专利名称：G蛋白偶联受体测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过抑制G蛋白信号调节剂(RGS)蛋白来诊断、治疗和预后G蛋白偶联受体(GPCR)相关疾病的新方法。本发明还涉及筛选和评价试验化合物干预和预防GPCR相关疾病的功效的方法以及能够抑制GPCR相关疾病的组合物。
背景技术：
许多激素、神经递质和感觉刺激在靶组织中通过激活与异源三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体而诱发特异性生理反应(参见例如Bourne等，Nature(1990)348125-132；Hepler等，Trends Biochem.Sci.(1992)17383-387)。活化受体促进Gα亚基上GTP交换成GDP，导致活性GTP结合型Gα与Gβγ二聚体解离，它们两者均为激活一系列下游信号事件的信号转导蛋白。各种信号在GTP被Gα水解后终止，随后Gβγ复合物与无活性的GDP结合型Gα再缔合。因此，G蛋白信号的持续时间取决于GTP水解的速率和Gβγ再缔合的速率。
Gα的内在GTP水解速率太慢(约1-5分钟-1)，以致不能解释某些受G蛋白控制的过程快得多的失活速率，所述过程例如光转导(Arshavsky等，Neuron(1998)2011-14)和离子通道激活(参见Kurachi，Am.J.Physiol.(1995)269C821-C830)。根据对大量RGS蛋白家族的最新发现来计算误差(参见Zerangue等，Cur.Biol.(1998)8313-316；Berman等，J.Biol.Chem.(1998)2731269-1272；Hepler，TrendsBiochem.Sci.(1999)17383-387)。RGS蛋白部分起缩短活性GTP结合型Gα半寿期的作用，因而弱化由Gα-GTP和游离Gβγ产生的反应(Zhong和Neubig J.Pharma.Exp.Thera.(2001)297837-845)。RGS蛋白的GAP活性是由约120个氨基酸的保守RGS核心结构域所赋予的。RGS和Gα复合物的晶体结构说明了RGS核心与Gα的柔性转换区结合，从而通过稳定所述过渡态来促进GTP的水解(Tesmer等，Cell(1997)89251-261)。
体外生物化学研究表明，RGS蛋白对Gαq和Gαi类蛋白表现出不同的GAP活性(De Vries和Farquar，Trends Cell Biol.(1999)9138-143)。例如，RGS2仅结合Gαq并且抑制磷脂酶C的Gαq指导的激活(Heximer等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9414389-14393)。另一方面，RGS4既结合Gαi又结合Gαq并且加速Gαi的水解，并且另外还抑制磷脂酶C的Gαq指导的激活(Hepler等，(1997)，参见上文)。尽管RGS2和RGS4均为Gαq GAP，但是它们在其活性方面与RGS2在数量上不同，RGS2在阻断磷脂酶C的Gαq指导的激活中更加有效。RGSz1结合Gαz即Gαi家族的一个成员，并且在加速GTP水解方面比Gαi家族的其它成员对Gαz的选择性至少高100倍(Wang等，J.Biol.Chem.(1997)27326014-26025；Glick等，J.Biol.Chem.(1997)27326008-26013)，尽管在RGS蛋白的体外Gα选择性和G蛋白信号在某些细胞系统中的体内选择性弱化之间存在相关性(Huang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)946159-6163；Dunpnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410461-10466；Bowman等，J.Biol.Chem.(1998)27328040-28048；Heximer等，J.Biol.Chem.(1999)27434253-34259)，但是在其它方面的差异是显而易见的。例如，在转染的COS细胞中，RGS2既抑制Gαq偶联的MAPK激活，又抑制Gαi偶联的MAPK激活(Ingi等，J.Neurosci.(1998)187178-7188)。此外，RGS2比RGS4更有效地抑制Gi偶联的黑素细胞色素分散(Potenza等，J.Pharm.Exp.Thera.(1999)291482-491)。
SRE(血清效应元件)是一种存在于许多生长因子调节的启动子中的调节序列(Treisman，Semin.Cancer Biol.(1990)147-58)。SRE结合遍在转录因子SRF(血清反应因子)，SRF是SRE活性所必需的(Norman等，Cell(1988)55989-1003)。在c-fos SRE上，SRF与TCF(三元复合物因子)形成三元复合物，所述三元复合物由一个小的转录因子家族的成员(包括Elk1)组成(Shaw等，Cell(1989)56563-572)。TCF结合连接SRF结合部位的识别基序并且调节对Ras-Raf-Erk途径激活反应的SRE活性(Treisman，Curr.Opin.Genet.Dev.(1990)496-101；Kortenjann等，Mol.Cell Biol.(1994)14481 5-4824)。c-fos SRE激活由SRF联途径和TCF联途径协同诱导或独立诱导(Hill等，Cell(1995)811159-1170)。在培养细胞中，组成型活性Gαq或Gα12/13的表达诱导SRE-报道基因的激活，而所述激活通过SRF联途径介导(Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)。Gβγ二聚体在细胞中的表达也激活SRE-报道基因，并且据认为Gβγ诱导的激活通过TCF联途径而介导。
因此，G蛋白信号(RGS)蛋白的调节剂起GTP酶激活蛋白(GAP)的作用，以抑制由Gα-GTP和Gβγ两者起始的G蛋白偶联受体信号。尽管某些RGS蛋白对于体外GαGAP是选择性的，但是它们的体内选择性仍不清楚。因此，本领域需要根据体内信号提供诊断、预后和治疗的新方法和新组合物。本发明提供了这样的方法和组合物。本发明也提供了新药筛选方法和药效方法。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法，即在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触，其中所述试验细胞包含GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达。所述方法继续往下进行，即检测所述报道基因在接触试验化合物的试验细胞中的表达，然后将所述报道基因在接触所述试验化合物的试验细胞中的表达与在不存在所述试验化合物的情况下所述报道基因在接触所述激动剂的试验细胞中的表达进行比较，其中相对于在不存在所述试验化合物的情况下所述报道基因在接触所述激动剂的试验细胞中的表达，所述报道基因在接触所述试验化合物和激动剂的试验细胞中的表达水平显著增加，说明所述试验化合物有效抑制所述患者的GCPR相关疾病。
在一个优选的实施方案中，所述GPCR相关疾病是神经精神病或心血管疾病。在另一个优选的实施方案中，所述GPCR是D2受体、M2受体、5HTIA受体、Edg1受体或缓激肽受体。在另一个优选的实施方案中，所述RGS蛋白是GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。在又一个优选的实施方案中，所述报道基因是SRE-萤光素酶、SRE-LacZ、SRE-CAT或CRE-萤光素酶。在再一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。在再一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。更优选所述嵌合蛋白是一种在Gαq和Gαi1之间的嵌合蛋白。在另一个优选的实施方案中，所述试验细胞表达所述Ras-Raf-MEK途径的野生型信号分子。更优选所述Ras-Raf-MEK途径的信号分子是Ras、Raf、MEK、Erk1/2、Elk1、JNK和p38。在另一个优选的实施方案中，所述试验细胞表达野生型Rho家族分子。更优选所述Rho家族成员是RhoA、Rac1和Cdc42。在另一个优选的实施方案中，将所述Gα蛋白瞬时转染到所述试验细胞中。在再一个优选的实施方案中，将所述报道基因瞬时转染到所述试验细胞中。在再一个优选的实施方案中，将所述GPCR稳定地转染到所述试验细胞中。
在另一个实施方案中，本发明提供一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法，即将RGS蛋白在Gα存在下在第一种细胞样品中的表达与RGS蛋白在Gα存在下在第二种细胞样品中的表达进行比较，其中使所述第一种细胞样品接触所述试验化合物，而使所述第二种细胞样品不接触所述试验化合物，其中相对于所述第二种样品，所述RGS蛋白在所述第一种样品中的表达水平显著降低，说明所述试验化合物有效抑制所述患者的所述GPCR相关疾病。优选所述GPCR相关疾病是神经精神病或心血管疾病。在另一个优选的实施方案中，所述RGS蛋白是GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin或mCONDUCTIN。在另一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种高通量筛选能够抑制RGS蛋白的试验化合物的方法，即在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触，其中所述试验细胞包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达。所述方法也包括下述步骤检测所述报道基因在接触试验化合物相对于接触其它试验化合物的试验细胞中的表达，然后找出所述报道基因表达水平的量与所述试验化合物抑制RGS蛋白的能力之间的联系，其中所述报道基因的表达增加说明所述试验化合物能够抑制所述RGS蛋白。在一个优选的实施方案中，所述GPCR是D2受体、M2受体、5HTIA受体、Edg1受体或缓激肽受体。在另一个优选的实施方案中，所述RGS蛋白是GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin或mCONDUCTIN。在另一个优选的实施方案中，所述报道基因是SRE-萤光素酶、SRE-LacZ、SRE-CAT或CRE-萤光素酶。在另一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gα蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。在另一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。在另一个优选的实施方案中，所述试验细胞包括所述Ras-Raf-MEK途径的野生型信号分子。更优选所述Ras-Raf-MEK途径的信号分子包括Ras、Raf、MEK、Erk1/2Elk1、JNK和p38。在另一个优选的实施方案中，所述试验细胞包括所述野生型Rho家族分子。更优选所述Rho家族分子包括RhoA、Rac1和Cdc42。在另一个优选的实施方案中，所述试验化合物是生物活性剂，例如天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸或多核苷酸。另一方面，所述试验化合物是小分子。
在另一个实施方案中，本发明提供一种高通量筛选能够抑制患者的GPCR相关疾病的试验化合物的方法，即将RGS蛋白、Gα和试验化合物混合；检测RGS蛋白和Gα在试验化合物存在下的结合；然后找出RGS和Gα之间的结合被抑制的量与所述试验化合物抑制所述GPCR相关疾病的能力之间的联系，其中RGS蛋白和Gα的结合被抑制说明所述试验化合物能够抑制所述GPCR相关疾病。在一个优选的实施方案中，所述试验化合物是小分子。另一方面，所述试验化合物是生物活性剂，例如天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸或多核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法，即获得来自患者的包含细胞的样品；使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；检测RGS蛋白和Gα在每种所述等份样品中的表达水平；然后选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的表达。在一个优选的实施方案中，所述Gα是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法，即获得来自患者的包含细胞的样品；使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；检测RGS蛋白在每种所述等份样品中的活性；然后选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的表达。在一个优选的实施方案中，所述Gα是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种筛选能够干扰RGS蛋白和Gα的结合的试验化合物的方法，即将RGS蛋白、试验化合物和Gα混合；测定所述RGS蛋白和所述Gα的结合；然后找出所述试验化合物与干扰结合的能力之间的联系，其中与在不存在所述试验化合物的情况下相比，在所述试验化合物存在下，所述RGS蛋白和所述Gα的结合减少说明所述试验化合物能够抑制结合。在一个优选的实施方案中，所述试验化合物是一种小分子。更优选所述试验化合物是生物活性剂，例如天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸或多核苷酸。另一方面，所述试验化合物是一种蛋白质。在另一个实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。另一方面，所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种确定患者的GPCR相关疾病的严重程度的方法，即将RGS蛋白在来自所述患者的样品中的表达水平与RGS蛋白在对照样品中的正常表达水平进行比较，其中相对于正常水平，RGS蛋白在来自所述患者的样品中的异常表达水平，说明所述患者患有严重GPCR相关疾病。在一个优选的实施方案中，使用特异性结合所述RGS蛋白的抗体或其片段，检测所述RGS蛋白的存在。在另一个优选的实施方案中，从实质上没有所述GPCR相关疾病的组织中收集对照样品，并且异常表达水平是降低至少约二分之一。
在另一个实施方案中，本发明提供一种评价用于抑制患者的GPCR相关疾病的疗法的功效的方法，即将RGS蛋白在第一种样品中的表达与RGS蛋白在第二种样品中的表达进行比较，其中所述第一种样品从在给所述患者提供所述疗法的至少一部分之前的所述患者中获得，而所述第二种样品在提供所述疗法的所述部分之后获得，其中相对于所述第一种样品，所述RGS蛋白在所述第二种样品中的表达水平显著受到调节，说明所述疗法有效抑制所述患者的所述GPCR相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断GPCR相关疾病的方法，即获得来自患者的包含细胞的样品；测量RGS和Gα在所述样品中的表达，找出RGS和Gα的量与存在GPCR相关疾病之间的联系，其中与对照样品相比，RGS和Gα的水平显著增加说明存在GPCR相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，即给予一种包括以下组分的组合物一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂、一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂和药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为小分子。在一个更优选的实施方案中，所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为多肽。在另一个优选的实施方案中，所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，即给予一种包括以下组分的组合物一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸、一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸与诸如以下的RGS多核苷酸互补GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin或mCONDUCTIN。在另一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。更优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，即给予一种包括以下组分的组合物一种能够结合RGS多核苷酸的核酶、一种能够结合Gα多核苷酸的核酶和药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，对于美国专利第6,069,296号或美国专利第5,929,207号中公开的RGS蛋白，所述RGS多核苷酸编码GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin、mCONDUCTIN的多核苷酸或多核苷酸序列，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中。在另一个优选的实施方案中，所述Gα多核苷酸是Gαi和Gαq的多核苷酸。更优选所述Gαi多核苷酸是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种增强GPCR信号的方法，即给患者的细胞提供一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸与以下的多核苷酸互补GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin或mCONDUCTIN的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种抑制GPCR信号的方法，所述方法包括给患者的细胞提供一种与Gα互补的反义寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述Gα蛋白是Gαi或Gαq。优选所述Gαi蛋白是Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz或Gαo。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够抑制患者的GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂、一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸和一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种能够结合RGS多核苷酸的核酶、一种能够结合Gα多核苷酸的核酶和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种基因工程试验细胞，所述试验细胞包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，其中与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达，其中将所述组分的至少一种导入所述细胞中。在一个优选的实施方案中，所述试验细胞是一种哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中，所述GPCR是多巴胺受体(D2或D2R)。在另一个优选的实施方案中，所述RGS蛋白是RGS2蛋白、RGS4蛋白或RGSz蛋白。在另一个优选的实施方案中，所述相应的Gα蛋白是Gαi蛋白。在另一个优选的实施方案中，所述相应的Gα蛋白是Gαq/i嵌合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一种多核苷酸探针和第二种多核苷酸探针，其中所述第一种多核苷酸探针与可转录RGS多核苷酸特异性结合，而所述第二种多核苷酸探针与可转录Gα多核苷酸特异性结合。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一种抗体和第二种抗体，其中所述第一种抗体与RGS多肽特异性结合，而所述第二种抗体与相应的Gα多肽特异性结合。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于评价多种化合物中每种化合物抑制患者的GPCR相关疾病的的适应性的试剂盒，其中所述试剂盒包括多种试验细胞，其中每种试验细胞都包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，其中与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达。所述试剂盒还包括一种GPCR激动剂。
附图简述
图1证明喹吡罗(QUIN)刺激c-fos SRE激活。喹吡罗刺激所述c-fos SRE激活并且所述活性为百日咳毒素(PTX)和βARKct所消除。用pSRE-Luc(1μg)和pβGal(10ng)报道构建体在βARKct存在下或者对照质粒(4μg)瞬时转染CHO-D2R细胞。此后，在存在或不存在10ng/mlPTX的情况下，将细胞血清饥饿过夜，然后用10μM喹吡罗处理5小时。测量萤光素酶活性(反映出SRE激活)并用β-Gal活性归一化。所显示的数字表示以三个复份进行的至少两个独立实验。
图2显示RGS蛋白对喹吡罗刺激的SRE激活的影响。用pSRE-Luc(2μg)、pβGal(10ng)、指定的RGS蛋白或载体(2μg)和额外的载体质粒至在每次转染中使用的总共5μg DNA，瞬时转染CHO-D2R细胞。在血清饥饿过夜后，细胞用0nM、10nM、100nM、1μM、10μM和100μM的喹吡罗处理5小时，然后测量萤光素酶和β-Gal的活性。所显示的数字表示每个实验以三个复份进行的至少两个独立实验。标准误在对应值的5％的范围内。
图3A和图3B显示增强抑制RGS蛋白的Gα蛋白对喹吡罗刺激的SRE激活的表达。
图3A在存在或不存在Gαi1共转染的情况下，RGS4活性的比较。用pSRE-Luc(2μg)、pβGal(10ng)、RGS4(2μg)和Gαi1或载体(1μg)瞬时转染CHO-D2R细胞。然后将细胞血清饥饿过夜，用100nM喹吡罗处理5小时，此后，测量萤光素酶和β-Gal的活性。
图3BGαi1对RGS蛋白活性的差别增强。用pSRE-Luc(2μg)、pβbGal(10ng)、Gαi1(1μg)和指定的RGS蛋白或载体(2μg)瞬时转染CHO-D2R细胞。然后将细胞血清饥饿过夜，用0nM、10nM、100nM、1μM、10μM和100μM的喹吡罗处理5小时，然后测量萤光素酶和β-Gal的活性。
图3CGαq/i嵌合体既增强RGS2的活性，又增强RGS4的活性。以与图3B相同的方式进行实验，只是使用Gαq/i嵌合体来代替Gαi1，并且使喹吡罗的浓度降低一个数量级。所显示的数字表示至少两个独立实验，每个实验有三个复份转染。标准误在对应值的2％的范围内。
图4显示PD098059抑制喹吡罗刺激的Erk1/2激活和SRE激活。用pSRE-Luc(1μg)和pβGal(10ng)报道基因和对照质粒至每次转染所用的5μg总DNA，瞬时转染CHO-D2R细胞。在血清饥饿过夜后，细胞用25nM PD098059或溶媒处理30分钟，然后加入100nM喹吡罗。在与喹吡罗一起孵育5分钟后，裂解细胞，裂解物用抗磷酸-Erk1/2抗体通过蛋白质印迹进行分析。剥离该印迹，再次用抗Erk1/2抗体探测，以显示总蛋白负荷。在与喹吡罗一起孵育5小时后，测量萤光素酶和β-Gal的活性。所显示的数字表示至少两个独立实验，每个实验有三个复份转染。
图5证明RhoA、Rac1和Cdc42的显性失活突变体抑制喹吡罗刺激的SRE激活。用pSRE-Luc(2μg)、pβGal(10ng)、RhoN19或RacN17或Cdc42N17或载体(3μg)瞬时转染CHO-D2R细胞。在血清饥饿过夜后，细胞用100nM喹吡罗处理5小时，然后测量萤光素酶和β-Gal的活性。所显示的数字表示至少两个独立实验，每个实验有三个复份转染。
图6显示渥曼青霉素对喹吡罗刺激的SRE激活没有影响。以与图4描述的相同方式进行实验，只是使用50nM渥曼青霉素来代替PD098059，并且蛋白质印迹用抗磷酸-Akt或抗磷酸-Erk1/2抗体探测，剥离印迹，然后再次用抗Akt或抗Erk1/2抗体探测，以显示总蛋白负荷。
发明详述本发明提供用于筛选、治疗和诊断GPCR相关疾病的新方法。本发明也提供用于治疗和抑制GPCR相关疾病的新组合物。
定义和术语为了便于理解本发明，许多术语和用语如下定义。
本文所用的术语“GPCR信号分子”包括这样的多核苷酸分子或多肽分子在用GPCR激动剂处理的含有GPCR的细胞中与在不用激动剂处理的含有GPCR的细胞相比中的含量或活性被增加或减少的多核苷酸分子或多肽分子，或者本领域已知将直接或间接来自GPCR的信号转导至一种或多种细胞蛋白或分子的多核苷酸分子或多肽分子。在某些实施方案中，本发明的GPCR信号分子包括但不限于Ras、Raf、MEK、Erk1/2、JNK、p38和Elk1以及它们的同系物或同种型，特别是人同系物或人同种型。在某些实施方案中，GPCR信号分子包含GPCR信号途径。
本文所用的术语“RGS”或“RGS蛋白”包括现在已知的、或者以后描述的、能够抑制或结合GαI类蛋白或Gαq类蛋白的G蛋白信号调节剂。这样的RGS蛋白包括但不限于GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN以及任何现在已知的或者以后描述的同种型或同系物。例如，RGS9的几个同种型是已知的，并且描述于Cowan等，(2001)Prog.Nuc.Acids Res.65341-359，所述文献通过引用结合到本文中。另外，本文所用的术语“RGS”包括现在已知的或者以后描述的含有RGS核心结构域的蛋白(参见例如Dohlman等，(1997)J.Biol.Chem.2723871-3874；Berman等，(1998)J.Biol.Chem.2731269-1272；Zheng等，(1999)Trends Biol.Sci.24411-414；DeVries等，(2000)Ann.Rev.Pharm.Toxicol.40235-271)。一般而言，RGS蛋白含有一个RGS核心结构域(例如描述于Berman等，(1998)J.Biol.Chem.2731269-72)，然而，在某些实施方案中，RGS多肽或编码RGS多肽的多核苷酸可以含有一个或多个突变、缺失或插入的片段。在这样的实施方案中，所述RGS蛋白核心结构域与野生型核心结构域有至少60％同源性、优选75％同源性、更优选85％或更高同源性。
本文所用的术语本发明的“Gα”或“Gα蛋白”包括现在已知的或者以后描述的Gαi类或Gαq类的所有成员，包括但不限于Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz、Gαo和Gαq。在某些实施方案中，本发明的Gα蛋白可以含有一个或多个突变、缺失或插入的片段。在这样的实施方案中，所述Gα蛋白与野生型Gα蛋白有至少60％同源性、优选75％同源性、更优选85％或更高同源性。
本文所用的术语“相应的Gα蛋白”是指能够接触所用的细胞、筛选测定或系统中的RGS蛋白的Gα蛋白。相应的Gα蛋白也与所用的细胞、筛选测定或系统中的GPCR偶联，使得所述Gα蛋白能够接触所述GPCR或者能够转导对结合所述GPCR的激动剂应答的信号。在某些实施方案中，所述相应的Gα蛋白能够接触表1所示的非限制性实例中叙述的特异性RGS。
表1
在本发明的一个具体实施方案中，所述相应的Gα蛋白是能够接触RGS2蛋白的Gαq蛋白。在本发明的另一个具体实施方案中，所述相应的Gα蛋白是能够接触RGS4蛋白的Gαi蛋白。在本发明的另一个具体实施方案中，所述相应的Gα蛋白是能够接触RGS4蛋白的Gαq蛋白。在本发明的再一具体实施方案中，所述相应的Gα蛋白是能够接触RGSz蛋白的Gαz蛋白。
本文所用的术语“GPCR相关疾病”包括任何与异常GPCR信号相关的疾病或障碍，所述疾病或障碍包括但不限于神经精神病例如精神分裂症、双相性精神障碍和抑郁症；肺心病例如心肌肥大、高血压、血栓形成和心律失常；炎症、胰囊性纤维化和视觉障碍。虽然不受机制的限制，但是GPCR相关疾病一般与GPCR信号减弱相关。
本文所用的术语“GPCR激动剂”包括结合GPCR并诱发应答的任何分子或因子。本文所用的术语“GPCR拮抗剂”包括结合GPCR但不诱发应答的任何分子或因子。
本文所用的术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，包括任何长度的核苷酸的聚合形式，或者为脱氧核糖核苷酸或者为核糖核苷酸或者为它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以行使任何已知或未知的功能。下面是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、DNA、cDNA、基因组DNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以是天然存在的多核苷酸、合成多核苷酸、重组多核苷酸或它们的任何组合。多核苷酸包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。可在所述聚合物装配之前或之后，对所述核苷酸结构进行修饰(如果存在的话)。核苷酸序列可以间隔有非核苷酸组分。还可以在聚合之后，例如通过与标记组分缀合，对多核苷酸进行进一步修饰。所述术语既包括双链分子，又包括单链分子。除非另有说明或需要，否则本发明的任何实施方案即多核苷酸既包括双链形式，又包括已知或预计构成所述双链形式的两种互补单链形式的每一种形式。
术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的按字母排列的表示。多核苷酸由四种核苷酸碱基的特异性序列组成腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和当所述多核苷酸是RNA时用来代替鸟嘌呤的尿嘧啶(U)。可以将该按字母排列的表示输入计算机的数据库中，用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。
术语“分离的多核苷酸分子”包括从在所述多核苷酸的天然来源中存在的其它多核苷酸分子中分离的多核苷酸分子。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从具有天然缔合的基因组DNA的染色体中分离的多核苷酸分子。优选“分离的”多核苷酸在不含所述多核苷酸所来源的生物体的基因组DNA中的天然邻接所述多核苷酸的序列(即位于目标多核苷酸5′端和3′端的序列)。例如，在各种实施方案中，本发明的分离的多核苷酸分子或者编码本发明的多肽的多核苷酸分子可以含有不少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然邻接其所来源的多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸分子。此外，“分离的”多核苷酸分子例如cDNA分子可以基本上不含其它细胞物质或培养基(当通过重组技术产生时)，或者基本上不含化学前体或其它化学物质(当化学合成时)。
“基因”包括在转录和翻译之后，含有至少一个能够编码特定多肽或蛋白的可读框的多核苷酸。本文描述的任何多核苷酸序列也可用来鉴定它们缔合的基因的较大片段或全长编码序列。较大片段序列的分离方法是本领域技术人员已知的。
本文所用的“天然存在的”多核苷酸分子包括例如具有天然存在的核苷酸序列的RNA分子或DNA分子(例如编码天然蛋白)。
本文所用的术语“转录的”或“转录”是指将遗传密码信息从一种核酸转移到另一种核酸的过程，并且特别是指根据cDNA模板合成mRNA的碱基序列的过程。
术语“多肽”包括两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetics)的化合物。所述亚单位可以通过肽键连接在一起。在另一个实施方案中，所述亚单位可以通过其它键例如酯键、醚键等连接在一起。本文所用的术语“氨基酸”包括任何天然和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。多于三个或更多个氨基酸的肽链被称为多肽或蛋白。
“基因产物”包括当基因被转录时产生的mRNA或者当基因被转录和翻译时产生的多肽。
本文所用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与第二种多肽有效连接的第一种多肽。嵌合蛋白可以任选包含与第一种或第二种多肽有效连接的第三种、第四种或第五种或其它的多肽。嵌合蛋白可以包含两种或更多种不同的多肽。嵌合蛋白可以包含同一多肽的多拷贝。嵌合蛋白也可以在一种或多种多肽中包含一个或多个突变。嵌合蛋白的制备方法是本领域众所周知的。在本发明的一个实施方案中，所述嵌合蛋白是Gαi和Gαq的嵌合体。
“分离的”或“纯化的”蛋白、多核苷酸或分子是指基本上不含细胞物质，例如来自所述蛋白、多核苷酸或分子所来源的细胞或组织源的其它污染蛋白，或者基本上无化学前体或其它化学物质(当化学合成时)。用语“基本不含细胞物质”包括从其分离或重组产生或合成的细胞的细胞组分中分离的制备物。在一个实施方案中，所述用语“基本上不含细胞物质”包括含有的其它蛋白(在本文也称为“污染蛋白”)少于约30％(干量)、更优选少于约20％、再更优选少于约10％、最优选少于约5％的目标蛋白制剂。如果重组产生所述蛋白或多核苷酸，则它也优选基本上不含培养基，即培养基代表目标蛋白制剂的少于约20％、更优选少于约10％、最优选少于约5％(体积)。
用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括从参与合成所述蛋白、多核苷酸或分子的化学前体或其它化学物质中分离的制备物。在一个实施方案中，所述用语“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括含有少于约30％(干重)的化学前体或其它化学物质、更优选少于约20％化学前体或其它化学物质、再更优选少于约10％化学前体或其它化学物质、最优选少于约5％化学前体或其它化学物质的蛋白制剂。
本文所用的蛋白的“生物活性部分”包括含有与所述蛋白的氨基酸序列足够同源或衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白片段，所述蛋白片段包括比全长蛋白少若干个氨基酸的蛋白，并且表现出所述全长蛋白的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有所述蛋白的至少一种活性的结构域或基序。蛋白的生物活性部分可以是例如长10个、25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，可以用GPCR信号蛋白的生物活性部分作为用于开发调节GPCR信号转导的药物靶。
“异常”表达的，当用于指基因时，包括从基因转录的mRNA的异常产生或者来自基因的多肽的异常产生。与正常细胞或对照细胞的表达水平相比，异常表达的基因可以是过量表达的或表达不足的。在一个方面，异常表达是指根据一种标准差与正常表达水平不同的表达水平。在一个优选的方面，所述差别是比对照样品中检测出的表达水平高2倍或低2倍。
术语“异常”表达的也包括与正常细胞或对照细胞相比，细胞或组织中核苷酸序列在表达方面不同。在本发明的某些实施方案中，所述对照细胞是来自没有GPCR相关疾病表现的个体的含有GPCR的细胞。在某些实施方案中，所述对照细胞是来自不受含有GPCR的疾病影响的组织的含有GPCR的细胞。在本发明的某些实施方案中，所述对照细胞是在激动剂存在下含有GPCR的细胞。在某些实施方案中，所述对照细胞是包含以下组分的试验细胞i)GPCR，ii)RGS，iii)相应的Gα蛋白和iv)报道基因，其中与没有所述Gα蛋白表达的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达。在某些实施方案中，比较在以下细胞之间的表达含有GPCR的细胞或暴露于激动剂或试验化合物的试验细胞相对于含有GPCR的细胞或不暴露于激动剂或试验化合物的试验细胞。在某些实施方案中，比较来自不受含有GPCR的疾病影响的组织的含有GPCR的细胞与受影响组织的含有GPCR的细胞之间的表达。在某些实施方案中，所述正常细胞或对照细胞或样品基本上没有GPCR相关疾病。
本文所用的术语“异常”包括基因或蛋白偏离正常表达或活性的表达或活性。异常表达或活性包括增加或降低的表达或活性、以及不能遵循正常发育模式表达或亚细胞模式表达的表达或活性。例如，异常表达或活性计划包括其中基因突变使所述基因的表达不足或过量表达的情况，以及其中这样的突变导致产生非功能性蛋白或不以正常方式起作用的蛋白的情况。在某些实施方案中，所述正常细胞或样品细胞或对照细胞基本上没有GPCR相关疾病。
本文所用的术语“调节”包括正调节、诱导、刺激、增强、减弱、和/或抑制解除、以及抑制和/或负调节或抑制。
在多核苷酸操作的情况下使用的“探针”包括作为试剂以通过与靶杂交而检测目标样品中存在的所述靶的寡核苷酸。通常，探针将包括标记或可以在杂交反应之前或之后结合标记的工具。合适的标记包括但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白，包括酶。
“引物”包括与目标样品中存在的靶或“模板”结合的短多核苷酸，所述多核苷酸一般具有游离3′-OH基团，而且通过与所述靶杂交，其后促进与所述靶互补的多核苷酸的聚合作用。“聚合酶链式反应”(″PCR″)是用由“上游”引物和“下游”引物组成的“引物对”或“引物组”和聚合催化剂例如DNA聚合酶、通常是热稳定聚合酶，复制拷贝由靶多核苷酸构成的反应。PCR方法是本领域众所周知的，并且叙述于例如MacPherson等，IRL Press at Oxford University Press(1991)。产生多核苷酸复制拷贝的所有过程例如PCR或基因克隆在本文统称为“复制”。也可以用引物作为杂交反应例如DNA印迹分析或RNA印迹分析中的探针(参见例如Sambrook，Fritsh和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
术语“cDNA”包括与细胞或生物体mRNA中存在的、可以用酶例如逆转录酶将其转变成cDNA的mRNA分子互补的DNA。“cDNA文库”包括细胞或生物体中存在的、用逆转录酶转变成cDNA分子、然后插入到“载体”(可以在加入外源DNA后继续复制的其它DNA分子)中的mRNA分子的集合物。可供文库用的示例性载体包括噬菌体即感染细菌的病毒(例如λ噬菌体)。然后可以探测所述文库的目标特异性cDNA(并因此探测mRNA)。许多类型的CDNA文库是市售的，并且可以连同本发明一起使用。
“基因传递载体”包括能够将一种或多种多核苷酸插入到宿主细胞的分子。基因传递载体的实例是脂质体；生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；和细菌；病毒，病毒载体，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒，真菌载体以及通常本领域使用的、已描述的在各种各样的真核宿主和原核宿主中复制和/或表达的其它重组载体。所述基因传递载体可以用于插入多核苷酸的复制、基因治疗以及仅仅用于多肽和蛋白的表达。
“载体”包括将插入多核苷酸转移到宿主细胞中和/或宿主细胞间的自我复制型核酸分子。所述术语计划包括主要起将核酸分子插入到细胞中的作用的载体、主要起复制核酸的作用的复制载体以及起转录和翻译DNA或RNA的作用的表达载体。也包括提供上述功能中不止一种功能的载体。
“宿主细胞”计划包括可以是或已经是载体的受体或结合外源多核苷酸和/或多肽的载体的受体的任何单细胞或单细胞培养物。还包括单细胞的后代。所述后代由于自然突变、偶然突变或蓄意突变可能不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学方面或者在基因组或总DNA互补性方面)。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，包括但不限于鼠类细胞、大鼠细胞、猿猴细胞或人类细胞。
术语“遗传修饰的”包括含有和/或表达外源基因或多核苷酸序列、进而修饰细胞或其后代的基因型或表型的细胞。“遗传修饰的”也包括含有或表达已导入细胞中的基因或多核苷酸序列的细胞。例如，在该实施方案中，遗传修饰的细胞具有已导入的基因，该基因对于所述细胞也是内源的。术语“遗传修饰的”也包括细胞内源核苷酸的任何添加、缺失或破坏。
本文所用的“表达”包括将多核苷酸转录为RNA和/或翻译成多肽的过程。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可以包括对RNA的剪接(如果选择合适的真核宿主的话)。表达所需的调节元件包括结合RNA聚合酶和转录起始序列的启动子序列，以供核糖体结合用。例如细菌表达载体包括启动子例如lac启动子以及用于转录起始的Shine-Dalgarno序列和起始密码子AUG。同样，真核表达载体包括用于RNA聚合酶II的异源或同源启动子、下游聚腺苷酸化信号、起始密码子AUG和用于核糖体分离的终止密码子。这样的载体可以在市场上获得或者通过本领域众所周知的方法中描述的序列装配，例如下文描述的用于构建所述载体的方法。
本文所用的“试验样品”包括从目标患者中获得的生物样品。例如，试验样品可以是生物体液(例如血液、淋巴、脑脊髓液)、细胞样品或组织样品(例如从生物活检获得的组织)。
本文所用的“杂交”包括一种或多种多核苷酸反应以形成通过核苷酸残基的碱基间的氢键键合稳定的复合物的反应。所述氢键可以通过Warson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其它序列特异性方式产生。所述复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条链或更多条链、一条自我杂交链或这些链的任何组合。杂交反应可以包括更为广泛过程中的一个步骤，例如起始PCR反应或多核苷酸被核酶酶促切割。
杂交反应可以在不同的“严格性”条件下进行。杂交反应的严格性包括任何两种核酸分子相互杂交将感到困难。本发明也包括能够在降低的严格性条件下、更优选严格性条件下、最优选高严格性条件下与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格性条件的实例示于以下的表2中高严格性条件是那些至少与例如条件A-F一样严格性的条件；严格性条件是至少与例如条件G-L一样严格性的条件；降低的严格性条件是至少与例如条件M-R一样严格性的条件。
表2.严格性条件
1杂交体长度预期是杂交多核苷酸的杂交区。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交体长度假定是所述杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸被杂交时，则可以通过将所述多核苷酸的所述序列进行序列比对并且鉴定出一个或多个最适序列互补性的区域，来确定杂交体长度。
H在杂交缓冲液和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以替代为SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成之后，将洗涤进行15分钟。
TB*-TR*预期长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该是低于杂交体解链温度(Tm)5-10℃，其中Tm按照下列等式来确定。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)*4(G+C碱基数)。对于长度在18-49个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5*16.6(log10Na+)*0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体中的碱基数，而Na+为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC，Na+＝0.165M)。
对于多核苷酸杂交，严格性条件的其它实例在以下文献中提供Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章，和Current Protocols in MolecularBiology，1995，F.M.Ausubel等(编著)，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10节和第6.3-6.4节，所述文献通过引用结合到本文中。
当杂交以两条单链多核苷酸之间的反平行构型发生时，反应被称为“退火”，而那些多核苷酸描述为“互补的”。如果杂交可以在第一种多核苷酸链和第二种多核苷酸链中的一条之间发生，则双链多核苷酸可以与另一多核苷酸“互补”或“同源”。“互补性”或“同源性”(一种多核苷酸与另一种多核苷酸互补的程度)是可定量的，就碱基比例而言，在预期相反链通过氢键相互键合时，按照一般可接受的碱基配对法则。
“抗体”包括能够结合抗原上存在的表位的免疫球蛋白分子。本文所用的所述术语不仅包括完整的免疫球蛋白分子例如单克隆抗体和多克隆抗体，而且包括抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、双特异性抗体、人源化蛋白或抗体以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修饰。
本文所用的术语“正常”，当与“细胞”、“组织”或“样品”结合使用时，是指来自没有GPCR相关疾病的患者的细胞、组织或其它这样的样品，或者来自基本上没有所述GPCR相关疾病的细胞、组织或样品。在某些实施方案中，本发明的对照样品取自正常样品。本文所用的“对照表达水平”是指与正常样品或细胞相关的表达水平。
下面的小节进一步详细地描述了本发明的各个方面，所述小节更详细地描述本发明。“小节”的应用并不意味着限制本发明，因为各小节可适用于本发明的任何方面。
GPCR信号虽然不受机制的限制，但是本发明基于这样的发现某些Gα蛋白可以使来自GPCR的信号减弱。已经发现Gαi类蛋白和Gαq类蛋白增强某些RGS蛋白的抑制效应。因此，所述Gαi蛋白或Gαq蛋白并结合其相应的RGS蛋白一起减弱GPCR信号。
但不限于此，本发明还基于Gαi或Gαq的表达水平导致信号减弱的发现。
在本文示例性的一个具体的实施方案中，证明GPCR信号途径由于RGS和Gαi的共表达而减弱和抑制。在不存在这些共表达分子的情况下，当GPCR接触GPCR激动剂时，所述GPCR信号途径能够诱发一种反应。所述反应可以通过本领域已知的多种技术进行检测。一种用于检测GPCR信号的技术是提供具有报道基因的含有GPCR的细胞，所述报道基因在对GPCR信号应答时被转录。在该实施方案中，将本发明的RGS导入所述细胞中，导致GPCR信号与没有RGS的信号相比被抑制约30-40％。令人惊奇的是，所述RGS与相应的Gα蛋白一起共转染，导致GPCR信号与没有所述RGS分子或Gα分子的信号相比被抑制80-90％。因此，在相应的RGS存在下，Gαi或Gαq分子能够减弱GPCR信号。
这种减弱增加可用于药物筛�。蛭糯蟮募跞跣藕疟阌诠鄄斓娇煽康难粜越峁鸵跣越峁�。因此，本发明的某些实施方案提供用于减弱GPCR信号的方法，所述方法可用于GPCR相关疾病的药物筛选测定、诊断、预后和治疗。
信号被Gαi或Gαq以及RGS弱化，进一步提供可用于治疗GPCR相关疾病的方法和组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及表1中所列举出的RGS蛋白和Gα蛋白、多核苷酸以及作为GPCR信号分子和GPCR相关疾病的治疗靶的编码多肽的应用。关于这样的GPCR相关疾�。庑┬藕欧肿踊箍捎糜谡页霰泶锼降牟钜煊朐ず蟛罨蛟ず罅己弥涞牧�。本发明的RGS蛋白和Gα蛋白也可用于评价GPCR相关疾病的治疗或疗法的功效，或者可用作治疗的靶。本发明还提供用于抑制GPCR相关疾病的方法以及鉴定可用于治疗GPCR相关疾病的RGS抑制剂的方法。
因此，虽然不受机制的限制，但是本发明部分基于这样的原理某些RGS蛋白并结合本发明的某些Gα蛋白当以与正常(非患病)细胞相似或基本相似的水平表达时减弱GPCR信号并且可以缓解GPCR相关疾病。此外，本发明部分基于这样的原理某些RGS蛋白并结合本发明的某些Gα蛋白当以与正常(非患病)细胞相似或基本相似的水平激活时减弱GPCR信号并且可以缓解GPCR相关疾病。再者，本发明部分基于这样的原理RGS蛋白起部分促进GTP结合型Gα水解成GDP结合型Gα的作用。
在一个方面，本发明提供其表达水平或活性与存在GPCR相关疾病相关的RGS分子和Gα分子。本发明的RGS分子和Gα分子可以是多核苷酸(例如DNA、cDNA或mRNA)或者肽或多肽。在某些优选的实施方案中，通过检测转录多核苷酸或其部分的存在，实施本发明。另一方面，可以通过检测一种蛋白的存在，进行检测。
在本发明的另一方面，测定特定患者样品中所述RGS蛋白和Gα蛋白的表达水平，供诊断或预后信息用。在某些实施方案中，相对表达水平的比较结果说明GPCR相关疾病严重程度，因为这样的结果可用于诊断和预后分析。此外，通过比较来自取自诸如治疗前后的不同时间点和/或治疗过程中的不同时间点的组织样品的GPCR相关疾病的相对GPCR信号，获得这些阶段中每个阶段重要的基因的信息。本领域技术人员将会认识到其它对照例如通过使用不同的时间点或者试验化合物存在与否。本领域普通技术人员将会认识到，其它激活后时间点可以用来评价RGS蛋白和Ga蛋白的表达水平。例如，激活后时间点包括但不限于6小时、8小时、12小时、15小时、20小时、24小时、36小时、48小时、72小时。本领域技术人员将会认识到这样的事实，一种优选的检测方法是其中所得的检测值高于所述方法的最小检出限的检测方法。
对在GPCR相关疾病相对于正常组织中异常表达的RGS分子和Gα分子的鉴定使得可以以多种方式应用本发明。例如，在各种疾病进程状态下RGS和Gα表达的比较，提供一种用于长期预后(包括存活时间)的方法。在另一个实施方案中，可以评价具体治疗方案的评价，包括具体药物是否将用来改善特定患者的长期预后。在该实施方案中，本发明的RGS分子和Gα分子的表达和活性可能与患者的长期预后相关。
GPCR信号减弱的发现使得可以用肉眼筛选出调节特定信号模式的试验化合物；例如可以筛选出将预后差的信号分布型转变成预后更好的信号分布型的化合物。这些方法也可以在蛋白质水平上进行；也就是说，可以评价GPCR相关疾病中RGS蛋白的蛋白表达水平，以用于诊断和预后目的或者用于筛选试验化合物。例如，相对于这些实施方案，本发明的RGS分子或Gα分子在对治疗方案有反应时可以调节活性或表达。另一方面，这类分子的活性或表达的调节可能与GPCR相关疾病的诊断或预后相关。另外，为了基因治疗，可以给予RGS分子和Gα分子。例如可以给予对应于RGS蛋白或Gα蛋白的反义寡核苷酸，以降低这些蛋白的表达或活性。这样的给药可以导致GPCR信号增加以及缓解GPCR相关疾病。
在本发明的另一个实施方案中，可以用多种GPCR信号分子中的一种作为本发明的治疗化合物。在其它实施方案中，本发明的RGS抑制剂可以用作本发明的治疗化合物或者可与本发明的一种或多种其它治疗组合物联合使用。将这样的化合物配制成药用组合物在下面的小节中进行描述。
标记来源包含本发明的RGS或Gαi或Gαq或其活性部分的多核苷酸和多肽，可以从患者的任何组织或细胞中分离出来，或者，可以通过本领域已知的技术来合成。在一个优选的实施方案中，所述组织来自神经系统或心血管系统。然而，对本领域技术人员显而易见的是，包括体液例如血液在内的组织样品也可用来作为评价本发明的RGS分子或Gα分子的来源。含有一种或多种本发明RGS分子或Gα分子的组织样品本身可以用于本发明方法中，并且本领域技术人员将会认识到可以方便地获得、贮藏和/或保存这类样品的方法。
分离的多核苷酸本发明的一方面涉及包含本发明的RGS分子和Gα分子的分离的多核苷酸(例如DNA、cDNA、mRNA)分子或编码本发明多肽分子的多核苷酸或其片段。本发明的另一方面涉及足以用作杂交探针以鉴定样品中编码本发明标记的多核苷酸分子的分离的多核苷酸片段，以及用作编码本发明GPCR信号分子的核酸分子的扩增或突变的PCR引物的核苷酸片段。本发明的另一方面涉及供基因治疗例如反义和核酶治疗用的分离的本发明RGS多核苷酸和Gα多核苷酸。
采用本领域已知的标准分子生物学技术和序列信息，可以分离出本发明的多核苷酸分子或其同系物或其部分。用表1中列举出的RGS分子或Gα分子之一的整个多核苷酸序列或其部分作为杂交探针，使用标准杂交和克隆技术(例如描述于Sambrook，Fritsh和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Coldspring Harbor，NY，1989)，可以分离出本发明的标记基因或编码本发明标记多肽的多核苷酸分子。
按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，可以扩增本发明的多核苷酸。可以将如此扩增的多核苷酸克隆到合适的载体中并通过DNA序列分析分析其特征。此外，也可以通过标准合成技术，例如利用自动DNA合成仪，制备对应于本发明RGS或Gα多核苷酸序列的寡核苷酸或编码本发明多肽的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含作为本发明RGS或Gα多核苷酸的核苷酸序列的互补物的多核苷酸分子或其同系物或这些核苷酸序列的任一部分。作为与这样的核苷酸序列互补的多核苷酸是足以与所述核苷酸序列互补的多核苷酸，使得它可以与所述核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。在一个优选的实施方案中，所述互补核苷酸序列能够在高严格性条件下与靶核苷酸序列杂交。
此外，本发明的多核苷酸分子可以仅包含本发明RGS或Gα多核苷酸的多核苷酸序列的一部分或编码本发明RGS或Gα多肽的基因，例如可以用作探针或引物的片段。所述探针/引物通常包含基本纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含在严格性条件下与以下核苷酸杂交的核苷酸序列的一个区域本发明的RGS或Gα多核苷酸的至少约7个或15个、优选约20个或25个、更优选约50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、400个或更多个连续核苷酸。
可以用基于标记基因的核苷酸序列或编码本发明的标记多肽的多核苷酸分子的探针来检测对应于本发明标记基因和/或标记多肽的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中，所述探针包含与其连接的标记基团，例如所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以用这样的探针作为诊断试验试剂盒的一部分，用以鉴定错误表达(例如过量表达或表达不足)本发明标记多核苷酸或多肽或者具有更多或更少拷贝的本发明RGS或Gα基因的细胞或组织。例如，可以检测来自患者的细胞样品中本发明RGS或Gα分子的水平，可以测定多肽或编码RGS或Gα多肽的基因的mRNA转录物的量，或者可以评价本发明标记基因的突变或缺失的存在。
同系物、等位基因变异体和突变体准确地讲，本发明也包括本发明RGS和Gα分子的同系物，特别是人同系物。基因同系物是本领域众所周知的，而且是运用数据库或搜索引擎例如Pubmed-Entrez数据库可获得的。
本发明还包括因为遗传密码的简并性而编码相同蛋白的多核苷酸分子，如表1所示。
本发明也包括在结构上不同于上述分子(即具有微小改变的序列)但具有与上述分子基本相同的特性(例如编码氨基酸序列或仅改变非必需氨基酸残基)的多核苷酸分子。这样的分子包括等位基因变异体，在本文各小节中进行更详细地描述。
除本发明RGS蛋白和Gα蛋白的核苷酸序列外(它们可能是本领域已知的，如公开于美国专利第6,069,296号和美国专利第5,929,207号)，本领域技术人员将会认识到，导致表1中所列举出的蛋白的氨基酸序列发生改变的DNA序列多态性可以在种群(例如人群)内存在。表1中所列举出的蛋白的这种遗传多态性由于天然等位基因变异可以在种群内的个体中存在。等位基因是在给定基因座上存在的一组基因中的一个基因。另外，人们将会认识到，影响RNA表达水平的DNA多态性也可以存在可以影响该基因的总体表达水平(例如通过影响调节或降解)。本文所用的短语“等位基因变异体”包括在给定基因座上存在的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列编码的多肽。
在另一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸分子是长至少15个、20个、25个、30个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个、1900个、2000个或更多个核苷酸，并且在严格性条件下与对应于本发明RGS蛋白或Gα蛋白的RGS或Gα多核苷酸分子杂交。在某些实施方案中，所述在严格性条件下杂交用来描述在相互至少60％同源性的核苷酸序列通常保持相互杂交的杂交和洗涤条件。优选所述条件使得相互至少约70％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约85％或90％同源性的序列通常保持相互杂交。这样的严格性条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。
除了可以在所述种群中存在的编码本发明RGS或Gα蛋白的基因的天然存在的等位基因变异体外，技术人员将会进一步认识到，通过在本发明的基因或多核苷酸的核苷酸序列中发生突变，可以引入各种变化，从而导致编码蛋白的氨基酸序列中的变化，但不改变这些蛋白的功能活性。例如，可以进行导致在“非必需”氨基酸残基上发生氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以改变蛋白的野生型序列但不改变生物活性的残基，而对于生物活性，需要“必需”氨基酸残基。例如，预计在等位基因变异体中保守的氨基酸残基(即“必需的”)或基因同系物(例如在来自不同物种的基因同系物中)保守的氨基酸残基尤其不适合进行改变。
在本发明的其它方面，RGS或Gα分子的多核苷酸可以包含一种或多种突变。通过在编码所述标记蛋白的基因的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，可以产生在本发明的RGS或Gα蛋白中具有突变的编码蛋白的分离的多核苷酸分子，使得在所述编码蛋白中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。这样的技术是本领域众所周知的。通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，可以在本发明的多核苷酸中引入突变。最好在一种或多种预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。另一方面，例如通过饱和诱变，可以沿本发明RGS或Gα基因的整个编码序列或其一部分随机引入突变，并且所产生的突变体可以根据生物活性进行筛�。约ǔ霰Ａ艋钚缘耐槐涮�。在诱变后，可以重组表达编码蛋白，并且可以测定所述蛋白的活性。
在其它实施方案中，寡核苷酸可以包括其它所连接基团例如肽(例如对于体内打靶宿主细胞受体)或促进穿越细胞膜的转运因子(参见例如Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等(1987)Pros.Natl.Acad Sci.USA 84648-652；PCT公布号WO88/09810)或血—肾屏障(参见例如PCT公布号WO89/10134)。另外，可以用杂交触发的切割剂(参见例如Krol等(1988)Bio-Techniques 6958-976)或嵌入剂(参见例如Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)，对寡核苷酸进行修饰。为此，可以将所述寡核苷酸与另一种分子(例如肽、杂交触发的交联剂、转运因子或杂交触发的切割剂)缀合。最后，可以对所述寡核苷酸进行可检测标记，或者使得通过加入另一种试剂(例如针对酶标记的底物)检测到所述标记或者在核苷酸杂交后可立即检测的标记(例如放射性标记、荧光标记或分子信标(molecular beacon)，如描述于美国专利5,876,930)。
反义分子和核酶分子本发明的另一方面涉及对于本发明的RGS或Gα多核苷酸而言为反义的分离的多核苷酸分子。“反义”多核苷酸包含与编码蛋白的“有义”多核苷酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子的编码链互补的核苷酸序列或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义多核苷酸可以与有义多核苷酸通过氢键键合。所述反义多核苷酸可以与本发明基因的完整编码链互补或者仅与其一部分互补。在一个实施方案中，反义多核苷酸分子对于本发明核苷酸序列的编码链的“编码区”而言是反义的。术语“编码区”包括包含被翻译成氨基酸的密码子的核苷酸序列区。在另一个实施方案中，所述反义多核苷酸分子对于本发明核苷酸序列的编码链的“非编码区”而言是反义的。
本发明的反义多核苷酸可以按照Watson和Criick碱基配对法则来设计。所述反义多核苷酸分子可以与对应于本发明基因的mRNA的完整编码区互补，但更优选是仅对于编码区或非编码区的一部分为反义的寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是例如长约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。例如，反义RGS可能最好是对于RGS核心结构域的一部分为反义的寡核苷酸。
可以使用本领域已知的方法，采用化学合成和酶促连接反应，构建本发明的反义多核苷酸。例如，使用设计用以增加分子的生物稳定性或增加在反义多核苷酸和有义多核苷酸之间形成的双链体的物理稳定性的天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸，可以化学合成反义多核苷酸(例如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用来产生所述反义多核苷酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-isopentenyladen4exine、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。另一方面，可以用以反义方向(即从插入多核苷酸转录的RNA对于目标靶多核苷酸而言必定为反义方向，在下面的小节中有进一步的描述)，将多核苷酸亚克隆到表达载体中，通过生物学方法产生反义多核苷酸。
通常将本发明的反义多核苷酸分子给予患者或者原位产生本发明的反义多核苷酸分子，使得它们与编码本发明的RGS或Gα蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制所述蛋白的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。所述杂交可以是用常规核苷酸互补性来形成稳定的双链体，或者，例如在结合DNA双链体的反义多核苷酸分子的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。本发明反义多核苷酸分子的给药途径的一个实例包括在组织部位(例如淋巴节、心脏或血液)直接注射。另一方面，可以将反义多核苷酸分子进行修饰，以靶向所选的细胞，然后系统给药。例如，对于系统给药，可以将反义分子进行修饰，致使它们与所选细胞表面表达的受体或抗原的肽或抗体特异性结合，例如，通过将所述反义多核苷酸分子与结合细胞表面受体或抗原连接。在本发明的某些实施方案中，例如当治疗神经精神病时，最好是靶向神经元细胞或脑细胞。在这样的实施方案中，神经元特异性抗原包括但不限于多巴胺受体、5-羟色胺受体、5-羟色胺转运蛋白、M2受体、5HTIA受体、Edg1受体和缓激肽受体。采用本文描述的或本领域已知的载体，也可以将所述反义多核苷酸分子传递至细胞。为了达到所述反义分子的足够胞内浓度，优选其中将所述反义多核苷酸分子置于强polII启动子或polIII启动子控制之下的载体构建体。
在又一个实施方案中，本发明的反义多核苷酸分子是α-端基异构多核苷酸分子。α-端基异构多核苷酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中与通常的β-单位相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Polynucleotides Res.156625-6641)。所述反义多核苷酸分子也可以包含一个2′-邻甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Polynucleotides Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215327-330)。
在又一个实施方案中，本发明的反义多核苷酸为核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割与它们具有互补区的单链多核苷酸例如mRNA。因此，核酶(例如锤头型核酶(描述于Haselhoif和Gerlach(1988)Nature 334585-591))可以用来催化性地切割本发明标记基因的mRNA转录物，从而抑制所述mRNA的翻译。在本文中公开了可以根据本发明基因的核苷酸序列设计对RGS或Gα多核苷酸具有特异性的核酶。例如可以构建四膜虫属(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中所述活性位点的核苷酸序列与在编码标记蛋白的mRNA中待切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利第4,987,071号；和Cech等的美国专利第5,116,742号。另一方面，从本发明基因转录的mRNA可以用来从RNA分子库中选择出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418。
另一方面，可以通过靶向与这些基因的调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成阻止所述基因在靶细胞中的转录的三螺旋结构，从而抑制本发明RGS或Gα基因的表达。一般参见Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
也可以采用RNA干涉(″RNAi″)，来抑制本发明RGS和Gα基因和蛋白的表达。这是一项针对转录后基因沉默(″PTGS″)的技术，其中靶基因活性被关连双链RNA(″dsRNA″)特异性消除。RNAi在许多方面类似于植物中的PTGS并且已在许多无脊椎动物中检测到，所述无脊椎动物包括锥虫、水螅、涡虫、线虫和果蝇(黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))。它可以参与调节转座元件固定化和抗病毒状态形成。哺乳动物系统中的RNAi公开于PCT申请WO00/63364，所述申请通过引用全部结合到本文中。一般而言，将至少约21个核苷酸、与所述靶基因同源的dsRNA导入所述细胞中，并观察到基因活性方面的序列特异性降低。参见例如Elbashir等，(2001)Nature 6836494-498。
在再一个实施方案中，本发明多核苷酸分子可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上进行修饰，以改进例如所述分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，所述多核苷酸分子的脱氧核糖磷酸骨架可以进行修饰，以产生肽多核苷酸(参见Hyrup B.等(1996)Bioorganic&Medicinal Chemistry 4(1)523)。本文所用的术语“肽多核苷酸”或″PNA″是指多核苷酸模拟物，例如DNA模拟物，其中所述脱氧核糖磷酸骨架被假肽(pseudopeptide)骨架取代，而只保留四种天然核苷碱基。已经表明，所述PNA的中性骨架允许在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。采用在Hyrup等，(1996)参见上文；Perry-O′Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.9314670-675中描述的标准固相肽合成方案，可以进行PNA寡聚物的合成。
PNA可以用于治疗应用和诊断应用。例如，可以用PNA作为针对标记基因表达的序列特异性调节的反义因子或反基因因子，通过例如诱导转录或翻译停止或者抑制复制。本发明RGS或Gα多核苷酸分子的PNA或其同系物也可以用于分析基因中的单碱基对突变，(例如通过PNA-指导的PCR钳法)；当与其它酶联合使用时作为“人工限制性酶”，(例如S1核酸酶(Hyrup(1996)，参见上文)或者作为进行DNA测序或杂交的探针或引物(Hyrup(1996)，参见上文；Perry-O′Keefe，参见上文)。
在另一个实施方案中，可以通过使亲脂性或其它辅助基团与PNA连接、通过形成PNA-DNA嵌合体或者通过使用脂质体和本领域已知的递药的其它技术，对PNA进行修饰(例如以增强其稳定性或细胞摄入)。例如，可以产生可具有PNA和DNA两者的有利特性的本发明多核苷酸分子的PNA-DNA嵌合体。这样的嵌合体使得DNA识别酶(例如RNA酶H和DNA聚合酶)与所述DNA部分相互作用，而所述PNA部分将会提供高结合亲和性和特异性。采用根据碱基堆积即核苷碱基间的许多键和取向选择的合适长度的连接物(Hyrup B.(1996)，参见上文)，可以将PNA-DNA嵌合体连接起来。可以如HyrupB.(1996)，参见上文和Finn P.J.等(1996)Polynucleotide Res.24(17)3357-63中描述的方法，进行PNA-DNA嵌合体的合成。例如，可以采用标准亚磷酰胺偶联化学在固体支持体上合成DNA链，并且经修饰的核苷类似物例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺可以用作所述PNA和DNA5′端之间的间隔物(Mag，M.等(1989)Polynucleotide Res.175973-88)。然后使PNA单体以分步方式进行偶联，以产生具有5′PNA区段和3′DNA区段的嵌合分子(Finn P.J.等(1996)，参见上文)。另一方面，可以用5′DNA区段和3′PNA区段合成嵌合分子(Peterser，K.H.等(1975)Bioorganic Med Chem.Lett.51119-11124)。
分离的多肽本发明的几个方面涉及分离的RGS蛋白和Gα蛋白及其生物活性部分以及适合用作产生抗标记蛋白抗体的免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，可以通过合适的纯化方案，采用标准蛋白质纯化技术，从细胞和组织源中分离出天然标记蛋白。在另一个实施方案中，通过重组DNA技术产生本发明的RGS蛋白或Gα蛋白。另一方面，对于重组表达，可以采用标准肽合成技术化学合成蛋白或多肽。同系物本发明提供表1所示的RGS蛋白和Gα蛋白或其同系物(包括人同系物)的用途。在其它实施方案中，所述蛋白与表1所列举的蛋白基本同源并且保留了所述RGS蛋白或Gα蛋白的至少一种功能活性，但是由于所述标记基因的天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列方面不同，如以上详细描述的。因此，在另一个实施方案中，本发明的RGS蛋白或Gα蛋白是这样的蛋白所述蛋白包含与RGS分子或Gα分子、特别是表1所列举的RGS蛋白的氨基酸序列有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同源性的氨基酸序列。
为了测定这两种氨基酸序列或这两种多核苷酸序列的同一性百分率，将所述序列进行比对，用于最佳比较目的(例如可以在用于最佳序列比对的第一个和第二个氨基酸序列或多核苷酸序列的一个或两个中引入空位(gap)，并且在比较中可以不考虑非同源序列)。在一个优选的实施方案中，用于比较目的、进行序列比对的参比序列长度是所述参比序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、80％或90％。然后对相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当所述第一个序列中的一个位置被与所述第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或多核苷酸同一性相当于氨基酸或多核苷酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分率随所述序列共享的相同位置的数目而变，而且考虑了空位数目和每个空位的长度，需要引入所述空位以对这两个序列进行最佳比对。
运用数学算法可以完成对序列的比较以及测定两个序列间的同一性百分率。在一个优选的实施方案中，运用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法，该算法已在GCG软件包中加入了GAP程序，采用Blossom62矩阵或PAM250矩阵以及空位加权(gapweight)为16、14、12、10、8、6或4，而长度加权(length weight)为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列间的同一性百分率。在再一个优选的实施方案中，运用GCG软件中的GAP程序，采用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位加权为40、50、60、70或80，而长度加权为1、2、3、4、5或6，测定两个核苷酸序列间的同一性百分率。在另一个实施方案中，运用E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS，411-17(1989))，该算法加入了ALIGN程序(version 2.0)，采用PAM120加权残基表，空位长度罚分(gap length penalty)为12，而空位罚分(gap penalty)为4，测定两个氨基酸序列或核苷酸序列间的同一性百分率。
本发明的多核苷酸和蛋白序列可以进一步用作进行针对公共数据库搜索的“查询序列”，例如鉴定出其它家族成员或相关序列。运用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST程序和XBLAST程序(version 2.0)，可以进行这样的搜索。可以用NBLAST程序，分值＝100，字长＝12，进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，分值＝50，字长＝3，进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明RGS分子或Gα分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位(gapped)比对，可以如Altschul等，(1997)Polynucleotide Res.25(17)3389-3402中描述的方法使用Gapped BLAST。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
嵌合蛋白本发明提供本发明RGS蛋白或Gα蛋白的嵌合蛋白或融合蛋白。嵌合蛋白的多肽可以对应于整个RGS蛋白或Gα蛋白或其一部分。本发明也提供编码嵌合蛋白的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，嵌合蛋白包含Gα蛋白的至少一个生物活性部分。就嵌合蛋白而言，术语“有效连接”是指第一种多肽和第二种多肽或另外的多肽相互符合读框地融合。可以将第二种多肽或额外的多肽与第一种多肽的N末端或C末端融合。在一个优选的实施方案中，本发明提供包含以下组分的Gα嵌合蛋白i)能够接触RGS的第一种Gα蛋白的一部分和ii)能够接触GPCR的第二种Gα蛋白的一部分。在一个具体的实施方案中，本发明提供Gαq1i嵌合蛋白，其中所述Gαq蛋白能够接触RGS或者能够转导下游信号，而所述嵌合体的Gαi部分能够与GPCR偶联。在再一个具体的实施方案中，所述GPCR是D2R(多巴胺2受体)。
例如，在另一个具体的实施方案中，所述嵌合体蛋白是具有Gαq除最后5个氨基酸外的所有结构基序的融合蛋白，所述Gαq的最后5个氨基酸已被Gαi1的最后5个氨基酸取代。
可以将本发明的嵌合蛋白掺入到药用组合物中并且在体内给予受治疗者，如本文所描述的。所述嵌合蛋白可以用来产生相应的Gα蛋白。例如，通过用目标GPCR结合部位取代天然GPCR结合部位，对嵌合Gα蛋白进行工程改造，以与任何目标GPCR进行偶联。
此外，本发明的嵌合蛋白可以进行工程改造，以用作在受治疗者体内产生抗RGS抗体或抗Gα抗体的免疫原，以纯化RGS结合蛋白或者在筛选测定中鉴定出抑制RGS蛋白与Gα蛋白相互作用的分子。
优选通过标准重组DNA技术，产生本发明的嵌合蛋白或融合蛋白。例如，按照常规技术，例如通过应用平端连接或交错切口末端连接、限制性酶消化以提供合适的末端、适当时补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接和酶促连接，将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起。在另一个实施方案中，可以通过常规技术，包括自动DNA合成仪，合成所述嵌合基因。或者，采用锚定引物，可以通过PCR扩增基因片段。这些锚定引物在两个连续基因片段之间产生随后可以退火并再次扩增的互补突出端，从而产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols In Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley&Sons1992)。此外，许多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体是市售的。可以将RGS或Gα多核苷酸克隆到这样的表达载体中，致使所述融合部分与第二种蛋白或另一种蛋白符合读框地连接。
抗体另一方面，本发明包括特异性抗对应于本发明标记的蛋白的抗体。按照对下述抗体的描述，优选所述抗体是单克隆抗体，最优选所述抗体是人源化抗体。
本发明提供制备分离的杂交瘤的方法，所述杂交瘤产生可用于诊断出患有GPCR相关疾病的病人或动物的抗体。在这种方法中，分离对应于本发明RGS或Gα蛋白的蛋白(例如通过从细胞中纯化，其中采用已知的方法，编码所述蛋白的多核苷酸在体内或体外表达或者转录和翻译)。用分离的蛋白或蛋白片段免疫脊椎动物、优选哺乳动物、例如小鼠、兔子或绵羊。所述脊椎动物可以任选(且优选)用所述分离的蛋白或蛋白片段再免疫至少一次，致使所述脊椎动物表现出针对所述蛋白或蛋白片段的强免疫应答。采用本领域众所周知的各种各样的方法中的任一种方法，从所述经免疫的脊椎动物中分离出脾细胞，然后将其与无限增殖化细胞系融合，以形成杂交瘤。然后采用标准方法，对以这种方式形成的杂交瘤进行筛�。约ǔ鲆恢只蚨嘀植匾煨越岷纤龅鞍谆虻鞍灼蔚目固宓脑咏涣觥１痉⒚饕舶ㄍü庵址椒ㄖ票傅脑咏涣鲆约坝谜庵衷咏涣鲋票傅目固�。
采用多克隆抗体和单克隆抗体制备的标准技术，可以用分离的RGS或Gα蛋白或者它们的部分或片段作为免疫原，来产生结合标记蛋白的抗体。可以使用全长标记蛋白，或者本发明提供这些蛋白的抗原肽片段，以用作免疫原。RGS或Gα蛋白的抗原肽包含表1所示的蛋白的氨基酸序列的至少8个氨基酸残基，并且包括RGS或Gα蛋白的表位，致使针对所述肽产生的抗体与所述蛋白形成特异性免疫复合物。优选所述抗原肽包含至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。
所述抗原肽所包括的优选表位是位于所述蛋白表面的蛋白区，例如亲水区以及具有高抗原性的区。
蛋白性免疫原通常用来制备抗体，即用所述免疫原免疫合适的受试者(例如兔子、山羊、小鼠或其它哺乳动物)。合适的免疫原制剂可以含有例如重组表达的RGS蛋白或者化学合成的RGS多肽。所述制剂还可以包括佐剂例如弗氏完全或不完全佐剂或相似的免疫刺激剂。用免疫原性蛋白制剂免疫合适的受试者，诱导多克隆抗标记蛋白抗体应答。制备、分离和使用抗体的技术是本领域众所周知的。(一般参见D.Lane和E.Harlow，载于AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1990))。
因此，本发明的另一方面涉及与本发明RGS或Gα蛋白反应的单克隆抗体或多克隆抗体。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)片段和F(ab′)2片段，所述片段可以通过用酶例如胃蛋白酶处理所述抗体而产生。本发明提供与RGS蛋白结合的多克隆抗体和单克隆抗体。本发明提供与本发明Gα蛋白(例如Gαi或Gαq)结合的多克隆抗体和单克隆抗体。在本发明的具体实施方案中，本发明的抗体与Gα1、Gα2、Gα3、Gαz、Gαo或Gαq结合。在其它具体的实施方案中，本发明的抗体与RGS2、RGS4或RGSz1结合。本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”包括仅含有能够与特定表位进行免疫反应的抗原结合部位的一个种类的抗体分子群体。因此，单克隆抗体组合物通常对与其免疫反应的特定蛋白表现出一种结合亲和性。
可以如上所述，即用本发明的目标蛋白免疫合适的受试者，制备多克隆抗体。通过标准技术，例如用酶联免疫吸附测定(ELISA)，采用固定化蛋白，可以在规定时间内监测经免疫的受试者的抗体效价。如果需要，可以从所述哺乳动物(例如从其血液中)分离出针对目标蛋白的抗体分子，然后通过众所周知的技术例如A蛋白层析进行进一步纯化，以获得IgG部分。在免疫后的适当时间，例如当抗体效价最高时，可以从所述受试者中获得抗体生产细胞，并通过标准技术，用来制备单克隆抗体，所述标准技术例如最先由Kohler和Milstein(1975)(Nature 256495-497)描述的杂交瘤技术(另见Brown等(1981)J.Immunol.127539-46；Brown等(1980)J.Biol.Chem.2554980-83；Yeh等(1976)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 762927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer 29269-75)、最新的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol Today 472)、EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)或trioma技术。用于生产单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的(一般参见R.H.Kenneth，载于Monoclonal AntibodiesANew Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，NewYork，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefter等(1977)Somatic Cell Genet.3231-36)。简而言之，将无限增殖细胞系(通常是骨髓瘤)与来自用如上所述的蛋白性免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞)融合，对所产生的杂交瘤细胞的培养上清液进行筛�。约ǔ霾岷夏勘甑鞍椎牡タ寺】固宓脑咏涣�。
将淋巴细胞与无限增殖化细胞系进行融合的许多熟知的方法中的任一种方法可以用来产生单克隆抗体(参见例如G.Galfre等(1977)Nature 266SSOS2；Gefter等Somatic Cell Genet.，引用上文；Letter，Yale J.Biol.Med.，引用上文；Kenneth，Monoclonal Antibodies，引用上文)。此外，普通技术人员将会认识到，有许多对这些方法的改变，而且也将是有用的。通常，所述无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系)来源于与所述淋巴细胞相同的哺乳动物种。例如，通过将来自用本发明免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与无限增殖化小鼠细胞系融合，可以制备鼠杂交瘤。优选的无限增殖细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。按照标准技术，可以用许多骨髓瘤细胞系中的任一种作为融合配偶体，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp210-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可得自ATCC。通常，采用聚乙二醇(″PEG″)，使HAT敏感型小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。由所述融合产生的杂交瘤细胞然后用HAT培养基进行选择，HAT培养基将杀死未融合的细胞以及未增殖的融合骨髓瘤细胞(未融合脾细胞在数天后死亡，因为它们未被转化)。通过筛选结合目标蛋白的抗体的杂交瘤培养上清液，例如采用标准ELISA测定，检测产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
另一方面，为了制备分泌单克隆抗体的杂交瘤，通过筛选具有目标蛋白的重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体相展示文库)，从而分离结合目标蛋白的免疫球蛋白文库成员，可以鉴定并分离出单克隆抗体。产生并筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如Pharmacia的Recombinant Phage Antibody System，产品目录号27-9400-01；和Stratagene的SurfZAPTM Phage Display Kit，产品目录号240612)。另外，特别适合用于产生并筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如以下的文献中找到Ladner等的美国专利第5,223,409号；Fuchs等(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod Hybidomas 381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12725-734；和McCafferty等Nature(1990)348552-554。
另外，采用标准重组DNA技术，可以制备的包含人部分和非人部分的重组抗体例如嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体在本发明的范围内。这样的嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术例如采用以下文献中描述的方法来产生Cabilly等的美国专利第4,816,567号；Better等(1988)Science 2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA 843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521 3526；Verhoeyan等(1988)Science 2391534；和Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060。
人源化抗体是人类受治疗者的治疗性治疗特别需要的。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式是含有来自于非人类免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成所述受体互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和性和能力的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基取代，所述非人类物种例如小鼠、大鼠或兔子。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相关的非人类残基所取代。人源化抗体也可以包含既不存在所述受体抗体也不存在于输入CDR或构架序列的残基。一般而言，所述人源化抗体将实质上包含至少一个可变区、通常两个可变区的全部，其中整个或基本上整个CDR区对应于非人类人免疫球蛋白的那些CDR区，以及整个或基本上整个人免疫球蛋白共有序列的恒定区。所述人源化抗体将最好也包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分(Jones等Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 323323-329(1988)；和Presta Curr.Op.Struct.Biol.2594-596(1992))。
这样的人源化抗体可以用转基因小鼠来生产，所述转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链基因和轻链基因、但能够表达人重链基因和轻链基因。所述转基因小鼠用所选抗原(例如对应于本发明标记的整个多肽或其一部分)以正常方式进行免疫。可以采用常规杂交瘤技术获得针对所述抗原的单克隆抗体。所述转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，采用这样的技术，有可能生产治疗上有用的IgG抗体、IgA抗体和IgE抗体。有关这种用于生产人源化抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93。有关这种用于生产人源化抗体和人源化单克隆抗体和的技术以及用于生产这类抗体的方案的详细讨论，参见例如美国专利5,625,126、美国专利5,633,425、美国专利5,569,825、美国专利5,661,016和美国专利5,545,806。另外，可以雇用诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)等公司，采用与上述技术相似的技术，提供针对所选抗原的人源化抗体。
采用称为“指导选择(guided selection)”的技术，可以产生识别所选表位的人源化抗体。在这种方法中，用所选非人类单克隆抗体例如鼠类抗体来指导对识别同一表位的人源化抗体的选择(Jespers等，1994，Bio technology 12899-903)。
市售的抗标记抗体也可以用于本发明的方法中。例如，抗RGS1、抗RGS2抗体、抗RGS3抗体和抗Gα抗体可得自Santa CruzBiotechnology，Inc，Santa Cruz，CA。抗Gα抗体也可得自Calbiochem-Novabiochem Corp。
通过标准技术，例如亲和层析或免疫沉淀，抗标记蛋白抗体可以用来分离本发明的标记蛋白。抗RGS或Gα的抗体可以促进来自细胞的天然蛋白以及在宿主细胞中表达的重组产生的蛋白的纯化。此外，RGS抗体或Gα抗体可以分别用来检测RGS蛋白或Gα蛋白(例如细胞表面的在细胞裂解液或细胞上清液中)，以便评价所述蛋白的丰度和表达模式。这样的抗体可以用来诊断性监测作为临床试验程序一部分的组织中的蛋白质水平，例如以确定给定治疗方案的疗效。通过将所述抗体与可检测物质偶联(即物理连接)，可以有利于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白，而合适放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
重组表达载体和宿主细胞本发明的另一方面涉及含有编码本发明RGS分子或Gα分子的多核苷酸或其一部分的载体、优选表达载体。本文所用的术语“载体”包括多核苷酸即能够转运与其连接的另一多核苷酸的分子。一种载体类型是包括可以连接额外DNA区段的环状双链DNA环的“质粒”。另一载体类型是病毒载体，其中可以将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。将其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这样的载体在本文称之为“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中应用的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明计划包括这类其它形式的表达载体，例如病毒载体宿主细胞(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起同样的作用。
本发明的重组表达载体包含本发明多核苷酸，并且其形式为适合于所述多核苷酸在宿主细胞中的表达，意味着所述重组表达载体包括一种或多种根据表达所用的宿主细胞而选择的调节序列，所述调节序列与待表达的多核苷酸序列有效连接。就重组表达载体而言，“有效连接的”是指目标核苷酸序列以允许所述核苷酸序列表达的方式与调节序列连接(例如在体外转录/翻译系统中或者在宿主细胞中(当将载体导入宿主细胞中时))。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如描述于Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调节序列包括那些指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的序列以及那些指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员将会认识到，表达载体的设计可取决于如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞中，从而产生由本文描述的多核苷酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或融合肽(例如RGS或Gαi或Gαq蛋白、这类蛋白的突变形式、嵌合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可以设计用来在原核细胞或真核细胞中表达蛋白或多核苷酸。在本发明的一个具体的实施方案中，将RGS2、RGS4和RGSz1克隆到真核表达载体pCR31中。例如，目标蛋白可以在细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，这样的蛋白可以例如用作本发明的治疗蛋白。例如，能够结合本发明RGS蛋白(例如RGS2、RGS4或RGSz)并且抑制所述RGS蛋白活性的蛋白可用作本发明的治疗蛋白。合适的宿主细胞在Goeddel，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有进一步讨论。另一方面，所述重组表达载体可以利用例如T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。
最通常是在具有含指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型启动子或诱导型启动子的载体的大肠杆菌中进行蛋白在原核生物中的表达。融合载体将多个氨基酸添加到其编码的蛋白中，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这样的融合载体通常有三个作用1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和3)通过在亲和纯化中起配体的作用而有助于重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白接点处引入蛋白酶解位点，使得重组蛋白能够与融合部分分离，随后纯化所述融合蛋白。这样的酶及其关连识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D，B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白融合。
纯化的融合蛋白可以用于筛选测定(例如下文详细描述的直接测定或竞争性测定)或者用来产生特异性抗RGS或Gα蛋白的抗体。
合适诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Hmann等，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体的靶基因表达依赖于处于杂种trp-lac融合启动子控制之下的宿主RNA聚合酶转录。pET 11d载体的靶基因表达依赖于处于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7gn10-lac融合启动子控制之下的转录。这种病毒聚合酶由来自带有处于lacUV 5启动子转录控制之下的T7 gn1基因的居留原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HSLE174(DE3)提供。
使在大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白酶解重组蛋白能力削弱的宿主细菌中表达所述蛋白(Gottesman，S.GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变待插入到表达载体中的多核苷酸的多核苷酸序列，致使对每种氨基酸的各个密码子是那些优先在大肠杆菌中利用的密码子(Wade等，(1992)Polynucleotides Res.202111-2118)。可以通过标准DNA合成技术，对本发明的多核苷酸序列进行这种改变。
在另一个实施方案中，所述表达载体是酵母表达载体。酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，21987)Gene 54113-123)、pYES2(InVitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ(InVitrogen Corp，SanDiego，CA)。
另一方面，本发明的多核苷酸可以利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白可利用的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在再一个实施方案中，本发明的多核苷酸利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBOJ.6187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。有关原核细胞和真核细胞的其它合适表达系统，参见以下文献的第16章和第17章Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版.Cold Spring Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体的靶基因表达依赖于处于杂种trp-lac融合启动子控制之下的宿主RNA聚合酶转录。pET 11d载体的靶基因表达依赖于处于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7 gn10-lac融合启动子控制之下的转录。这种病毒聚合酶由来自带有处于lacUV 5启动子转录控制之下的T7 gn1基因的居留原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HSLE174(DE3)提供。
在另一个实施方案中，所述重组哺乳动物表达载体能够指导所述多核苷酸优先在特定细胞类型中的表达(例如用组织特异性调节元件表达所述多核苷酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性的；Pinkert等(1987)Genes Dev.1268-277)、淋巴组织样特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)、尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33741-748)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子，Byrne和R.aaddle(1989)Proc.Nall.Acad Sci.USA 865473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230912-916)和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子，美国专利第4,873,316号和欧洲申请公布号264,166)。也包括调节发育的启动子，例如海洋hox启动子(Kessel和Grass(1990)Science 249374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。在本发明的优选实施方案中，所述启动子是神经元特异性启动子。
本发明还提供包含本发明的多核苷酸以反义方向克隆到所述表达载体中的重组表达载体。也就是说，所述DNA分子与调节序列有效连接，其方式以允许对对应于本发明RGS或Gα基因的mRNA为反义的RNA分子表达(通过所述DNA分子的转录)。可以选择与指导所述反义RNA分子在各种各样的细胞类型中连续表达的、以反义方向克隆的多核苷酸有效连接的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导组成型组织特异性表达或细胞类型特异性表达反义RNA的调节序列。所述反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效调节区的控制之下产生反义多核苷酸，其活性可以通过导入载体的细胞类型来测定。有关利用反义基因调节基因表达的讨论，参见Weintraub，H.等，Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis(作为用于基因分析的分子工具的反义RNA)，Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986。
本发明的另一方面涉及导入了本发明多核苷酸分子的宿主细胞，所述多核苷酸分子例如在含有允许其同源重组到所述细胞基因组的特定位点的序列的本发明重组表达载体或多核苷酸分子中编码表1所列举出的蛋白的基因或其同系物。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。人们知道，这些术语不仅指特定题述细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为在连续各代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，这样的后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，本发明的RGS蛋白或Gα蛋白可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。在本发明的某些实施方案中，所述宿主细胞优选为真核细胞，最优选为哺乳动物细胞。
可以通过常规转化或转染技术，将载体DNA导入原核细胞或真核细胞中。本文所用的术语“转化”和“转染”是指各种各样的本领域公知的将外源多核苷酸(例如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DAKD-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。合适的转化或转移宿主细胞的方法可以在以下文献中找到Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)和本领域已知的其它实验手册。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所用的表达载体和转染技术，仅一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定并选择出这些整合体，一般将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目标基因一起导入宿主细胞中。优选的选择标记包括那些赋予药物例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的选择标记。可以将编码选择标记的多核苷酸导入宿主细胞中的与编码本发明RGS或Gα蛋白的载体相同的载体上，或者可以导入不同的载体上。用所导入的多核苷酸稳定转染的细胞可以通过药物选择进行鉴定(例如掺入了所述选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。
培养的本发明宿主细胞例如原核宿主细胞或真核宿主细胞可以用来产生(即表达)本发明的RGS蛋白或Gα蛋白。因此，本发明还提供用本发明的宿主细胞生产蛋白的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将本发明的宿主细胞(即导入了编码标记蛋白的重组表达载体的宿主细胞)在合适的培养基中进行培养，以便产生本发明的RGS蛋白或Gα蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括从所述培养基或宿主细胞中分离出所述蛋白。
检测方法本发明多核苷酸或多肽的相对量的检测和测量可以通过本领域已知的任何方法(参见即Sambrook，Fritsh和Maniatis，MolecularCloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，John Wiley&Sons(1992))。
用于检测已转录多核苷酸的典型方法包括从细胞或组织样品中提取RNA，然后将靶RNA特异性标记探针(即互补多核苷酸分子)与所提取的RNA杂交，最后检测所述探针(即RNA印迹法)。
用于肽检测的典型方法包括从细胞或组织样品中提取蛋白质，然后使靶蛋白特异性抗体与所述蛋白样品结合，最后检测所述抗体(例如蛋白质印迹法或ELISA)。抗体一般通过应用标记的第二抗体进行检测。所述标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶、酶辅因子或配体。这样的方法是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，所述基因(编码RGS蛋白或Gα蛋白)本身(即DNA或cDNA)可以用作GPCR相关疾病的标记。例如，对应于RGS蛋白或Gα蛋白的多核苷酸的增加例如通过该基因的重复也可能与GPCR相关疾病相关，由于这种增加可能与GPCR信号减弱相关。
特定多核苷酸分子的检测也可以通过下述方法进行评价本领域技术人员熟知的许多其它技术中的凝胶电泳、柱层析或直接测序或定量PCR(就多核苷酸分子而论)。
用本领域已知的任何方法，可以对本发明的整个RGS基因或Gα基因或其一部分的存在或拷贝数进行检测。通常，适宜用DNA印迹分析来评价DNA或cDNA的存在和/或含量，其中对来自细胞或组织样品的总DNA进行提�。溆氡昙翘秸�(即互补DNA分子)杂交，然后检测所述探针。所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。其它有用的DNA检测和/或定量方法包括直接测序、凝胶电泳、柱层析和定量PCR，这也是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的RGS或Gα蛋白或多肽可以用作GPCR相关疾病的标记。例如，对应于RGS蛋白的多肽的异常增加可能也与GPCR相关疾病有关。
特定多肽分子的检测也可以通过下述方法进行评价本领域技术人员熟知的许多其它技术中的凝胶电泳、柱层析、蛋白质印迹分析或直接测序。
用于检测RGS蛋白或Gα蛋白的优选试剂是能够结合所述蛋白的抗体，最好是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或者更优选单克隆抗体。可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“标记”，对于探针或抗体而言，意指包括通过使可检测物质与所述探针或抗体进行偶联(即在物理上连接)而直接标记所述探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性而间接标记所述探针或抗体。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体以及用生物素末端标记DNA探针，致使可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测所述DNA探针。术语“生物样品”意指包括从患者中分离的组织、细胞和生物体液以及患者体内存在的组织、细胞和体液。也就是说，本发明的检测方法可以用来检测体外生物样品以及体内生物样品中的mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测标记基因组DNA的体外技术包括DNA印迹杂交。此外，用于检测蛋白的体内技术包括将标记抗体引入患者体内。例如，所述抗体可以用放射性标记进行标记，可以通过标准成象技术检测所述放射性标记在患者体内的存在和位置。
本发明的方法也可以用来检测RGS基因或Gα基因中的基因改变，从而确定具有改变基因的患者是否处于损伤危险之中，所述损伤的特征为标记蛋白活性或多核苷酸表达方面的异常调节。在优选的实施方案中，所述方法包括检测来自所述患者的细胞样品中基因改变的存在与否，所述基因改变的特征为影响编码RGS或Gα的基因的完整性的至少一种改变或者所述基因的异常表达。例如，这样的基因改变可以通过确定下述改变中的至少一种的存在进行检测1)所述基因中缺失了一个或多个核苷酸；2)所述基因中添加了一个或多个核苷酸；3)所述基因中取代了一个或多个核苷酸；4)所述基因的染色体重排；5)所述基因的信使RNA转录物水平发生改变；6)所述基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式；7)所述基因的信使RNA转录物非野生型剪接模式的存在；8)编码蛋白的非野生型水平；9)所述基因的等位基因丧失；和10)编码蛋白的不当翻译后修饰。如本文所述，有各种各样的本领域已知的可以用来检测基因例如本发明的RGS基因或Gα基因中的改变的测定。
在某些实施方案中，所述改变检测包括将探针/引物用于聚合酶链式反应(PCR)(参见例如美国专利4,683,995和美国专利4,683,202)，例如锚定PCR或RACE PCR；或者将探针/引物用于连接链式反应(LCR)(参见例如Landegran等(1988)Science 2411077-1080；和Nakazawa等(1994)Proc.Mail.Acad.Sci.USA 91360-364)，后一方法尤其可用于检测标记-基因中的点突变(参见Abravaya等(1995)Polynucleotides Res.23675-682)。这种方法可包括下述步骤收集来自患者的细胞样品，从所述样品的细胞中分离出多核苷酸(例如基因组、mRNA或它们两者)，使所述多核苷酸样品与一种或多种引物接触，所述引物在使得目标基因(如果存在的话)发生杂交和扩增的条件下与所述目标基因特异性杂交，然后检测扩增产物的存在与否，或者检测扩增产物的大小并将其长度与对照样品进行比较。人们知道，PCR和/或LCR可能最好是用作预先扩增步骤并结合任何用来检测本文描述的突变的技术一起使用。
替代的扩增方法包括自动维持序列扩增(Guatelli，JC.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi，P.M.等(1988)Bio-Technology 61197)或任何其它的多核苷酸扩增方法，然后用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。这些检测方案尤其可用来检测多核苷酸分子(如果这样的分子以极低数目存在的话)。
在一个替代的实施方案中，通过限制性酶切割模式的改变，可以鉴定出样品细胞中基因例如本发明RGS或Gα上的突变。例如，分离样品DNA和对照DNA，进行扩增(任选)，用一种或多种限制性内切核酸酶进行消化，然后通过凝胶电泳测定片段长度大小并进行比较。样品DNA和对照DNA之间片段长度大小的差异说明在样品DNA中存在突变。此外，序列特异性核酶的应用(参见例如美国专利第5,498,531号)可以用来根据核酶切割位点的产生或丧失评价特定突变的存在。
在其它实施方案中，通过将样品多核苷酸和对照多核苷酸例如DNA或RNA与含有数百或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列杂交，可以鉴定出本发明基因中的基因突变(Cronin，M.T.等(1996)HumanMutation 7244-255；Kozal，M.J.等(1996)Nature.Medicine 2753-759)。例如，可以在含有光产生的DNA探针的二维阵列中鉴定出基因突变，如Cronin，M.T.等(参见上文)中所描述的。简而言之，探针的第一个杂交阵列可以用来通过制备序贯重叠探针的线性阵列扫描样品和对照中的DNA长序列段，以鉴定序列间的碱基变化。该步骤使得可以鉴定出点突变。该步骤后接第二杂交阵列，所述杂交阵列使得可以通过用与待检测的所有变异体或突变互补的更小的专用探针阵列，表征特定突变。每个突变阵列由平行探针组组成，一组探针与野生型基因互补，而另一组探针与突变型基因互补。
在再一个实施方案中，本领域已知的各种各样的测序反应中的任一个都可以用来对本发明基因进行直接测序，并且通过将试验样品中所述基因的序列与相应的野生型(对照)序列进行比较来检测突变。测序反应的实例包括那些基于由Maxam和Gilbert((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)开发的技术的测序反应。也考虑了如果进行诊断分析((1995)Biotechniques 19448)，包括通过质谱法进行测序(参见例如PCT国际公布号WO94/116101；Cohen等(1996)Adv.Chromatogr.36127-162；和Griffin等(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38147-159)，则可使用各种各样的自动化测序程序中的任一个。
用于检测本发明基因中突变的其它方法包括这样的方法其中用避免切割剂的保护作用来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基(Myers等(1985)Science 2301242)。一般而言，“错配切割”技术始于通过使含有野生型序列的(标记)RNA或DNA与从组织样品中获得的潜在突变型RNA或DNA杂交而提供异源双链体。用切割双链体中的单链区的试剂处理双链双链体，例如所述单链区由于对照和样品链之间的碱基对错配而存在。例如，RNA/DNA双链体可以用RNA酶处理，而DNA/DNA杂种可以用S1核酸酶处理，以酶促消化错配区。在其它实施方案中，DNA/DNA双链体或RNA/DNA双链体可以用羟胺或四氧化锇处理以及用哌啶处理，以便消化错配区。在消化所述错配区后，所产生的物质然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小进行分离，以测定突变的大小。参见例如Cotton等(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 854397；Saleeba等(1992)MethodsEnzymol.517286-295。在一个优选的实施方案中，可以将用于检测的对照DNA或RNA进行标记。
在又一个实施方案中，在用于检测从细胞样品中获得的cDNA中的点突变并对所述点突变作图的已确定系统中，所述错配切割反应使用一种或多种识别双链DNA中错配碱基对的蛋白(所谓的“DNA错配修复”酶)。例如，大肠杆菌mutY酶在G/A错配处切割A，而HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶在G/T错配处切割T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 151657-1652)。按照一个示例性的实施方案，使基于RGS序列例如野生型RGS序列的探针与来自试验细胞的cDNA产物或其它DNA产物杂交。所述双链体用DNA错配修复酶处理，并且切割产物(如果有的话)可以用电泳等方法进行检测。参见例如美国专利第5,459,039号。
在其它实施方案中，电泳迁移率的改变将用来鉴定本发明基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可以用来检测突变型多核苷酸和野生型多核苷酸之间电泳迁移率的差异(Orita等(1989)ProcNatl.Acad.Sci.USA862766，另见Cotton(1993)Mutat.Res.285125-144；和Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech Appl.973-79)。样品多核苷酸和对照多核苷酸的单链DNA片段将会变性并再让其复性。单链多核苷酸的二级结构随序列而变化，所产生的电泳迁移率的改变使得可以检测出甚至一个单碱基的变化。可以标记所述DNA片段，或者用标记探针进行检测。通过使用RNA(而不是DNA)可以增加所述测定的灵敏度，其中二级结构对序列变化更敏感。在一个优选的实施方案中，所述方法应用异源双链体分析来根据电泳迁移率的变化分离双链异源双链体分子(Keen等(1991)Trends Genet 75)。
在再一个实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Myers等(1985)Nature 313495)，分析在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中突变型片段或野生型片段的移动。当用DGGE作为分析方法时，对DNA进行修饰，以确保其不完全变性，例如通过PCR加入高度解链富含GC的DNA中约40的GC封条。在再一个实施方案中，用温度梯度代替变性梯度，以鉴定对照DNA和样品DNA的迁移率的差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
用于检测点突变的其它技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知突变置于中心，然后在仅只有在存在完全匹配的情况下允许杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等(1986)Nature 324163)；Saiki等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 866230)。当这样的等位基因特异性寡核苷酸与杂交膜结合并且与标记靶DNA杂交时，所述寡核苷酸与通过PCR扩增的靶DNA或各种不同的突变杂交。
另一方面，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与本发明结合使用。用作特异性扩增引物的寡核苷酸可以在所述分子的中心携带目标突变(以便扩增取决于差别杂交)(Gibbs等(1989)Polynucleotides Res.172437-2448)或在一种引物最后的3′末端，这样，在合适的条件下，可以防止错配，或者减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11238)。另外，人们可能希望在所述突变区中引入一个新的限制性位点，以产生基于切割的检测(Gasparini等(1992)Mol.Cell Probes 61)。在某些实施方案中，也可以用供扩增用的Taq连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。在这些情况下，仅仅当在5′序列的3′末端上有完好匹配的情况下才发生连接，使得有可能通过查看扩增的存在与否，检测特定位点上已知突变的存在。
筛选本发明也提供用于鉴定调节剂即候选物或试验化合物或药物的方法(在本文也称为“筛选测定”)，所述调节剂包含治疗部分(例如肽、肽模拟物、类肽物(peptoids)、多核苷酸、小分子或其它药物)，所述治疗部分(a)结合RGS，或(b)对标记活性有抑制效应，或者更准确地讲，(c)对RGS与其一个或多个天然底物(例如Gαi或Gαq)的相互作用有调节作用，或(d)对RGS的表达有抑制效应。这样的测定通常包括RGS与一种或多种测定组分之间的反应。其它组分可以是所述试验化合物本身，或者是试验化合物和所述RGS结合配偶体的组合。
本发明的试验化合物一般是小分子或生物活性剂。在一个优选的实施方案中，所述试验化合物是一种小分子。在另一个优选的实施方案中，所述试验化合物是一种生物活性剂。生物活性剂包括但不限于在哺乳动物体内具有生物活性的天然存在的或合成的化合物或分子(“生物分子”)以及蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸和多核苷酸。所述生物活性剂最好是蛋白质、多核苷酸或生物分子。本领域技术人员将会认识到，所述试验化合物的性质可以根据由本发明RGS编码的蛋白的性质而变化。本发明的试验化合物可以从包括天然和/或合成化合物的系统文库的任何可利用的来源获得。
用于筛选蛋白抑制剂或激活剂的方法和组合物是本领域已知的(参见美国专利4,980,281、美国专利5,266,464、美国专利5,688,635和美国专利5,877,007，所述专利通过引用结合到本文中)，并且可以结合本发明方法一起使用。
筛选GPCR相关疾病的抑制剂本发明提供就GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法，以及包含能够抑制RGS分子的试验化合物的药用组合物。一种筛选方法包括从诊断出患有或者怀疑患有GPCR相关疾病的受治疗者中获得样品，使每种独立的等份样品与多种试验化合物的其中一种接触，然后将每种等份样品中一种或多种RGS蛋白和Gα蛋白的表达进行比较，以确定任一所述试验化合物提供相对于含有其它试验化合物的样品或者相对于未处理样品或对照样品，RGS蛋白的表达水平或活性是否显著降低。另外，可以设计筛选方法，即将试验化合物与蛋白混合，从而测定所述试验化合物对所述蛋白的影响。
另外，本发明还涉及筛选能够抑制RGS蛋白和Gα蛋白的结合的试验化合物的方法，即将试验化合物、RGS蛋白和Gα蛋白混合在一起，然后测定在所述试验化合物存在下是否发生所述RGS蛋白和Gα蛋白的结合。所述试验化合物可以是小分子，或者是生物活性剂。如下文所讨论的，可以由各种各样的本领域熟知的文库提供各种试验化合物。
在一个具体的实施方案中，所述筛选测定包括检测试验化合物抑制RGS蛋白与Gα蛋白结合的能力。这样的化合物可以提供可用于治疗GPCR相关疾病的本发明治疗药物。
RGS表达、活性或结合能力的抑制剂可用作本发明的治疗组合物。如下文所讨论的，这样的抑制剂可以配制为药用组合物。这样的抑制剂也可以用于本发明的方法中，例如用来诊断、治疗或预后GPCR相关疾病。
本发明的一个实施方案提供一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法。所述方法包括在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触；检测所述报道基因的表达；然后将所述报道基因在接触所述试验化合物的试验细胞中的表达与在不存在所述试化合物的情况下所述报道基因在接触所述激动剂的试验细胞中的表达进行比较，其中相对于所述报道基因在接触所述激动剂的试验细胞中的表达，所述报道基因在接触所述试验化合物和激动剂的试验细胞中的表达水平显著增加，说明所述试验化合物有效抑所述制患者的GPCR相关疾病。在该实施方案中，所述试验细胞包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够减弱GPCR信号至少50％的水平表达。
在另一个实施方案中，本发明提供一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法。所述方法包括下述步骤获得来自患者的细胞样品；使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；检测每种所述等份样品中RGS蛋白和Gα蛋白的表达水平；然后选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法。所述方法包括下述步骤获得来自患者的细胞样品；使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；检测每种所述等份样品中RGS蛋白和Gα蛋白的活性；然后选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的活性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种筛选能够干扰RGS蛋白和Gα的结合的试验化合物的方法。所述方法包括将RGS蛋白、试验化合物和Gα混合；测定所述RGS蛋白和所述Gα的结合；然后找出所述试验化合物与干扰结合的能力之间的联系，其中与不存在所述试验化合物相比，在所述试验化合物存在下，所述RGS蛋白和所述Gα的结合减少说明所述试验化合物能够抑制结合。
高通量筛选测定本发明提供进行高通量筛选能够抑制本发明RGS蛋白的活性或表达的试验化合物的方法。在一个实施方案中，所述高通量筛选方法包括在Gα蛋白存在下，将试验化合物和RGS蛋白混合，然后检测所述试验化合物对所述RGS蛋白的影响。
在一个实施方案中，本发明提供一种高通量筛选能够抑制RGS蛋白的试验化合物的方法。所述方法包括a)在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触，其中所述试验细胞包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达；b)检测所述报道基因在接触试验化合物相对于接触其它试验化合物的试验细胞中的表达；和c)找出所述报道基因表达水平的量与所述试验化合物抑制RGS的能力之间的联系，其中所述报道基因的表达增加说明所述试验化合物能够抑制所述RGS蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供一种高通量筛选能够抑制患者的GPCR相关疾病的试验化合物的方法。所述方法包括下述步骤a)将RGS蛋白、Gα和试验化合物混合；b)检测所述RGS蛋白和Gα在试验化合物存在下的结合；和c)找出RGS和Gα之间结合被抑制的量与所述试验化合物抑制所述GPCR相关疾病的能力之间的联系，其中所述RGS蛋白和Gα的结合被抑制说明所述试验化合物能够抑制所述GPCR相关疾病。
功能测定例如细胞传感器微生理仪(cytosensormicrophysiometer)、钙通量测定例如FLIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)或TUNEL测定都可用来测量细胞活性，如下文所讨论的。
可以联合使用各种各样的本领域众所周知的高通量功能测定来筛选和/或研究不同类型的激活试验化合物的反应性，但是由于所述偶联系统常常难以预测，因此考虑可能需要各种各样的测定来检测各种各样的偶联机制。各种各样的基于荧光的技术是本领域众所周知的，并且能够对活性进行高通量和超高通量筛�。ǖ幌抻贐RET或FRET(两者均得自Packard Instrument Co.，Meriden，CT)。一种优选的高通量筛选测定由BIACORE系统提供，该系统用无标记表面胞质团共振技术来检测各种各样的生物活性剂之间的结合，如在下文更进一步描述的。高灵敏度地筛选大量不同试验化合物的能力允许分析潜在的RGS抑制剂以及GPCR相关疾病的抑制剂。所述BIACORE系统也可以用来检测试验化合物与不同组分例如RGS的结合。
最新的进展提供了许多检测生物活性剂之间的结合活性的方法。高通量筛选的普通方法包括基于荧光的技术的应用，所述技术包括但不限于BRET或FRET(两者均得自Packard Instrument Co.，Meriden，CT)，该技术测量由邻近的结合荧光团提供的检测信号。通过将试验化合物与本发明的RGS蛋白和/或Gα蛋白混合，然后测定它们之间的结合活性，可以进行诊断分析。应用细胞传感器微生理仪的普通测定也可以用来测量代谢激活，同时通过应用基于荧光的技术例如FLIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)，可以检测钙代谢的变化。另外，通过TUNEL测定可以测定凋亡细胞的存在，该测定应用流式细胞术来检测在细胞凋亡期间由基因组DNA的切割产生的游离3-OH末端。如上所述，可以联合使用各种各样的本领域已知的功能测定来筛选和/或研究不同类型的激活试验化合物的反应性。优选本发明的高通量筛选测定使用由BIACORE系统(BiacoreInternational AB，Uppsala，瑞典)提供的无标记胞质团共振技术。当表面胞质团波在金属/液体界面被激发时，发生无胞质团共振。通过反射来自表面由于接触样品产生的光，表面胞质团共振引起表面层折射率的变化。针对表面层质量浓度的给定变化的折射率变化对许多生物活性剂(包括蛋白质、肽、脂质和多核苷酸)是相似的，并且由于BIACORE传感器表面可以被官能化而结合各种各样的这些生物活性剂，因此可以考虑了对试验化合物广泛选择的检测。
因此，在某些实施方案中，本发明提供高通量筛选能够抑制表1所列举的RGS蛋白活性的试验化合物，即在高通量测定例如BIACORE中或者在基于荧光的测定例如BRET中，将所述试验化合物和所述蛋白混合。
在一个具体的实施方案中，所述高通量筛选测定检测多种试验化合物结合RGS蛋白的能力。在另一个具体的实施方案中，所述高通量筛选测定检测多种试验化合物抑制RGS结合配偶体(例如Gα蛋白)结合RGS蛋白的能力。在再一个具体的实施方案中，所述高通量筛选测定检测多种试验化合物调节通过GPCR的信号的能力。
预测医学(PREDICTIVE MEDICINE)本发明涉及预测医学领域，其中诊断分析、预后分析、药物遗传学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本发明的一方面涉及用于测定生物样品(例如血液、血清、脑脊髓液、细胞、组织)中的标记多核苷酸和/或多肽表达和/或活性的诊断分析，从而确定个体是否处于发生与GPCR信号减弱相关的GPCR相关疾病的危险之中。本发明也提供用于确定个体是否处于发生与RGS或Gα蛋白或多核苷酸表达或活性增加相关的GPCR相关疾病的危险之中的预后(或预测)分析。
例如，可以测定生物样品中RGS基因或Gα基因的拷贝数。这样的测定可以用于预后或预测目的，从而在发生GPCR相关疾病之前对个体进行预防性治疗，所述GPCR相关疾病的特征在于RGS蛋白、多核苷酸表达或活性增加或者与其相关。
本发明的另一方面涉及监测在临床试验中因子(例如药物、化合物)对标记的表达或活性的影响。
诊断分析用于检测生物样品中本发明的RGS或Gα蛋白或多核苷酸的存在与否的一个示例性的方法包括获得来自试验患者的生物样品并且使所述生物样品与能够检测所述RGS或Gα蛋白或多核苷酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，致使检测出所述生物样品中存在所述蛋白或多核苷酸。用于检测对应于本发明多核苷酸的mRNA或基因组DNA的一种优选试剂是一种能够与本发明mRNA或基因组DNA杂交的标记多核苷酸探针。可供本发明诊断分析用的合适探针在本文中有描述。用于检测本发明标记蛋白的一种优选试剂是一种特异性识别所述蛋白的抗体。
所述诊断分析也可以用来定量测定生物样品中标记的表达量或活性。这样的定量测定可用来例如测定GPCR相关疾病的进程或严重程度。这样的定量测定也可用来例如测定GPCR相关疾病在治疗后的严重程度。
确定GPCR相关疾病的严重程度在诊断分析领域中，本发明也提供用于确定GPCR相关疾病的严重程度的方法，即分离来自患者的样品(例如含有表达GPCR的细胞的血液样品)，检测在所述样品中相对于在来自正常样品或对照样品的第二种样品中一种或多种本发明RGS分子或Gα分子的存在、含量和/或活性。在一个实施方案中，将这两种样品中RGS蛋白的水平进行比较，与正常样品相比，在所述试验样品中增加指示GPCR相关疾病。在其它的实施方案中，2种、3种、4种或更多种RGS蛋白受到调节指示严重GPCR相关疾病。
在一个实施方案中，本发明提供一种确定患者的GPCR相关疾病的严重程度的方法，即将以下的a)和b)进行比较a)在来自所述患者的样品中RGS蛋白的表达水平；和b)在对照样品中RGS蛋白的正常表达水平，其中相对于正常水平，RGS蛋白在来自所述患者的样品中的表达水平异常，说明所述患者罹患严重GPCR相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供一种评价用于抑制患者的GPCR相关疾病的疗法的功效的方法，即将以下的a)和b)进行比较a)RGS蛋白在从在给患者提供所述疗法的至少一部分之前的所述患者中获得的第一种样品中的表达，和b)RGS蛋白在提供所述疗法的所述部分之后的第二种样品中的表达，其中相对于所述第一种样品，所述RGS蛋白在所述第二种样品的表达水平显著受到调节，说明所述疗法有效抑制所述患者的GPCR相关疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断GPCR相关疾病的方法，即a)获得来自患者的包含细胞的样品；b)测定在所述样品中RGS和Gα的表达；c)找出RGS和Gα的量与存在GPCR相关疾病之间的联系，其中与对照样品相比，RGS和Gα水平显著增加说明存在GPCR相关疾病。
在一个实施方案中，所述生物样品含有来自所述试验患者的蛋白质分子。另一方面，所述生物样品可以含有来自所述试验患者的mRNA分子或者来自所述试验患者的基因组DNA分子。一种优选的生物样品是通过常规方法从患者中分离的白细胞。
在另一个实施方案中，所述方法还包括获得来自患者的对照生物样品，使所述对照样品与能够检测RGS蛋白或Gα蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，致使检测到所述生物样品中存在RGS蛋白或Gα蛋白、mRNA或基因组DNA，然后将其与所述对照样品中存在的相同蛋白、mRNA或基因组DNA进行比较。
预后分析此外，本文描述的诊断方法可以用来鉴定患有与GPRC-信号减弱相关的GPCR相关疾病或处于发生所述疾病危险之中的患者。在本发明的一个实施方案中，正如与GPCR相关疾病相关，RGS蛋白标记的表达或活性增加通常与GPCR相关疾病有关。
本文描述的测定例如前述或下述的测定，可以用来鉴定患有与RGS活性或表达水平增加相关的GPCR相关疾病的患者。另一方面，所述预后分析可以用来鉴定处于发生与RGS蛋白活性或多核苷酸表达水平增加相关的GPCR相关疾病的危险之中的患者。因此，本发明提供一种用于鉴定与RGS表达或活性增加相关的GPCR相关疾病的方法，其中从患者中获得试验样品，然后检测RGS蛋白或多核苷酸(例如mRNA或基因组DNA)，其中存在RGS蛋白或多核苷酸增加说明可诊断或预后患有GPCR相关疾病或处于发生所述疾病危险之中的患者。
此外，本文描述的预后分析可以用来确定是否可以将一种治疗或预防GPCR相关疾病的药物(例如肽模拟物、蛋白质、肽、多核苷酸、小分子或其它药物候选物)给予患者。例如，这样的方法可以用来确定是否可以用一种抑制GPCR相关疾病的药物对患者进行有效治疗。因此，本发明提供用于确定是否可以用一种针对与GPCR信号减弱相关的疾病的药物对患者进行有效治疗的方法，其中获得试验样品，然后检测RGS和Gα蛋白或多核苷酸表达或活性(例如其中蛋白或多核苷酸表达或活性的高丰度说明可以诊断出给予所述药物的患者，以治疗与GPCR信号减弱相关的损伤)。
本发明的一个实施方案提供一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法，即将以下的a)和b)进行比较a)RGS蛋白在Gα存在下在第一种细胞样品中的表达，其中使所述第一种细胞样品接触所述试验化合物，和b)RGS蛋白在Gα存在下在第二种细胞样品中的表达，其中使所述第二种细胞样品不接触所述试验化合物，并且其中相对于所述第二种样品，所述RGS蛋白在所述第一种样品中的表达水平显著降低，说明所述试验化合物有效抑制所述患者的所述GPCR相关疾病。
关于GPCR相关疾病领域，可以设计预后分析以确定经历治疗这种疾病的患者是否有长期存活或疾病进程的表现差。在一个优选的实施方案中，可以在诊断后立即(即在几天内)确定预后。通过建立GPCR相关疾病的不同期的表达分布型，从发作至急性疾�。泶锬Ｊ娇梢韵韵痔囟ū泶锓植夹陀朐ず蟛羁赡苄栽黾又涞牧�。然后可以用所述预后来设计更具攻击性的治疗程序，以避免慢性GPCR相关疾病并且增加长期存活和康复的可能性。
可以例如通过利用预包装诊断试剂盒实施本文描述的方法，所述试剂盒包含本文描述的至少一种探针多核苷酸或抗体试剂，而且可以方便使用，例如，在临床上诊断表现出涉及RGS基因或Gα基因的疾病或疾患的症状或家族史的患者。在本发明的一个具体实施方案中，检测RGS多核苷酸或RGS多肽中的突变。在一个更具体的实施方案中，这样的RGS突变与患者对GPCR相关疾病的预后或敏感性相关，所述GPCR相关疾病例如精神分裂症、双相性精神障碍、焦虑症、抑郁症、心肌肥大、高血压、血栓形成、心律失常、炎症、妥协性免疫应答等等。
此外，其中表达RGS或Gα的任何细胞类型或组织都可以用于本文描述的预后或诊断分析中。
监测临床试验期间的作用监测试剂(例如药物、小分子、蛋白质、核苷酸)对RGS蛋白或Gα蛋白的表达或活性的影响(例如涉及GPCR相关疾病的RGS蛋白的调节)不仅可用于基础药物筛�。铱捎糜诹俅彩匝椤＠纾诹俅彩匝橹校梢约嗖馔ü绫疚拿枋龅纳秆〔舛ㄈ范ǖ囊┪镌诮档蚏GS基因表达、蛋白质水平或负调节活性方面的有效性。在这样的临床试验中，RGS基因的表达或活性且最好是已经涉及例如RGS相关损伤(例如由GPCR相关疾病引起的)的其它基因的表达或活性可以用作特定细胞表型的“读出(read out)”。
例如，但并不作为限制，可以鉴定出用调节RGS活性的RGS抑制剂(例如在本文描述的筛选测定中鉴定出的)处理的细胞中受到调节的基因。因此，为了研究RGS抑制剂对GPCR信号的作用，可以分离出细胞并分析RGS和涉及GPCR信号途径的其它基因的表达水平。可以通过以下方法定量测定基因表达水平(例如基因表达模式)本文描述的RNA印迹分析或RT-PCR，或者，测量所产生的蛋白量，本文描述的方法的其中一种，或者测量标记或其它基因的活性水平。这样，GPCR信号途径的基因表达模式可以用作读出，即说明所述细胞对所述药物的生理反应。因此，该反应状态可以在所述个体用所述药物治疗之前、和不同时间点、期间进行测定。
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于监测用药物(例如通过本文描述的筛选测定鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、多核苷酸、小分子或其它药物候选物)治疗患者的有效性的方法，所述方法包括下述步骤(i)获得患者在给予所述药物之前的给药前样品；(ii)检测RGS蛋白和Gα蛋白、mRNA或基因组DNA在所述给药前样品中的表达水平；(iii)获得一种或多种来自所述患者的给药后样品；(iv)检测RGS蛋白和Gα蛋白、mRNA或基因组DNA在所述给药后样品中的表达水平或活性；(v)将在所述给药前样品中所述蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性与在一种或多种所述给药后样品中标记蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性进行比较，和(vi)相应地改变将所述药物给予所述患者。例如，为了降低RGS的表达或活性，可能最好是增加给予所述药物。按照这样的实施方案，可以用RGS表达或活性作为药物有效性的指标，甚至在不存在可观察到的表型反应的情况下也是如此。
预防方法一方面，本发明提供一种用于预防患者的与RGS表达或活性增加相关的GPCR相关疾病的方法，即给予所述患者一种抑制RGS蛋白表达或活性的药物。
通过例如本文描述的任一种诊断或预后分析或者它们的组合，可以鉴定出处于引起或导致RGS表达或活性异常的疾病危险之中的患者。
可以在表现所述GPCR相关疾病特征性症状之前给予预防药，从而预防所述GPCR相关疾病或者延迟其进程。可以根据本文描述的筛选测定来确定合适的药物。
另一方面，本发明提供一种用于预防患者的GPCR相关疾病的方法，即给予所述患者一种抑制RGS蛋白表达或活性的药物。本领域技术人员将会认识到，关于用于治疗或预防GPCR相关疾病的实施方案，治疗或预防方法一般力图抑制RGS蛋白的表达或活性。因此，可以给予RGS蛋白的拮抗剂，以达到这样的结果。根据本文描述的筛选测定，可以确定供这种应用用的合适药物。
治疗方法本发明的另一方面涉及抑制RGS蛋白表达或活性、用于治疗目的的方法。因此，在一个示例性的实施方案中，本发明的抑制方法包括使细胞与调节与所述细胞相关的RGS蛋白活性的一种或多种所述活性的药物接触。调节RGS蛋白活性的药物可以是本文描述的药物，例如多核苷酸或蛋白、所述蛋白的天然存在的靶分子(例如RGS蛋白底物)、抗体、抑制剂、RGS蛋白拮抗剂的肽模拟物或其它小分子。
在一个实施方案中，所述药物抑制一种或多种RGS蛋白活性。这样的抑制剂的实例包括反义RGS核酸分子、抗RGS蛋白抗体和RGS蛋白抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述药物的抑制剂是反义RGS多核苷酸或RGS核酶。
在本发明的另一个实施方案中，所述RGS在活性或表达水平方面在诊断出患有或怀疑患有RGS相关疾病的患者中异常增加，或者最好是Gα正常表达水平降低。在该实施方案中，对这种患者的治疗可包括给予一种RGS抑制剂，其中这样的抑制剂提供Gα活性或表达降低。
这些调节方法可以在体外进行(例如通过将所述细胞与所述药物一起进行培养)或者在体内进行(例如通过将所述药物给予患者)。因此，本发明提供治疗诊断出患有特征为一种或多种RGS和Gα蛋白或多核苷酸分子的表达或活性异常的GPCR相关疾病或者处于所述疾病危险之中的个体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给予一种抑制RGS蛋白表达或活性的药物(通过本文描述的筛选测定鉴定的药物)或药物的组合。
本发明还提供调节本发明RGS蛋白表达水平的方法，所述方法包括给予患有GPCR相关疾病的患者多种包括反义寡核苷酸或核酶在内的组合物。所述组合物可以在包含编码所述寡核苷酸或核酶的多核苷酸的载体中提供。另一方面，本发明标记的表达水平可以通过给予一种抗体、多种抗体或者与治疗部分缀合的抗体进行调节。用所述抗体进行治疗可以进一步定位于包括所述GPCR相关疾病的组织。
本发明的一个实施方案提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，即给予一种包括以下组分的组合物a)一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂；b)一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂；和c)药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法。所述方法包括给予一种包括以下组分的组合物a)一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸；b)一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸；和c)药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，即给予一种包括以下组分的组合物a)一种能够结合RGS多核苷酸的核酶；b)一种能够结合Gα多核苷酸的核酶；和c)药学上可接受的载体。
测定试验化合物或疗法的功效本发明也提供评价试验化合物或疗法抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法。这些方法包括从患有GPCR相关疾病的、正在接受治疗或疗法的患者中分离样品，然后检测本发明的一种或多种标记在所述第一种样品中相对于在第二种样品中的存在、含量和/或活性。在给予试验化合物的情况下，所述第一种和第二种样品最好是取自所述患者的一种样品的亚部分(sub-porition)，其中使所述第一部分暴露于所述试验化合物，而使所述第二部分不暴露于所述试验化合物。在该实施方案的一个方面，所述RGS在所述第一种样品中相对在所述第二种样品中以显著增加的水平表达。最优选在所述第一种样品中的表达水平大约是(即低于正常样品的标准差)在取自正常组织的对照样品的第三种对照样品中的表达水平。在某些实施方案中，所述正常样品来源于基本上没有GPCR相关疾病的组织。
在正准备评价疗法功效的情况下，从所述患者获得的第一种样品最好在提供所述疗法的至少一部分之前获得，而所述第二种样品在提供所述疗法的所述部分之后获得。最好将所述RGS在所述样品中的水平与第三种对照样品进行比较，然后找出与所述GPCR相关疾病的存在、存在危险或严重程度之间的联系。最优选RGS在所述第二种样品中的水平大约是第三种对照样品的表达水平。在本发明中，RGS表达水平显著降低说明所述疗法有效治疗与信号被抑制相关的GPCR相关疾病。
药物基因组学(PHARMACOGENOMICS)可以将本发明的蛋白和多核苷酸分子以及通过本文描述的筛选测定鉴定的对RGS蛋白有抑制效应的抑制剂或药物给予个体，以(预防性或治疗性)治疗GPCR相关疾病。
结合这样的(预防性或治疗性)治疗，可考虑药物基因组学。本文所用的“药物基因组学”包括将基因组学技术例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析对用于临床开发和市场上的药物。更准确地讲，所述术语是指研究患者的基因如何决定他或她对药物的反应(例如患者“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。治疗药物的代谢不同可以导致严重毒性或治疗失败，即改变药理活性药物的剂量和血液浓度之间的关系。因此，主治医师或临床医师可考虑应用相关药物基因组学研究中获得的知识来确定是否给予一种药物以及定制所述治疗的剂量和/或治疗方案。
药物基因组学涉及对药物反应时由于受影响病人中的药物处置和异常作用改变所致的临床显著性遗传变异。参见例如Eichelbaum，M.等(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)983-985和Linden，M.W.等(1997)Clin.Chem.43(2)254-266。一般而言，可以区分两种类型的药物遗传学病症。遗传病症作为单因素传递，改变了药物对机体的作用方式(药物作用改变)；或者遗传病症作为单因素传递，改变了机体对药物的作用方式(药物代谢改变)。这些药物遗传学病症可以或者作为罕见的遗传缺陷发生或者作为天然存在的多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷(G6PD)是常见的遗传性酶病，其中主要临床并发症是在摄入氧化剂药物(抗疟疾药、磺胺类药、镇痛药、硝基呋喃类药)和消耗蚕豆后的溶血作用。
一种鉴定预测药物反应的基因的药物基因组学方法，称之为“genome-wide association(泛基因组关联)”，主要依赖于由已知的基因相关位点组成的人类基因组的高分辨图谱，(例如“双等位”基因标记图谱，它在人类基因组上有60,000-100,000个多态位点或可变位点，每个基因位点都有两种变异体)。可以将这样的高分辨基因图谱与每种统计学显著数目的参与II期/III期试验的研究对象的基因组图谱进行比较，以鉴定与具体观察到的药物反应或副作用相关的基因。另一方面，可以从人类基因组中某些数千万已知单核苷酸多态性(SNP)的组合产生这样的高分辨图谱。本文所用的“SNP”是在DNA序列段中单个核苷酸碱基中发生的常见改变。例如，SNP可以是DNA每1000个碱基中发生1次。SNP可能涉及疾病过程，然而，绝大多数可能不是疾病相关性的。如果基于发生这些SNP的基因图谱，则个体可以根据其个体基因组中特定模式的SNP按组进行遗传分类。以这样的方式，考虑到在这种遗传上相似的个体中可能是普遍的性状，可以为遗传上相似的个体组定制治疗方案。
另一方面，称为“候选基因方法”的方法可以用来鉴定预测药物反应的基因。按照该方法，如果编码药物靶的基因是已知的(例如本发明的标记蛋白)，则该基因的所有常见的变异体在人群中可能是非常容易鉴定的，并且可以确定是否具有该基因的一种形式与另一种形式与特定药物反应相关。
另一方面，称为“基因表达分布型法”的方法可以用来鉴定预测药物反应的基因。例如，给予药物(例如本发明的RGS分子)的动物的基因表达可以表示与毒性相关的基因途径是否与已被启动。
从不止一种上述药物基因组学方法获得的信息可以用来确定用于预防性或治疗性治疗个体的合适剂量和治疗方案。这一认识，当用于给药或药物选择时，可以避免不利的反应或者治疗失败，因而当用RGS抑制剂例如本文描述的示例性筛选测定之一治疗患者时，提高了疗效或预防效率。
药用组合物本发明还涉及可以如本文描述的方法进行配制的药用组合物。这些组合物可以包括RGS抑制剂、特异性结合本发明标记蛋白的抗体和/或与本发明RGS或Gα多核苷酸互补的反义多核苷酸分子，并且所述组合物可以用本文描述的方法进行配制。
本文所用的用语“药学上可接受的载体”意指包括任何和所有与药物给药相容的溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控释溶媒、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。对于药用活性物质，这类介质和试剂的应用是本领域众所周知的。参见例如A.H.Kibbe，Handbook of PharmaceuticalExcipients，第三版，Pharmaceutical Press，London，UK(2000)。除迄今为止作为任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，考虑了它们在所述组合物中的应用。在所述组合物中也可以掺入增补剂。
本发明包括用于制备调节对应于本发明RGS或Gα的多肽或多核苷酸表达或活性的药用组合物的方法。这样的方法包括将药学上可接受的载体与一种调节对应于本发明分子的多肽或多核苷酸表达或活性的药物配制在一起。这样的组合物还可以包括额外的活性剂。因此，本发明还包括用于制备药用组合物的方法，即将药学上可接受的载体与一种调节对应于本发明RGS的多肽或多核苷酸表达或活性的药物以及一种或多种额外的生物活性剂配制在一起。
本发明的一个实施方案提供一种能够抑制患者的GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂、一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸、一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的一种能够结合RGS多核苷酸的核酶、一种能够结合Gα多核苷酸的核酶和药学上可接受的载体。
将本发明的药用组合物配制成适合它的计划给药途径。给药途径的实例包括胃肠外给药(例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药)、经口给药(例如吸入给药)、透皮给药(局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。对于胃肠外、皮内或皮下应用所用的溶液剂或混悬剂可以包括以下组分无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠进行调节。可以将胃肠外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶中。
适合用于注射的药用组合物包括无菌水溶液(就水溶性而论)或者用于临时制备无菌注射液或分散剂的分散剂和无菌粉针剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)，在所有情况下，注射用组合物应该是无菌的并且应该是易于注射的液体。所述组合物在生产和储藏条件下必须是稳定的并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。earner可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及它们的合适混合物。可以例如通过利用包衣剂例如卵磷脂，就分散剂而论，通过保持所需粒度以及通过利用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，在所述组合物中最好是包括等渗剂例如糖类、多羟基醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以使所述注射用组合物的吸收延长。
通过将所述活性化合物(例如标记蛋白片段或抗标记蛋白抗体)以所需量掺入到具有一种以上列举的组分或以上列举的组分的组合的合适溶剂中，必要时接着进行过滤除菌，可以制备无菌注射液。一般而言，通过将所述活性化合物掺入到含有基本分散介质和所需其它来自以上列举的组分的无菌溶媒中，制备分散剂。就用于制备无菌注射液的无菌粉针剂而论，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到所述有效成分加上它们的任何额外所需来自先前过滤除菌溶液的组分的粉针剂。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将其装入明胶胶囊剂中或者压成片剂。为了经口治疗性给药，所述活性化合物可以与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂使用。口服组合物也可采用可用作漱口剂的液体载体来制备，其中所述液体载体中的所述化合物经口给予，漱口后吐出或者吞下。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任一下述组分或相似性质的化合物粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、崩解剂例如藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterte；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙皮矫味剂。
对于吸入给药，用装有合适抛射剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气雾剂喷雾形式给予所述化合物系统给药也可以是通过经粘膜或透皮方式。对于经粘膜给药或透皮给药，在所述制剂中使用适合穿过屏障的渗透剂。一般而言，这样的渗透剂是本领域已知的，并且对于经粘膜给药，包括例如去垢剂、胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过应用鼻喷雾剂或栓剂完成经粘膜给药。对于透皮给药，将所述生物活性化合物配制成本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
所述化合物也可以制备成栓剂形式(例如用常规栓剂基质例如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠给药的直肠灌肠剂。
在一个实施方案中，可含有生物活性化合物的治疗部分用保护所述化合物抵抗从机体快速消除的载体制备，例如控释制剂，包括植入片和微囊化传递系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对于本领域技术人员将会是显而易见的。所述材料也可以在市场上从例如Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.获得。脂质体混悬剂(包括用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以按照本领域技术人员已知的方法，例如在美国专利第4,522,811号中描述的方法，制备这些制剂。
尤其有利的是配制易于给药和剂量均匀性的剂量单位形式的口服或胃肠外组合物。本文所用的剂量单位形式包括适合作为待治疗患者的单元剂量的物理上分离的单位；计算每个单位含有预定量的活性化合物并结合所需的药用载体产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的技术标准取决于和直接取决于所述活性化合物的独特特征以及待达到的特定疗效和用于治疗个体的这种活性化合物的所属领域的固有限制。
通过标准制药程序，在细胞培养物或实验动物中，例如用于测定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％有疗效的剂量)，可以确定这类化合物的毒性和疗效。毒性和疗效间的剂量比为治疗指数，并且可以以LD50/ED50之比表示。优选显示大治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应该小心地设计将这类化合物靶向受影响组织的部位的递药系统，以便使对未感染细胞的潜在损害减至最�。佣档透弊饔�。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用来制定人用剂量的范围。这样的化合物的剂量最好在包括几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。所述剂量可以根据所用的剂型和所用的给药途径而在该范围内变动。对于本发明方法中所用的任何化合物，可以根据细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。剂量可以用动物模型来制定，以达到包括根据细胞培养测定的IC50(即达到最大症状抑制一半的试验化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用来更准确地确定有用的人用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆水平。
可以将本发明的多核苷酸分子插入到载体中并且将其用作基因治疗载体。可以通过例如静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或立体定位(stereotatic)注射(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)，将基因治疗载体给予患者。所述基因治疗载体的药物制剂可包括基因治疗载体的可接受的稀释剂或者可以包括其中包埋基因传递载体的缓释基质。另一方面，在可以从重组细胞完整地产生完全基因传递载体例如逆转录病毒载体的情况下，所述药物制剂可以包括一种或多种产生所述基因传递系统的细胞。
所述药用组合物可以包括在容器、包装或分配器中并且附有给药说明。
试剂盒本发明也包括用于检测在生物样品中存在RGS或Gα蛋白或多核苷酸的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含一种能够检测生物样品中的所述蛋白或mRNA的标记化合物或试剂；用于测定所述样品中RGS或Gα含量的方法；和用于将所述样品中的含量与对照或标准品进行比较的方法。所述化合物或试剂可以包装在一个合适的容器中。所述试剂盒还可以包含应用所述试剂盒来检测标记蛋白或多核苷酸的说明。
本发明也提供用于测定GPCR相关疾病患者长期存活的预后的试剂盒，所述试剂盒包含用于评价本发明RGS分子和Gα分子表达的试剂。所述试剂可能最好是抗体或其片段，其中所述抗体或其片段分别与RGS蛋白或Gα蛋白特异性结合。例如，目标抗体可能是市售的，或者可以通过本领域已知的方法来制备。任选的是，所述试剂盒可以包含一种多核苷酸探针，其中所述探针特异性结合对应于RGS或Gα多核苷酸的转录多核苷酸。
本发明还提供用于评价抑制患者的GPCR相关疾病的多种化合物中每种化合物的适应性的试剂盒。
本发明的一个实施方案提供一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒。所述试剂盒包括第一种多核苷酸探针和第二种多核苷酸探针，其中所述第一种多核苷酸探针特异性结合转录RGS多核苷酸，而所述第二种多核苷酸探针特异性结合转录Gα多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一种抗体和第二种抗体，其中所述第一种抗体特异性结合RGS多肽，而所述第二种抗体特异性结合相应的Gα多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供用于评价抑制患者的GPCR相关疾病的多种化合物中每种化合物的适应性的试剂盒。所述试剂盒包括a)多种试验细胞，其中每种试验细胞都包括GPCR、RGS蛋白、相应的Gα蛋白和报道基因，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达；和b)一种GPCR激动剂。
按照标准技术，对本发明上述组合物和方法的各种修改对于本领域技术人员而言将会是显而易见的，并意味着本发明将包括这样的修改。
通过下面的实施例进一步说明本发明，但不应认为是限制性的。通过本申请引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请以及附图和图表的公开内容都通过引用结合到本文中。
实施例本领域需要对表达GPCR的细胞、特别是表达Gαi的细胞进行药物筛选测定。为了满足这一需要，根据在表达GPCR的细胞中RGS蛋白和Gα蛋白之间的相互作用，开发出一种可以鉴定出潜在药物候选物的测定。将报道基因在接触试验化合物的试验细胞中的表达与所述报道基因在接触GPCR激动剂的试验细胞中的表达进行比较，对所述相互作用进行定量。
如下所述，结果表明，将本发明的RGS导入所述细胞中，导致与没有所述RGS的信号相比，GPCR信号被抑制大约30-40％。令人惊奇的是，所述RGS与相应Gα蛋白的共转染，导致与没有所述RGS分子或Gα分子的信号相比，GPCR信号被抑制大约80-90％。因此，在相应的RGS存在下，Gαi分子或Gαq分子能够减弱GPCR信号。
实施例1试剂百日咳毒素、喹吡罗、PD098059和渥曼青霉素购自Sigma(St.Louis，MO)。组织培养试剂购自Life Technologies，Inc(Gaithersburg，MD)。萤光素酶/β-半乳糖苷酶报道基因测定系统购自Tropix(Bedford，MA)。抗磷酸p44/42多克隆抗体和抗HRP缀合的兔抗体购自CellSignaling Technology(New England Biolabs，Bedford，MA)。抗p42多克隆抗体和抗myc单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)。抗磷酸-Akt多克隆抗体和抗Akt单克隆抗体购自Transduction Laboratories(San Diego，CA)。抗HRP缀合的小鼠抗体购自Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。
实施例2DNA构建体按照本领域普通技术人员已知的技术，将附加和未附加N末端myc的人RGS2、RGS4、RGSz1和Cdc42N17克隆到真核表达载体pCR3.1(InVitrogen，Carlsbad，CA)中。按照本领域普通技术人员已知的技术，将Gαi1、Gαq/i嵌合体和βARKct克隆到表达载体pcDNA3.1(InVitrogen，Carlsbad，CA)中。对于附加myc的RGS2、RGS4和RGSz1，相应的N末端引物是5′-gccaccatggaacagaagctgatctccgaagaggacctcaacggcatgcaaagtgctatgttcttggctg-3′(SEQ IDNO1)；5′-ccaccatggaacagaagctgatctccgaagaggacctcaacggcatgtgcaaagggcttgcaggtc-3′(SEQ ID NO2)；和5′-ccaccatggaacagaagctgatctccgaagaggacctcaacggcatgggatcagagcggatggagatg-3′(SEQ ID NO3)。
所有表达构建体在ATG起始密码子之前都含有Kozac(GCCACC)序列，以有利于表达。用Quick-Chahge诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)，进行定点诱变。通过对完整蛋白编码区的DNA进行测序，证实所有构建体。RhoN19、RacN17和C3胞外酶的表达构建体由R.Herrara(University of Michigan)友好提供。报道基因pCMV-βGal由Y.Dai(Columbia University)友好提供，而pSRE-萤光素酶报道基因购自Stratagene(La Jolla，CA)。
实施例3细胞培养、转染和萤光素酶测定让稳定表达D2R的CHO细胞生长并保持在补充10％胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素/链霉素、5μg/ml霉酚酸、0.25mg/ml黄嘌呤和HT增补剂的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基中。在转染前一天，将细胞分配到6孔板中，而在转染当天，让所述细胞生长至40-60％汇合。用LipofectAMINE PlusTM试剂(Gibco Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)并按照生产商的说明，进行瞬时转染。简而言之，每块板使用5μg总DNA，并且在含有谷氨酰胺的Optio-MEMTM培养基(Gibco Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)中进行转染。转染后3小时，向所述转染物中加入等体积的生长培养基(含有10％胎牛血清)，让细胞恢复3-4小时，然后在无血清培养基中生长16小时。然后所述培养基用含有不同浓度的喹吡罗的无血清培养基取代。孵育5小时后，制备细胞提取物，用双报道基因测定试剂盒，按照生产商的说明(Tropix，Bedford，MA)，测量萤光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。
实施例4蛋白质印迹分析将细胞与含有150mM NaCl、50mM Tris，pH7.5、5mM EDTA、1％Triton和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液一起在冰上保温5分钟，来制备细胞裂解液。然后从板上刮下细胞并进行超声处理。通过于4℃微量离心10分钟，去除去垢剂不溶性物质。将等量蛋白在SDS凝胶(Novex，Carlsbad，CA)上电泳，然后转移到硝酸纤维素(Bio-Rad，Hercules，CA)。膜用5％乳的TBS溶液封闭1小时，然后在含有1％乳和适当稀释的第一抗体的TBS溶液中孵育过夜。将膜洗涤，然后在含有合适HRP缀合的第二抗体的TBS溶液中孵育1小时，再次洗涤，然后用ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)显色。
实施例5D2R的激活引发由Gβγ亚基介导的c-FOS SRE应答Gq偶联受体和G12/13偶联受体的激活导致c-fos SRE报道基因在成纤维细胞中被激活。因为通过表达组成型活性Gαq和Gα12/13再现了激活(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)，所以所述发现建立了Gαq和Gα12/13在向所述SRE发信号中的作用。同时Gβγ的过量表达也导致SRE激活，尽管程度较低(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)，但是Gi偶联受体的激活是否可以诱导同样的转录应答仍有争论(参见Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123；Sun等，J.Biochem.(1999)125515-521)。为了检查在CHO细胞中稳定表达的D2R即Gi偶联受体的激活是否能够起始导致SRE激活的信号事件，瞬时表达SRE-萤光素酶报道基因。在用D2R特异性激动剂喹吡罗刺激细胞后，测定萤光素酶活性。在10μM喹吡罗处理时，观察到萤光素酶活性大约被诱导7倍(图1)。细胞用10ng/ml百日咳毒素(PTX)预处理过夜，完全消除了喹吡罗刺激的SRE激活(图1)，证实了Gi/o介导的事件。β-肾上腺素能受体激酶C末端(βARKct)的瞬时表达也完全消除了SRE激活(图1)，βARKct阻断了Gβγ向下游效应物发信号(参见Crespo等，J.Biol.Chem.(1995)27025259-25265)。因此，D2R介导的SRE激活由Gβγ亚基起始，从而提示活化Gαi不向SRE发信号(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)。
实施例6RGS蛋白的表达抑制喹吡罗刺激的SRE激活选择蛋白RGS2、RGS4和RGSz1，以研究RGS蛋白在喹吡罗诱导的SRE激活中的潜在作用。这些RGS蛋白主要由RGS结构域组成并且在体外表现出不同的GAP分布型。RGS2是针对Gαq的选择性GAP(参见Heximer等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9414389-14393)，而RGS4是针对Gαq和GαI两者的有效GAP(参见Berman等，(1996)Cell 86445-452；Hepler等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94428-432)。RGSz1对于Gαz即Gαi家族的一个成员是高选择性的(Glick等，(1997)J.Biol.Chem.27326008-26013；Wang等，(1997)J.Biol.Chem.27326014-26025)。如图2所示，喹吡罗刺激用对照质粒瞬时转染的细胞，产生剂量依赖性SRE激活。相应RGS蛋白的瞬时转染导致相似程度的剂量—反应曲线向右移动。对来自用附加myc的RGS2、RGS4和RGSz1转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹分析，证明在这三种RGS蛋白中表达相等。因此，尽管Gαi GAP体外活性有差异，但是这三种RGS蛋白在CHO细胞中同样地弱化D2R起始的SRE激活。
实施例7Gαi1或Gαq/i嵌合体的表达差别增强RGS蛋白对喹吡罗诱导的SRE激活的抑制为了测试可利用量的Gα蛋白是否影响RGS体内活性，用Gαi1和RGS4共转染CHO-D2R细胞。在用100nM喹吡罗刺激后，对SRE激活进行分析。当Gαi1本身单独在所述细胞中过量表达时，与单独表达载体质粒的细胞相比，始终如一地地观察到程度略微降低的喹吡罗刺激的SRE激活(图3A)。所述差别由于使用更高浓度的喹吡罗而更加显著。尽管如此，与无Gαi1过度转染的细胞所观察到的大约降低40％相比，RGS4与Gαi1的共表达导致喹吡罗刺激的SRE激活被降低大约85％(图3A)。为了检查Gαi1增强作用对于不同的RGS蛋白是否是选择性的，用Gαil和这三种相应的RGS蛋白转染CHO-D2R细胞。尽管RGS4与Gαi1的共转染在所使用的所有喹吡罗浓度时都产生了大于约80％的SRE激活被抑制，但是RGS2和RGSz1仅显示出大约25-30％减弱(图3B)。在所有这三种情况下，被所述RGS蛋白的抑制持续存在，而与高浓度喹吡罗的应用无关。RGS抑制潜能的强弱等级与其针对Gαi的体外GAP活性相关。
为了进一步研究在体内Gα蛋白量和RGS蛋白选择性之间的相互作用，用CHO-D2R细胞中的Gαq/i嵌合体共转染RGS2和RGS4。所述嵌合体是一种融合蛋白并且具有Gαq除最后5个氨基酸以外的所有结构基序，Gαq的最后5个氨基酸已被Gαi1的最后5个氨基酸取代。Gα蛋白的最后5个C末端氨基酸负责Gα与其关连受体的结合(参见Conklin等，(1993)Nature 363274-276)。因此，尽管与活化D2R结合，但是所述嵌合体可以产生Gαq介导的信号事件并且受到Gαq选择性RGS蛋白的调节。喹吡罗刺激CHO-D2R细胞中过量表达的Gαq/i以约20倍的最大激活显著激活所述SRE-报道基因(图3B)。该结果与报道的一致，即活化Gαq本身是c-fos SRE的有效激活剂(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9410098-1-1-3；Mao等，(1998)J.Biol.Chem.27327118-27123)。当RGS2即一种体外Gαq的有效GAP(参见Heximer等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.14389-14393)与Gαq/i一起共表达，观察到SRE激活降低大约70％。Gαq/i与RGS4的共表达显示SRE激活被降低约60％，RGS4也是Gαq的有效GAP，但比RGS2的效力低(参见Berman等，(1996)Cell 86445-452；Hepler等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94428-432)。Gαq/i对RGS2和RGS4活性的差别增强是统计学显著性的，并且与每种蛋白的体外Gαq GAP活性相关。因此，Gα蛋白的量可以控制RGS蛋白在减弱体内G蛋白信号时的强度和选择性。
实施例8MAP激酶参与D2R诱导的SRE激活NIH3T3细胞中Gβ1γ2的瞬时表达导致SRE-报道基因被激活(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9410098-10103)。作用机制推定是TCF联途径，由于众所周知的是，Gβγ通过Ras-Raf-MEK途径激活经典MAP激酶Erk1/2(参见Lopez-Ilasaca，(1998)Biochem.Pharma.56269-277)。磷酸化Erk1/2转运至细胞核，在此Erk1使Elk1磷酸化(出处同前)，从而导致c-fos SRE的TCF联反式激活(参见Shaw等，(1989)Cell 56563-572；Treisman，(1994)Curr.Opin.Genet.Dev.496-101；Kortenjann等，(1994)Mol.Cell.Biol.14，4815-4824)。为了阐明Erk1/2在CHO细胞的Gβγ介导的SRE激活中的作用，用25 nM MEK抑制剂PD098059处理CHO-D2R细胞。喹吡罗刺激导致被PD098059处理完全抑制的Erk1/2的磷酸化。然而，与用溶媒处理的细胞相比，用PD098059处理的细胞仅显示出喹吡罗刺激的SRE活性降低约50％。因此，除所述Ras-MAPK途径以外，其它信号分子也可能参与CHO细胞中Gβγ介导的SRE激活。
实施例9小G蛋白的Rho家族是D2R诱导的SRE激活所必需的已经表明，Rho家族的小G蛋白激活c-fos SRE(参见Hill等，(1995)Cell 811159-1170)。进行了一项确定CHO细胞中Gβγ向所述SRE发信号是否部分通过这些小G蛋白介导的研究。用RhoA、Rac1和Cdc42即Rho家族成员的代表的显性失活突变体瞬时转染CHO-D2R细胞。通过用Asn取代RhoA的Thr19、Rac1的Thr17以及Cdc42的Thr17，产生所述突变体。在相关小的GTP酶Ras的类似突变增加其对GDP的亲和力。所述突变导致鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的螯合，使其不能激活内源Ras，从而阻断了下游信号事件。同样，已经表明，RhoN19、RacN17和CdcN17起显性失活分子的作用(参见Coso等，(1995)Cell 811137-1146；Kozma等，(1995)Mol.Cell.Biol.15，1942-1952；Minden等，(1995)Cell 811147-1157)。在CHO D2R细胞中相应显性失活突变体的转染抑制喹吡罗刺激的SRE激活(图5)。肉毒梭菌(C.botulinum)C3转移酶的转染也减少了SRE激活，因为所述转移酶通过Asn41的ADP核糖基化使Rho失活(参见Hill，(1994)Cell 811159-1170)。Rho家族的所有这三个成员都参加CHO细胞中Gβγ向所述SRE发信号。
实施例10D2R起始的SRE激活不需要PI3-KGβγ激活PI3-Kγ(参见Stephens等，(1995)Cell 7783-93)，并且已经表明，Rac在Gβγ介导的细胞骨架改组中位于PI3-Kγ下游(参见Ma等，(1998)Mol.Cell.Biol.184744-4751)。为了阐明PI3激酶途径参与Gβγ介导的核激活，用PI3-K抑制剂渥曼青霉素(50nM)处理CHO-D2R细胞，然后测量SRE活性。如图6所示，喹吡罗(100nM)刺激诱发Akt即下游丝氨酸/苏氨酸激酶的磷酸化，说明喹吡罗诱导CHO-D2R细胞中的PI3-K激活。用渥曼青霉素处理细胞使Akt磷酸化减至其基础水平。然而，PI3-K活性的阻断并不改变SRE激活的程度，从而排除了PI3-K作为Gβγ向所述SRE发信号的介质的作用。有证据表明，Gβγ也可以通过PI3-Kγ激活Ras-MAPK途径(参见Lopez Ilasaca等，(1997)Science 275394-397)。对经渥曼青霉素处理的细胞的蛋白质印迹分析显示，Erk1/2磷酸化不被渥曼青霉素所抑制，提示在CHO细胞中，喹吡罗刺激的SRE激活不需要PI3-K。
实施例11意义和讨论Gq偶联受体的刺激或者活化Gαq和Gα12/13的表达诱导了SRE激活和细胞转化(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9410098-10103)。作用机制与小G蛋白Rho有关，因为C3胞外酶即特异性Rho抑制剂的表达消除了Gαq或Gα12/13诱导的SRE激活以及转化表型(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9410098-10103，Mao等，(1998)J.Biol.Chem.27327118-27123)。稳定表达D2R的CHO细胞提供Gi偶联受体在介导SRE激活方面的证据(图1和图2)。此外，喹吡罗刺激的SRE激活由于Gβγ清除剂(scanvanger)βARKct的表达而完全消除，因而说明了Gβγ起始的事件。这一发现与下面的见解相一致Gβγ的表达诱导SRE活性，而组成型活性Gαi或Gαo的表达不能激活SRE(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.9410098-10103，Mao等，(1998)J.Biol.Chem.27327118-27123)。值得注意的是，Mao等没能观察到293细胞中激动剂诱导的D2R激活和SRE-报道基因活性之间的联系。
Gβγ诱导的SRE激活可能涉及TCF联途径，因为Gβγ是一种充分表征的Ras-Raf-Erk途径激活剂(参见Lopez-Ilasaca，(1998)Biochem.Pharma.56269-277)。Erk激活被PD098059抑制仅部分抑制了CHO-D2R细胞中的喹吡罗刺激的SRE激活(图4)，提示除Erk1/2以外，也包括其它信号分子。Rho家族成员的显性失活突变体的表达也减少了喹吡罗诱导的SRE激活(图5)。关于Gβγ激活Rho家族成员却知之甚少。Gβγ可以通过PI3-Kγ调节Rac依赖性细胞骨架改组发挥作用(参见Ma等，(1998)Mol.Cell.Biol.184744-4751)。然而，用消除PI3-K途径的喹吡罗刺激的激活的渥曼青霉素处理细胞，没有减少SRE激活(图6)。因此，PI3-K虽然由喹吡罗激活，但是似乎并不影响CHO细胞中Rho家族介导的SRE转录活性。
已经发现，Rho家族成员调节依赖SRE的基因转录(参见Hill等，(1995)Cell，811159-1170)。Rho通过转录因子SRF联途径激活SRE，但联系Rho与SRF的中间分子尚未鉴定出来。Rac和Cdc42通过一系列激酶介导的磷酸化事件而激活c-Jun N末端激酶(JNK)和p38应激诱导的激酶来调节基因转录(参见Coso等，(1995)Cell 811137-1146；Minden等，(1995)Cell811147-1157)。同家族成员Erk1一样，活化JNK和p38转运至细胞核中，在细胞核中它们使转录因子Elk1磷酸化。因此，Rac和Cdc42可以通过TCF联途径潜在介导喹吡罗刺激的SRE激活。然而，通过蛋白质印�？杉觳釩HO细胞中任一种激酶的内源水平。因此，JNK和p38在Gβγ向SRE发信号中的重要性是不确定的。在Swiss 3T3细胞中，Rho家族成员在介导细胞骨架变化中有梯级顺序，同时Cdc42能够激活Rac，进而Rac可以激活Rho(参见Nobes等，(1995)Cell 8153-62)。显性失活Rho或C3胞外酶的表达阻断了成纤维细胞中Rac诱导的c-fos SRE激活，因而在所述信号途径中Rac位于Rho的上游(参见Kim等，(1997)FEBS Lett.415325-328)。
用CHO-D2R细胞系统作为示例以及用SRE激活作为信号终点，RGS2、RG4和RGSz减弱喹吡罗刺激的SRE激活(图3)。这些RGS蛋白主要由RGS结构域组成并且不含有在较大的RGS蛋白中存在的额外蛋白质—蛋白质相互作用基序，所述基序可以使其与其它信号网络相联(参见Hepler(1999)Trends Pharma.Sci.20376-382；De Vries等，(1999)Trends Cell Biol.9138-143)。因此，所述减弱最有可能是由于所述RGS蛋白的Gα GAP活性所致。此外，Gαi的过量表达优先增强RGS4的抑制效应，而Gαq/i嵌合体的过量表达既增强了RGS2的功能，又增强了RGS4的功能。因为Gα增强作用与这些RGS蛋白的选择性有关，所以D2R诱导的SRE激活的减弱很可能归因于所述RGS蛋白的GαGAP活性。
在本项研究中所有这三种RGS蛋白都表现出对Gi偶联的SRE激活的抑制(图2)。RGS2即体外Gαq GAP明显抑制Gi偶联的事件(参见Ingi等，(1998)J.Neurosci.187178-7188；Potenza等，(1999)J.Pharma.Exp.Thera.291482-491)。同样，观察到Gi偶联的MAPK激酶激活被RGSz1即Gαz特异性GAP所阻断(参见Wang等，(1997)J.Biol.Chem.27326014-26025；Click等，(1997))。在本项研究中分别具有不同Gαi GAP活性的所有这三种RGS蛋白，同样好地减弱喹吡罗刺激的SRE激活(图2)，留下哪个因子决定RGS蛋白体内选择性的问题。RGS选择性可以在几种水平上存在，例如不同组织分布(参见Gold等，(1997)J.Neurosci.178024-8037)、亚细胞定位(参见Chatterjee等，(2000)J.Biol.Chem.27524013-24021)、翻译后修饰(参见Ogier-Denis等，(2000)J.Biol.Chem.27539090-39095；Benzing等，(2000)J.Biol.Chem.27528167-28172和受体-G蛋白相互作用(参见Xu等，(1999)J.Biol.Chem.2743549-3556)。在本项研究中所用的这三种RGS蛋白，当与Gαi1一起共表达时，表现出对喹吡罗刺激的SRE激活不同程度的减弱，而用RGS4即最强的Gαi GAP显示出最强的作用(图3)。因此，除可以影响RGS蛋白选择性的其它因素外，G蛋白在细胞中的含量也是一个起作用的因素。
与细胞中表达野生型Gαq时Gαq介导的转录激活增加相反(参见Xie等，(2000)J.Biol.Chem.27524907-24914)，始终如一地观察到当在细胞中转染Gαi1时适度降低喹吡罗刺激的SRE激活(图3A)。对这一观察结果的一种解释可能是，尽管加入外源Gαi可以增加细胞中GTP结合型Gαi库以及GDP结合型Gαi库，但是GTP结合型Gαi不向所述SRE发信号(图1)(参见Fromm等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci，9410098-10103；Mao等，(1998)J.Biol.Chem.27327118-27123)，同时GDP结合型Gαi使Gβγ信号终止。因此，假若细胞的外源Gαi仅仅导致Gβγ起始的信号事件的负调节，则因此观察到激动剂诱导的SRE激活方面的降低。尽管如此，当细胞用Gαi共转染时，观察到SRE激活甚至被RGS蛋白更强地减弱。用RGS蛋白的GAP活性可以解释这一观察结果，所述GAP活性使GTP结合型Gαi和GDP结合型Gαi之间的平衡进一步朝GDP结合型移动。因此，如图3B所示，观察到Gαi GAP越有效，受到RGS蛋白的抑制越显著。
Gαq/i嵌合体的转染明显增强了喹吡罗刺激的SRE激活(图3C)，这也是预料之中的，因为Gαq本身激活SRE途径(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)。Gαq诱导的SRE激活通过SRF联途径介导(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103；Mao等，J.Biol.Chem.(1998)27327118-27123)，而Gβγ诱导的SRE部分通过TCF联途径介导(图4)。因此，SRE活性对Gαq/i转染的显著诱导可能源于这两种转录因子(SRF和TCF)对c-fos SRE的协同作用(参见Hill等，(1995)Cell 811159-1170)。实际上，如果细胞用Gαq/i和βARKct共转染，后者抑制来自Gβγ-TCF途径的信号输入，则观察到喹吡罗刺激的SRE激活的水平低得多。延长Gαq偶联受体的刺激导致细胞转化即依赖于SRE活性的过程(参见Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1997)9410098-10103)。减弱源自Gαq和Gβγ的信号的RGS蛋白将会是在病理病症下抑制延长GPCR激活的有效抑制剂。
权利要求
1.一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法，所述方法包括a)在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触，其中所述试验细胞包含i)GPCR；ii)RGS蛋白；iii)相应的Gα蛋白，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达；和iv)报道基因；b)检测所述报道基因在接触试验化合物的试验细胞中的表达；和c)将所述报道基因在接触试验化合物的试验细胞中的表达与在不存在所述试验化合物的情况下所述报道基因在接触所述激动剂的试验细胞中的表达进行比较，其中相对于在不存在所述试验化合物的情况下所述报道基因在接触所述GPCR激动剂的试验细胞中的表达，所述报道基因在接触所述试验化合物和所述GPCR激动剂的试验细胞中的表达水平显著增加，说明所述试验化合物有效抑制所述患者的GCPR相关疾病。
2.权利要求1的方法，其中所述GPCR相关疾病选自神经精神病、心血管疾病和炎症。
3.权利要求1的方法，其中所述GPCR选自D2受体、M2受体、5HT1A受体、Edg1受体和缓激肽受体。
4.权利要求1的方法，其中所述RGS蛋白选自GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
5.权利要求1的方法，其中所述报道基因选自SRE-萤光素酶、SRE-LacZ、SRE-CAT和CRE-萤光素酶。
6.权利要求1的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
7.权利要求6的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
8.权利要求1的方法，其中所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述嵌合蛋白是一种在Gαq和Gαi之间的嵌合蛋白。
10.权利要求1的方法，其中所述试验细胞还包含所述Ras-Raf-MEK途径的野生型信号分子。
11.权利要求10的方法，其中所述Ras-Raf-MEK途径的信号分子包含Ras、Raf、MEK、Erk1/2、Elk1、JNK和p38。
12.权利要求1的方法，其中所述试验细胞还包含野生型Rho家族分子。
13.权利要求12的方法，其中所述Rho家族分子包含RhoA、Rac1和Cdc42。
14.权利要求1的方法，其中将所述Gα蛋白瞬时转染到所述试验细胞中。
15.权利要求1的方法，其中将所述报道基因瞬时转染到所述试验细胞中。
16.权利要求1的方法，其中将所述GPCR稳定地转染到所述试验细胞中。
17.一种评价试验化合物抑制患者的GPCR相关疾病的功效的方法，所述方法包括将以下的a)和b)进行比较的步骤a)RGS蛋白在Gα存在下在第一种细胞样品中的表达，其中使所述第一种细胞样品接触所述试验化合物，和b)RGS蛋白在Gα存在下在第二种细胞样品中的表达，其中使所述第二种细胞样品不接触所述试验化合物，其中相对于所述第二种样品，所述RGS蛋白在所述第一种样品中的表达水平显著降低，说明所述试验化合物有效抑制所述患者的所述GPCR相关疾病。
18.权利要求17的方法，其中所述GPCR相关疾病选自神经精神病和心血管疾病。
19.权利要求17的方法，其中所述RGS蛋白选自GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
20.权利要求17的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
21.权利要求20的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
22.一种高通量筛选能够抑制RGS蛋白的试验化合物的方法，所述方法包括a)在GPCR激动剂存在下，使试验细胞与多种试验化合物的其中一种接触，其中所述试验细胞包含i)GPCR，ii)RGS蛋白，iii)相应的Gα蛋白，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达，和iv)报道基因；b)检测所述报道基因在接触试验化合物相对于其它试验化合物的试验细胞中的表达；和c)找出所述报道基因表达水平的量与所述试验化合物抑制RGS蛋白的能力之间的联系，其中所述报道基因的表达增加说明所述试验化合物能够抑制所述RGS蛋白。
23.权利要求22的方法，其中所述GPCR选自D2受体、M2受体、5HTIA受体、Edg1受体和缓激肽受体。
24.权利要求22的方法，其中所述RGS蛋白选自GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
25.权利要求22的方法，其中所述报道基因选自SRE-萤光素酶、SRE-LacZ、SRE-CAT和CRE-萤光素酶。
26.权利要求22的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
27.权利要求26的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
28.权利要求22的方法，其中所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。
29.权利要求22的方法，其中所述试验细胞还包含所述Ras-Raf-MEK途径的野生型信号分子。
30.权利要求29的方法，其中所述Ras-Raf-MEK途径的信号分子包含Ras、Raf、MEK、Erk1/2、Elk1、JNK和p38。
31.权利要求22的方法，其中所述试验细胞还包含野生型Rho家族分子。
32.权利要求31的方法，其中所述Rho家族分子包含RhoA、Rac1和Cdc42。
33.权利要求22的方法，其中所述试验化合物是选自天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸和多核苷酸的生物活性剂。
34.权利要求22的方法，其中所述试验化合物是小分子。
35.一种高通量筛选能够抑制患者的GPCR相关疾病的试验化合物的方法，所述方法包括a)将RGS蛋白、Gα和试验化合物混合；b)检测所述RGS蛋白和Gα在试验化合物存在下的结合；和c)找出RGS和Gα之间结合被抑制的量与所述试验化合物抑制所述GPCR相关疾病的能力之间的联系，其中所述RGS蛋白和Gα的结合被抑制说明所述试验化合物能够抑制所述GPCR相关疾病。
36.权利要求35的方法，其中所述试验化合物是小分子。
37.权利要求35的方法，其中所述试验化合物是选自天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸和多核苷酸的生物活性剂。
38.权利要求35的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
39.权利要求38的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
40.一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤a)获得来自患者的包含细胞的样品；b)使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；c)检测RGS蛋白和Gα在每种所述等份样品中的表达水平；和d)选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的表达。
41.权利要求40的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
42.权利要求41的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
43.一种就患者的GPCR相关疾病的抑制剂筛选试验化合物的方法，所述方法包括下述步骤a)获得来自患者的包含细胞的样品；b)使等分的所述样品与多种试验化合物的其中一种接触；c)检测RGS蛋白和Gα在每种所述等份样品中的活性；和d)选择一种试验化合物，所述试验化合物相对于其它试验化合物显著抑制RGS蛋白在含有该试验化合物的等份样品中的活性。
44.权利要求43的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
45.权利要求44的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
46.一种筛选能够干扰RGS蛋白和Gα的结合的试验化合物的方法，所述方法包括a)将RGS蛋白、试验化合物和Gα混合；b)测定所述RGS蛋白和所述Gα的结合；和c)找出所述试验化合物与干扰结合能力之间的联系，其中与不存在所述试验化合物相比，所述RGS蛋白和所述Gα在所述试验化合物存在下结合减少，说明所述试验化合物能够抑制结合。
47.权利要求46的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
48.权利要求47的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
49.权利要求46的方法，其中所述试验化合物是一种小分子。
50.权利要求46的方法，其中所述试验化合物是一种选自天然存在的化合物、生物分子、蛋白质、肽、寡肽、多糖、核苷酸和多核苷酸的生物活性剂。
51.权利要求46的方法，其中所述试验化合物是一种蛋白。
52.权利要求46的方法，其中所述Gα蛋白是一种嵌合蛋白。
53.一种确定患者的GPCR相关疾病的严重程度的方法，所述方法包括将以下的a)和b)进行比较的步骤a)RGS蛋白在来自所述患者的样品中的表达水平；和b)RGS蛋白在对照样品中的正常表达水平，其中相对于RGS蛋白的正常表达水平，RGS蛋白在来自所述患者的样品中的异常表达水平说明所述患者患有严重GPCR相关疾病。
54.权利要求53的方法，其中用与所述RGS蛋白特异性结合的抗体或其片段来检测所述RGS蛋白的存在。
55.权利要求53的方法，其中从实质上没有所述GPCR相关疾病的组织中采集对照样品，并且RGS蛋白的异常表达水平至少约2倍于正常RGS表达水平。
56.一种评价用于抑制患者的GPCR相关疾病的治疗的功效的方法，所述方法包括将以下的a)和b)进行比较的步骤a)RGS蛋白在第一种样品中的表达，所述第一种样品从在给所述患者提供所述治疗的至少一部分之前的所述患者中获得，和b)RGS蛋白在第二种样品中的表达，所述第二种样品在提供所述治疗的所述部分之后获得，其中相对于所述第一种样品，所述RGS蛋白在所述第二种样品中的表达水平显著受到调节，说明所述治疗有效抑制所述患者的所述GPCR相关疾病。
57.一种用于诊断GPCR相关疾病的方法，所述方法包括a)获得来自患者的包含细胞的样品；b)测量RGS和Gα在所述样品中的表达，c)找出RGS和Gα的量与存在GPCR相关疾病之间的联系，其中与对照样品相比，RGS和Gα的水平显著增加说明存在GPCR相关疾病。
58.一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，所述方法包括给予一种包含以下组分的组合物a)一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂，b)一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂；和c)药学上可接受的载体。
59.权利要求58的方法，其中所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为小分子。
60.权利要求58的方法，其中所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为多肽。
61.权利要求58的方法，其中所述RGS抑制剂和所述Gα抑制剂均为多核苷酸。
62.一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，所述方法包括给予一种包含以下组分的组合物a)一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸，b)一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸；和c)药学上可接受的载体。
63.权利要求62的方法，其中所述反义寡核苷酸与选自以下的RGS多核苷酸互补GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
64.权利要求62的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
65.权利要求64的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
66.一种治疗诊断出患有GPCR相关疾病的患者的方法，所述方法包括给予一种包含以下组分的组合物a)一种能够结合RGS多核苷酸的核酶，b)一种能够结合Gα多核苷酸的核酶；和c)药学上可接受的载体。
67.权利要求66的方法，其中所述RGS多核苷酸编码一种选自以下的RGS多核苷酸GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
68.权利要求66的方法，其中所述Gα多核苷酸编码一种选自Gαi和Gαq的Gα多核苷酸。
69.权利要求68的方法，其中所述Gαi多核苷酸编码一种选自Gαi1、Gαi2、Gαi3和Gαo的Gαi多核苷酸。
70.一种增强GPCR信号的方法，所述方法包括给患者的细胞提供一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸。
71.权利要求70的方法，其中所述反义寡核苷酸与选自以下的RGS多核苷酸互补GAIP、RGSz1、RGS1、RGS2、RGS3、RGS4、RGS5、RGS6、RGS7、RGS8、RGS9、RGS10、RGS11、RGS13、RGS14、RGS16、RGS17、D-AKAP2、p115RhoGEF、PDZ-RhoGEF、bRET-RGS、Axin和mCONDUCTIN。
72.一种抑制GPCR信号的方法，所述方法包括给患者的细胞提供一种与Gα互补的反义寡核苷酸。
73.权利要求72的方法，其中所述Gα蛋白选自Gαi和Gαq。
74.权利要求73的方法，其中所述Gαi蛋白选自Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαz和Gαo。
75.一种能够抑制患者的GPCR相关疾病的组合物，所述组合物包含治疗有效量的a)一种特异性结合RGS蛋白的RGS抑制剂和b)一种特异性结合Gα蛋白的Gα抑制剂；和药学上可接受的载体。
76.一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，所述组合物包含治疗有效量的a)一种与RGS多核苷酸互补的反义寡核苷酸和b)一种与Gα多核苷酸互补的反义寡核苷酸；和药学上可接受的载体。
77.一种能够抑制GPCR相关疾病的组合物，所述组合物包含治疗有效量的a)一种能够结合RGS多核苷酸的核酶和b)一种能够结合Gα多核苷酸的核酶；和药学上可接受的载体。
78.一种基因工程试验细胞，所述试验细胞包含i)GPCR，ii)RGS蛋白，iii)相应的Gα蛋白，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达，和iv)报道基因，其中将所述组分(i)-(iv)中的至少一种导入所述细胞中。
79.权利要求78的试验细胞，其中所述细胞是一种哺乳动物细胞。
80.权利要求78的试验细胞，其中所述GPCR是D2多巴胺受体。
81.权利要求78的试验细胞，其中所述RGS蛋白是RGS2、RGS4或RGSz蛋白。
82.权利要求78的试验细胞，其中所述相应的Gα蛋白是Gαi蛋白。
83.权利要求78的试验细胞，其中所述相应的Gα蛋白是Gαq/i嵌合蛋白。
84.一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒，所述试剂盒包含第一种多核苷酸探针和第二种多核苷酸探针，其中所述第一种多核苷酸探针与转录的RGS多核苷酸特异性结合，而所述第二种多核苷酸探针与转录的Gα多核苷酸特异性结合。
85.一种用于测定GPCR相关疾病患者的长期预后的试剂盒，所述试剂盒包含第一种抗体和第二种抗体，其中所述第一种抗体与RGS多肽特异性结合，而所述第二种抗体与相应的Gα多肽特异性结合。
86.一种用于评价多种化合物中每种化合物用于抑制患者的GPCR相关疾病的适应性的试剂盒，所述试剂盒包含a)多种试验细胞，其中每种试验细胞包含i)GPCR，ii)RGS蛋白，iii)相应的Gα蛋白，与没有所述Gα蛋白表达水平的细胞相比，所述Gα蛋白以能够使GPCR信号减弱至少50％的水平表达，和iv)报道基因，和b)一种GPCR激动剂。
全文摘要
本发明涉及通过抑制G蛋白信号调节剂(RGS)蛋白而诊断、治疗和预后G蛋白偶联受体(GPCR)相关疾病的新方法和新组合物。本发明涉及筛选和评价试验化合物的方法，所述试验化合物可用于干预和预防包括神经精神病和肺心病在内的GPCR相关疾病。本发明还涉及可用于调节GPCR信号途径的RGS表达或活性的抑制剂的鉴定方法。
文档编号G01N33/566GK1592625SQ02819874
公开日2005年3月9日 申请日期2002年8月8日 优先权日2001年8月10日
发明者G·霍, K·H·杨 申请人:惠氏公司
专业数控铣床产品供应商
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