.权利要求1的方法，其中所述个体是人。
5.权利要求1的方法，其中所述核酸提取物由全血制备。
6.权利要求5的方法，其中所述来自个体的核酸是人类基因组核酸；所述致病性微生物的核酸是基因组核酸。
7.权利要求1的方法，其中所述个体的核酸是人类基因组核酸；所述致病性微生物的核酸是RNA；且在步骤(a)反应之前进行反转录反应。
8.权利要求3的方法，其中所述来自个体的核酸是人类基因组核酸；所述来自致病性微生物的核酸是RNA；且在扩增之前，进行反转录反应。
9.权利要求6的方法，其中所述核酸提取物是通过人类基因组提取试剂盒获得。
10.权利要求9的方法，其中所述人类基因组试剂盒是QiAampDNA Blood Midi试剂盒。
11.权利要求1的方法，其中所述特定疾病是肝炎，所述致病性微生物是肝炎病毒。
12.权利要求3的方法，其中所述特定疾病是肝炎，所述致病性微生物是肝炎病毒。
13.权利要求11的方法，其中所述第一种探针检测丙型肝炎病毒的基因型，第二种探针检测MxA启动子区域的SNP。
14.权利要求11的方法，其中所述第一种探针检测丙型肝炎病毒的基因型，第二种探针检测MBL基因的多形性。
15.权利要求11的方法，其中所述第一种探针包含至少一种类型的选自如下的碱基序列(a)选自由SEQ ID NO1，2，3和5所示的碱基序列之碱基序列；(b)选自由SEQ ID NO5，6和7所示的碱基序列之碱基序列；(c)选自(a)和(b)的碱基序列的互补序列，且所述第二种探针包含至少一种类型的选自如下的碱基序列(at455)，如所附序列表中SEQ ID NO16所示的碱基序列；(bt455)，一种通过修饰(at455)所示的序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位的碱基的数个碱基或向其添加至少一个碱基；(ct455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dt455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(et455)，一种选自(at455)-(dt455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag455)，一种由序列表中SEQ ID NO17所示的碱基序列；(bg455)，一种通过修饰(ag455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(eg455)，一种选自(ag455)-(dg455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa455)，一种由序列表中SEQ ID NO18所示的碱基序列；(ba455)，一种通过修饰(aa455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(da455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(ea455)，一种选自(aa455)-(da455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ac455)，一种由序列表中SEQ ID NO19所示的碱基序列；(bc455)，一种通过修饰(ac455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(ec455)，一种选自(ac455)-(dc455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa420)，一种由所附序列表中SEQ ID NO37所示的碱基序列；(ba420)，一种通过修饰(aa420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca420)，一种含有SEQ 1D NO37所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(da420)，一种选自(aa420)-(ca420)的碱基序列的碱基序列之互补序列。(ac420)，一种由序列表中SEQ ID NO38所示的碱基序列；(bc420)，一种通过修饰(ac420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc420)，一种含有SEQ ID NO38所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dc420)，一种选自(ac420)-(cc420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at420)，一种由序列表中SEQ ID NO39所示的碱基序列；(bt420)，一种通过修饰(at420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct420)，一种含有SEQ ID NO39所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dt420)，一种选自(at420)-(ct420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag420)，一种由后面所附序列表中SEQ ID NO40所示的碱基序列；(bg420)，一种通过修饰(ag420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg420)，一种含有SEQ ID NO40所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dg420)，一种选自(ag420)-(cg420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO41所示的碱基序列；(bg221)，一种通过修饰(ag221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(eg221)，一种选自(ag221)-(dg221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO42所示的碱基序列；(bc221)，一种通过修饰(ac221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc221)，一种含有SEQ ID NO42所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dc221)一种含有SEQ ID NO42所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ec221)，一种选自(ac221)-(dc221)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO43所示的碱基序列；(ba221)，一种通过修饰(aa221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(da221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ea221)，一种选自(aa221)-(da221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO44所示的碱基序列；(bt221)，一种通过修饰(at221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dt221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(et221)，一种选自(at221)-(dt221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg54)，一种通过修饰(ag54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(eg54)，一种选自(ag54)-(dg54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba54)，一种通过修饰(aa54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(da54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的869位-8800位碱基的碱基序列；(ea54)，一种选自(aa54)-(da54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc54)，一种通过修饰(ac54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(ec54)，一种选自(ac54)-(dc54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt54)，一种通过修饰(at54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dt54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(et54)，一种选自(at54)-(dt54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg52-57)，一种通过修饰(ag52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg52-57)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dg52-57)，一种选自(ag52-57)-(cg52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba52-57)，一种通过修饰(aa52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca52-57)一种含有SEQ ID NO46所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(da52-57)一种选自(aa52-57)-(ca52-57)的碱基序列之碱基序列的互补序列；(ac52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc52-57)，一种通过修饰(ac52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc52-57)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dc52-57)，一种选自(ac52-57)-(cc52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt52-57)，一种通过修饰(at52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct52-57)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dt52-57)，一种选自(at52-57)-(ct52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列。
16.权利要求12的方法，其中所述第一种探针包含至少一种类型的选自如下的碱基序列(a)选自由SEQ ID NO1，2，3和5所示的碱基序列之碱基序列；(b)选自由SEQ ID NO5，6和7所示的碱基序列之碱基序列；(c)选自(a)和(b)的碱基序列的互补序列，且所述第二种探针包含至少一种类型的选自如下的碱基序列(at455)，如所附序列表中SEQ ID NO16所示的碱基序列；(bt455)，一种通过修饰(at455)所示的序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位的碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dt455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(et455)，一种选自(at455)-(dt455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag455)，一种由序列表中SEQ ID NO17所示的碱基序列；(bg455)，一种通过修饰(ag455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(eg455)，一种选自(ag455)-(dg455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa455)，一种由序列表中SEQ ID NO18所示的碱基序列；(ba455)，一种通过修饰(aa455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(da455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的449位-459位碱基的序列；(ea455)，一种选自(aa455)-(da455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac455)，一种由序列表中SEQ ID NO19所示的碱基序列；(bc455)，一种通过修饰(ac455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc455)一种含有SEQ ID NO19所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(ec455)，一种选自(ac455)-(dc455)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa420)，一种由所附序列表中SEQ ID NO37所示的碱基序列；(ba420)，一种通过修饰(aa420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换的除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca420)，一种含有SEQ ID NO37所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(da420)，一种选自(aa420)-(ca420)的碱基序列的碱基序列之互补序列。(ac420)，一种序列表中SEQ ID NO38所示的碱基序列；(bc420)，一种通过修饰(ac420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc420)，一种含有SEQ ID NO38所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dc420)，一种选自(ac420)-(cc420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at420)，一种由后面所附序列表中SEQ ID NO39所示的碱基序列；(bt420)，一种通过修饰(at420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct420)，一种含有SEQ ID NO39所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dt420)，一种选自(at420)-(ct420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag420)，一种由后面所附序列表中SEQ ID NO40所示的碱基序列；(bg420)，一种通过修饰(ag420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg420)，一种含有SEQ ID NO40所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dg420)，一种选自(ag420)-(cg420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO41所示的碱基序列；(bg221)，一种通过修饰(ag221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(eg221)，一种选自(ag221)-(dg221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO42所示的碱基序列；(bc221)，一种通过修饰(ac221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc221)，一种含有SEQ ID NO42所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dc221)，一种含有SEQ ID NO42所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ec221)，一种选自(ac221)-(dc221)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO43所示的碱基序列；(ba221)，一种通过修饰(aa221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(da221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ea221)，一种选自(aa221)-(da221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO44所示的碱基序列；(bt221)，一种通过修饰(at221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dt221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(et221)，一种选自(at221)-(dt221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg54)，一种通过修饰(ag54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(eg54)，一种选自(ag54)-(dg54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba54)，一种通过修饰(aa54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(da54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(ea54)，一种选自(aa54)-(da54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc54)，一种通过修饰(ac54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(ec54)，一种选自(ac54)-(dc54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt54)，一种通过修饰(at54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dt54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(et54)，一种选自(at54)-(dt54)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ag52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg52-57)，一种通过修饰(ag52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg52-57)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dg52-57)，一种选自(ag52-57)-(cg52-57)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(aa52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba52-57)，一种通过修饰(aa52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca52-57)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(da52-57)，一种选自(aa52-57)-(ca52-57)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ac52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc52-57)，一种通过修饰(ac52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc52-57)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dc52-57)，一种选自(ac52-57)-(cc52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt52-57)，一种通过修饰(at52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct52-57)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dt52-57)，一种选自(at52-57)-(ct52-57)的碱基序列的碱基序列的互补序列。
17.权利要求12的方法，其中所述扩增是通过PCR进行的，其中利用了由选自SEQ ID NO8和9所示序列的至少一种碱基序列所示的有义链，以及由选自SEQ ID NO10，11，12，13和14所示的至少一种碱基序列所示的反义链。
18.一种固定了探针的基底，其包括基底；固定于基底上的第一种探针，其用于检测致病性微生物的特异性核酸的存在与否，其中所述微生物与特定疾病相关；以及固定于基底上的、且具有与第一种探针不同的碱基序列的第二种探针，其用于检测个体的特异性核酸的存在与否，其中所述个体的核酸与治疗该疾病的应答相关。
19.权利要求18的固定了探针的基底，其中所述致病性微生物是丙型肝炎病毒，药剂是IFN。
20.权利要求18的固定了探针的基底，其中所述个体核酸是MxA启动子区域。
21.权利要求18的固定了探针的基底，其中所述个体核酸是编码MBL的基因。
22.权利要求18的固定了探针的基底，其中所述第一种探针检测丙型肝炎病毒的基因型。
23.一种固定了探针的基底，其包括基底；包含至少一种选自如下序列的第一种探针(a)选自由SEQ ID NO1，2，3和5所示的碱基序列之碱基序列；(b)选自由SEQ ID NO5，6和7所示的碱基序列之碱基序列；(c)选自(a)和(b)的碱基序列的互补序列，且固定于基底上且包含至少一种类型的选自如下的序列的第二种探针(at455)，如所附序列表中SEQ ID NO16所示的碱基序列；(bt455)，一种通过修饰(at455)所示的序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其添加至少一个碱基；(ct455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dt455)，一种含有SEQ ID NO16所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(et455)，一种选自(at455)-(dt455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag455)，一种由序列表中SEQ ID NO17所示的碱基序列；(bg455)，一种通过修饰(ag455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dg455)，一种含有SEQ ID NO17所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(eg455)，一种选自(ag455)-(dg455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa455)，一种由序列表中SEQ ID NO18所示的碱基序列；(ba455)，一种通过修饰(aa455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(da455)，一种含有SEQ ID NO18所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(ea455)，一种选自(aa455)-(da455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac455)，一种由序列表中SEQ ID NO19所示的碱基序列；(bc455)，一种通过修饰(ac455)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了455位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的441位-455位碱基的碱基序列；(dc455)，一种含有SEQ ID NO19所示序列的449位-459位碱基的碱基序列；(ec455)，一种选自(ac455)-(dc455)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa420)，一种由所附序列表中SEQ ID NO37所示的碱基序列；(ba420)，一种通过修饰(aa420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换的除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca420)，一种含有SEQ ID NO37所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(da420)，一种选自(aa420)-(ca420)的碱基序列的碱基序列之互补序列。(ac420)，一种序列表中SEQ ID NO38所示的碱基序列；(bc420)，一种通过修饰(ac420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc420)，一种含有SEQ ID NO38所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dc420)，一种选自(ac420)-(cc420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at420)，一种由序列表中SEQ ID NO39所示的碱基序列；(bt420)，一种通过修饰(at420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct420)，一种含有SEQ ID NO39所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dt420)，一种选自(at420)-(ct420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag420)，一种由后面所附序列表中SEQ ID NO40所示的碱基序列；(bg420)，一种通过修饰(ag420)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了420位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg420)，一种含有SEQ ID NO40所示序列的415位-425位碱基的碱基序列；(dg420)，一种选自(ag420)-(cg420)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO41所示的碱基序列；(bg221)，一种通过修饰(ag221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dg221)，一种含有SEQ ID NO41所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(eg221)，一种选自(ag221)-(dg221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO42所示的碱基序列；(bc221)，一种通过修饰(ac221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc221)，一种含有SEQ ID NO42所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dc221)，一种含有SEQ ID NO42所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ec221)，一种选自(ac221)-(dc221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO43所示的碱基序列；(ba221)，一种通过修饰(aa221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(da221)，一种含有SEQ ID NO43所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(ea221)，一种选自(aa221)-(da221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at221)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO44所示的碱基序列；(bt221)，一种通过修饰(at221)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了425位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的418位-432位碱基的碱基序列；(dt221)，一种含有SEQ ID NO44所示序列的421位-430位碱基的碱基序列；(et221)，一种选自(at221)-(dt221)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg54)，一种通过修饰(ag54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dg54)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(eg54)，一种选自(ag54)-(dg54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba54)，一种通过修饰(aa54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(da54)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(ea54)，一种选自(aa54)-(da54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ac54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc54)，一种通过修饰(ac54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dc54)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(ec54)，一种选自(ac54)-(dc54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at54)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt54)，一种通过修饰(ag54)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的874位-876位碱基的碱基序列；(dt54)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的869位-880位碱基的碱基序列；(et54)，一种选自(at54)-(dt54)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(ag52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO45所示的碱基序列；(bg52-57)，一种通过修饰(ag52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cg52-57)，一种含有SEQ ID NO45所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dg52-57)，一种选自(ag52-57)-(cg52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(aa52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO46所示的碱基序列；(ba52-57)，一种通过修饰(aa52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ca52-57)，一种含有SEQ ID NO46所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(da52-57)，一种选自(aa52-57)-(ca52-57)的碱基序列的碱基序列的互补序列；(ac52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO47所示的碱基序列；(bc52-57)，一种通过修饰(ac52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(cc52-57)，一种含有SEQ ID NO47所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dc52-57)，一种选自(ac52-57)-(cc52-57)的碱基序列的碱基序列之互补序列；(at52-57)，一种由文本后面所附序列表中SEQ ID NO48所示的碱基序列；(bt52-57)，一种通过修饰(at52-57)所示序列获得的修饰的碱基序列，方法是删去或替换除了875位碱基的数个碱基或向其上添加至少一个碱基；(ct52-57)，一种含有SEQ ID NO48所示序列的868位-885位碱基的碱基序列；(dt52-57)，一种选自(at52-57)-(ct52-57)的碱基序列的碱基序列的互补序列。
24.权利要求18的固定了探针的基底，其中特异性核酸的存在之检测是电化学方法进行的。
25.权利要求23的固定了探针的基底，其中特异性核酸的存在之检测是电化学方法进行的。
26.一种用于确定个体对疾病治疗的应答的方法，其中疾病与个体中致病性微生物的存在相关，该方法包括步骤(a)将该个体的核酸提取物与第一种核酸探针和第二种核酸探针反应，所述第一种核酸探针可与致病性微生物的核酸杂交，其中致病性微生物与所述疾病相关，所述第二种核酸探针可与该个体的靶核酸杂交，其中该个体的靶核酸与个体对疾病治疗的应答相关；且(b)检测与第一种核酸探针结合的所述致病性微生物的核酸，以及检测与第二种核酸探针结合的个体靶核酸，其中与第一种核酸探针结合的致病性微生物的核酸以及与第二种核酸探针结合的个体靶核酸之存在均与对该疾病治疗的应答相关联。
27.权利要求26的方法，其中探针被固定于基底上。
28.权利要求26的方法，其还包括在步骤(a)反应之前扩增该个体的核酸的步骤。
29.一种确定个体对疾病的易感性的方法，包括如下步骤(a)将该个体的核酸提取物与第一种核酸探针和第二种核酸探针反应，所述第一种核酸探针可与致病性微生物的核酸杂交，其中致病性微生物与疾病相关，所述第二种核酸探针可与该个体的靶核酸杂交，其中该个体的靶核酸与对疾病的易感性相关；且(b)检测与第一种核酸探针结合的所述致病性微生物的核酸，以及检测与第二种核酸探针结合的个体核酸，其中与第一种核酸探针结合的致病性微生物的核酸以及与第二种核酸探针结合的个体核酸之存在均与对该个体对疾病的易感性相关联。
30.权利要求29的方法，其中探针被固定于基底上。
31.权利要求29的方法，其还包括在步骤(a)反应之前扩增该个体的核酸的步骤。
32.一种制备固定了探针的基底的方法，所述基底包含检测与疾病相关的致病性微生物的特异性核酸之存在的第一种探针，和检测与对疾病治疗的应答相关的个体之特异性核酸之存在的第二种探针，该方法包括，将第一种探针和第二种探针固定于基底上的步骤。
33.权利要求32的方法，其中所述基底选自基板、多孔材料、微滴定板、珠、球状材料、颗粒材料、磁性材料或磁性珠。
全文摘要
本发明提供了用于获得关于来自个体的核酸信息以及与个体疾病相关的核酸信息的方法，特别是当疾病与存在于个体中的致病性微生物相关时。本发明还提供了用于该方法的一种固定了探针的基底，诸如固定了探针的芯片。特别是，本发明提供了用于获得关于个体对疾病治疗的应答之信息的方法和固定了探针的基底。
文档编号G01N33/53GK1455819SQ02800001
公开日2003年11月12日 申请日期2002年3月5日 优先权日2001年3月27日
发明者桥本幸二, 桥本美智惠, 三代俊治, 太田裕彦 申请人:株式会社东芝
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