专利名称：由 hmgb 蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂及筛选方法
技术领域：
本发明涉及由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂及由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法。
背景技术：
在免疫应答及其控制中，识别自己和非己是其根本。固有免疫体系及获得性免疫(适应性免疫)体系在根据其各自特有的机制而承担该识别的同时，确立并维持不会对自己进行应答的结构、即所谓的免疫耐受。已知固有免疫应答的激活与获得性免疫应答的诱导也有关系，因此可以认为固有免疫应答的抑制对获得性免疫应答的抑制也有效。已知在获得性免疫体系中，在构建表达随机的抗原受体的淋巴细胞库后，绝大多数的自身反应性淋巴细胞被中枢性耐受机制排除，还残留在末梢的自身反应性淋巴细胞被外周性耐受机制抑制。利用获得性免疫体系进行的抗原识别以利用淋巴细胞的抗原受体识别特异性分子结构为特征，但在固有免疫体系中，是对病原体等所持有的分子模式进行识别，以Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)为代表，已知有很多的固有免疫激活受体。特别是，由核酸引起的固有免疫激活对于病毒等病原体的排除是很重要的，同时与各种免疫病症的发病或恶化也有关 ，因此备受关注。但是，固有免疫体系中的核酸的识别机制中还有很多不清楚的地方，作为承担由核酸所激活的免疫应答的分子群，鉴定了 Toll样受体(Toll-likereceptor, TLR) 3、TLR7、TLR9、RIG-1 样受体(RIG-1-like receptor), DAI, AIM2 等受体分子群，但其全貌仍不清楚(例如参照非专利文献I 3)。已知HMGB (high-mobility group box,高迁移率族)蛋白中存在 HMGBl、HMGB2 及HMGB3。这些HMGB蛋白多存在于核内，认为其与染色质结构或转录的控制有关。另外，已知其还存在于细胞质或细胞外。专利文献I中记载了阻碍分泌至细胞外的HMGBl蛋白与细胞表面的糖化终末产物受体(RAGE )结合的合成双链核酸或核酸类似物分子。专利文献2中记载了阻碍分泌至细胞外的HMGBl蛋白与RAGE的相互作用的HMGBl拮抗剂。非专利文献4中记载了无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体对TLR9及TLR7具有很高的亲和性，它们作为TLR的拮抗剂发挥作用。非专利文献5中记载了具有5’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(序列号37)的碱基序列的硫代磷酸寡核苷酸对小鼠的投予诱导了 IFN (干扰素)-Y应答，而具有5’ -TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3’(序列号38)的碱基序列的硫代磷酸寡核苷酸不会引起这种应答。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特表2008-504335号公报
专利文献2:日本特表2009-517404号公报非专利文献非专利文献1:Kawai T.et al, Nat.Rev.Tmmunol 7:131-137,2006.
非专利文献2:Yoneyama et al, J.Biol.Chem 282:15315-15318，2007.
非专利文献3:Burckstummer T.et al, Nat.Tmmunol.10:266-272, 2009.
非专利文献4:Haas T.et al, Immunity, 28:315-323, 2008.
非专利文献5 =Cowdery JS.et al, J.1mmunol.156:4570-4575,1996.
发明内容
发明要解决的技术问题本发明的目的在于提供由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂及由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法。用于解决技术问题的手段本发明提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，其由选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物构成，且通过与HMGB蛋白结合来抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答激活。本发明还提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制方法，其包含对生物体投予选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物的工序。本发明还提供一种选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物的用于作为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂的用途。本发明还提供一种选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物在由HMGB蛋白介导的免疫应 答激活的抑制剂中的应用。发明人等明确了对于由核酸介导的免疫应答的激活，HMGB蛋白是必需的。即，发明人等明确了由核酸介导的免疫应答的激活由HMGB蛋白介导。发明人等还明确了上述化合物通过与HMGB蛋白牢固地结合，强有力地抑制了由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。因此，上述化合物可以作为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂来利用。上述抑制剂不限于抑制由核酸介导的免疫应答的激活，还抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。上述化合物优选为不含非甲基化CG序列且长度为5 40个碱基的硫代磷酸寡核苷酸，更优选为下述的硫代磷酸寡核苷酸:(I)由序列号40所记载的碱基序列构成，或者
(2)由下述碱基序列构成:其是在序列号40所记载的碱基序列中缺失、取代或添加有I个或多个喊基的喊基序列，且是具有针对HMGB蛋白的结合能力的喊基序列。这些硫代磷酸寡核苷酸可作为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂来利用。上述化合物还可以为硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，该衍生物可以为无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体(以下有时也称作“PS”)。PS是具有从硫代磷酸寡核苷酸除去了碱基部分的结构的化合物。如实施例所示，PS可作为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂来利用。本发明的抑制剂通过在细胞内阻碍激活免疫应答的核酸与HMGB蛋白的结合来强有力地抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。即，本发明的抑制剂基于发明人等此次首次明确的机制而抑制细胞内的由HMGB蛋白所介导的免疫应答的激活。作为由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活，可例示出抗原特异性的获得性免疫体系、多发性硬化症、由死细胞导致的过剩的免疫应答、器官移植排斥反应、自身免疫疾病、炎症性肠病、过敏、败血症、由炎症导致的肿瘤增殖、由含核酸的病原体所引起的炎症性疾病等。通过投予本发明的抑制剂，可以在人类或动物的生物体内预防或治疗(改善)这些症状。本发明还提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的抑制用组合物，其含有上述抑制剂及药学上可容许的载体。本发明还提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含:混合步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将HMGB蛋白和标记核酸进行混合； 定量步骤,其中,对与标记核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及判定步骤，其中，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。本发明还提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含:放置(孵育)步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将经固相化的HMGB蛋白进行放置；标记核酸接触步骤，其中，使标记核酸与放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白接触；定量步骤，其中，对与经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸进行定量；以及判定步骤，其中，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量少于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量多于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。本发明还提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含:接触步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下使经固相化的核酸与HMGB蛋白接触；定量步骤，其中，对与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及判定步骤，其中，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。根据上述本发明的筛选方法，使由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选成为可能。这些筛选方法基于发明人等此次首次明确的免疫应答的激活由HMGB蛋白介导这一新机制。通过这些筛选方法，可以简单且高效地进行筛选。发明效果通过本发明，可以提供由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活、即由死细胞导致的过剩的免疫应答、器官移植排斥反应、 自身免疫疾病、炎症性肠病、过敏、败血症、由炎症导致的肿瘤增殖、由含核酸的病原体所引起的炎症性疾病等的基于新原理的抑制剂。另外，可提供由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法。
图1为表示实施例1的结果的曲线图。图2为表示实施例2的结果的曲线图。图3为表示实施例3的结果的曲线图。图4为表示实施例4的结果的曲线图。图5为表示实施例5的结果的照片。图6为表示实施例6的结果的照片。图7为表示实施例7的结果的曲线图。图8为表示实施例8的结果的曲线图。图9为表示实施例9的结果的曲线图。图10为表示实施例10的结果的曲线图。图11为表示实施例11的结果的曲线图。图12为表示实施例12的结果的照片。图13为表示实施例13的结果的照片。图14为表示实施例14的结果的照片。图15为表示实施例15的结果的照片。图16为表示实施例16的结果的曲线图。图17为表示实施例17的结果的曲线图。图18为表示实施例18的结果的曲线图。图19为表示实施例19的结果的曲线图。图20为表示实施例20的结果的曲线图。图21为表示实施例21的结果的照片。图22为表示实施例22的结果的曲线图。图23为表示实施例23的结果的照片。图24为表示实施例24的结果的曲线图。图25为表示实施例25的结果的曲线图。图26为表示实施例26的结果的曲线图。图27为表示实施例27的结果的曲线图。图28为表示实施例28的结果的照片。
图29为表示实施例29的结果的曲线图。图30为表示实施例30的结果的曲线图。图31为表示实施例31的结果的曲线图。图32为表示实施例32的结果的曲线图。图33为表示实施例33的结果的曲线图。图34为表示实施例34的结果的曲线图。图35为表示实施例35的结果的曲线图。图36为表示实施例36的结果的曲线图。图37为表示实施例37的结果的曲线图。
·
图38为表示实施例38的结果的曲线图。图39为表示实施例39的结果的曲线图。图40为表示实施例40的结果的曲线图。图41为表示实施例41的结果的照片。图42为表示实施例42的结果的照片。图43为由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的概略图。图44为表示由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂的筛选方法的一个方式的图。图45为表示实施例43的结果的照片(a)及曲线图(b)。图46 为表示 CpG-B CS), CpG-Rev CS), CpG-M (S)及 PS 的结构的图。图47为表示实施例44的结果的照片。图48为表示实施例45的结果的曲线图。图49为表示实施例46的结果的曲线图。图50为表示实施例47的结果的曲线图。图51为表示实施例48的结果的曲线图。图52为表示实施例49的结果的曲线图。图53为表示实施例50的结果的曲线图。图54为表示实施例51的结果的曲线图。图55为表示实施例52的结果的照片。图56为表示实施例53的结果的照片。图57为表示实施例54的结果的曲线图。图58为表示实施例55的结果的曲线图。图59为表示实施例56的结果的曲线图。图60为表示实施例57的结果的曲线图。图61为表示实施例58的结果的曲线图。图62为表示实施例59的结果的曲线图。
具体实施例方式提供一种基于发明人等新阐明的机制的由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制齐U。该抑制剂由选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物构成。
硫代磷酸寡核苷酸是指寡脱氧核糖核苷酸中的磷酸二酯键转变为硫代磷酸酯键的寡核苷酸衍生物。抑制剂优选由不含非甲基化CG序列且长度为5 100个碱基的硫代磷酸寡核苷酸构成。硫代磷酸寡核苷酸的长度更优选为10 40个碱基，进一步优选为15 30个碱基，特别优选为15 20个碱基。这种硫代磷酸寡核苷酸通过与HMGB蛋白结合而遮掩HMGB蛋白，从而可以抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(CG)序列是指5’ -CG-3’的碱基序列，是未被甲基化的序列。不含非甲基化CG序列的5 100个碱基的寡核苷酸不会激活由HMGB蛋白介导的免疫应答。而超过100个碱基的长度的寡核苷酸有时会激活免疫应答。上述硫代磷酸寡核苷酸更优选为下述的硫代磷酸寡核苷酸:由序列号40所记载的碱基序列所构成，或者由下述碱基序列所构成:其是在序列号40所记载的碱基序列中缺失、取代或添加有I个或多个碱基的碱基序列，且是具有针对HMGB蛋白的结合能力的碱基序列。序列号40的碱基序列为5’-TCCATGAGSTTCCTGATGCT-3’，这里，S表示G或C。另外，由S为C时的碱基序列构成的硫代磷酸寡核苷酸对应于后述的CpG-Rev (S)(序列号38)、由S为G时的碱基序列构成的硫代磷酸寡核苷酸对应于后述的CpG-M(S)(序列号39)。另夕卜，I个或多个是指I 10个，更优选为I 5个，进一步优选为I 3个，特别优选为I或2个。硫代磷酸寡核苷酸更优选由序列号40所记载的碱基序列所构成。由这种碱基序列构成的硫代磷酸寡核苷酸可以强有力地抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。作为硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，只要是具有针对HMGB蛋白的结合能力的物质则无特别限定，可以例示出将硫代磷酸寡核苷酸的骨架的至少一部分转变为磷酸二酯键的物质、将至少一部分的脱氧核糖转变为核糖的物质、将至少一部分的碱基除去的物质、将至少一部分转变为PNA (peptide nucleic acid,肽核酸)的物质、将至少一部分转变为LNA(Locked nucleic acid,锁核酸)的物质、将至少一部分的碱基转变为碱基类似物的物质等。这些衍生物中，优选无碱基硫代磷 酸酯脱氧核糖均聚体(PS)。PS是指化学式(C5H8O4PS)n所示的化合物，具有从硫代磷酸寡核苷酸除去全部碱基部分的结构。η优选为10 100，更优选为15 25。上述硫代磷酸寡核苷酸、PS或它们的衍生物可以是使用核酸合成装置等合成的物质，也可以是从北海道System Science或Fasmac等生产厂家购入的物质。如实施例所示，PS通过在体外以0.1 50 μ Μ、更优选I 10 μ Μ、特别优选5 μ M的浓度进行投予，可以抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。该结果也可直接适用于体内。CpG-B ODN如实施例所示，在使用了缺失TLR9 (Toll样受体9)的细胞或TLR9的表达量少的MEF等细胞的体外实验中，通过以0.1 10 μ M、更优选0.3 3μΜ、特别优选I μ M的浓度进行投予，可以抑制由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。该结果也可直接适用于体内。在临床上使用由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂时，还可以是在抑制剂中适当混合了赋形剂、稳定化剂、保存剂、缓冲剂、溶解辅助剂、乳化剂、稀释剂、张度剂等添加剂的组合物的形态。由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的抑制用组合物除了作为必需成分的上述抑制剂之外，还包含药学上可容许的载体。作为药学上可容许的载体，可举出在药品等中通常使用的各种成分，即水、低级醇、多元醇、油剂、表面活性剂、保湿剂、水溶性高分子化合物、增粘剂、覆膜剂、粉体、螯合剂、PH调节剂、动植物/微生物来源的抽提物、糖类、氨基酸类、有机胺类、合成树脂乳液、皮肤营养剂、维生素类、抗氧化剂、抗氧化辅助剂、香料、各种药效剂等，可以在不损害上述抑制剂的效果的范围内适当添加。作为投予方式，可举出利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的经□剂，利用注射剂、栓剂、液剂等的非经口剂，或者利用软膏剂、霜剂、贴敷剂等的局部投予等。抑制剂的使用量根据症状、年龄、体重、投予方法等来适当选择。在一个实施方式中，上述抑制剂所抑制的由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活是由核酸介导的免疫应答的激活。激活免疫应答的核酸是指双链RNAMouble-stranded RNA、dsRNA)、单链 RNA (single-stranded RNA、ssRNA)、5’三憐酸化 RNA、microRNA、病毒 RNA、病毒DNA、微生物DNA (微生物来源的DNA)、真核生物DNA、B-DNA (具有通常的DNA立体结构的合成DNA、B型DNA)、ISD (IFN-stimulatory DNA、干扰素活化DNA)、非甲基化寡核苷酸等。ISD是指45个碱基的合成DNA (序列号36)，当将ISD导入至细胞内时，引起I型IFN诱导，但这是TLR非依赖性地、介由IRF-3的激活所进行的。本说明书中，有时将这些激活免疫应答的核酸统称为“全部的免疫原性核酸”。另外，本说明书中，用语“免疫应答”包含“固有免疫应答”及“获得性免疫应答”这两者。在一个实施方式中，上述抑制剂所抑制的由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活并非是由核酸介导的免疫应答的激活，而是基于HMGB蛋白的作为细胞因子的功能的免疫应答的激活。通过上述抑制 剂与HMGB蛋白结合，可以抑制基于HMGB蛋白的作为细胞因子的功能的免疫应答的激活。作为由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活，可例示出抗原特异性的获得性免疫体系、多发性硬化症、由死细胞导致的过剩的免疫应答、器官移植排斥反应、风湿性关节炎等自身免疫疾病、炎症性肠病、过敏、败血症、由炎症导致的肿瘤增殖、由含核酸的病原体所引起的炎症性疾病等。这些免疫应答是带来不利的例子。这里，过剩的免疫应答是指如肝脏的坏死性炎症那样因病毒感染、循环异常或代谢异常、单纯炎症反应等外部要因而坏死的细胞诱发炎症、进而该炎症引起新的细胞坏死的负面连锁反应。另外，死细胞优选为坏死细胞。另外，含核酸的病原体是指病毒、微生物、寄生虫等。已知当使用Lipofectamine (商品名，Invitrogen 公司)或 DOTAP (商品名，Roche公司)等阳离子性脂质将激活上述免疫应答的核酸投予至包括人细胞的动物细胞的细胞质内时，会诱发IFN-β、IFN_a l、IFN_a4等I型IFN (干扰素)或趋化因子、炎症性细胞因子的基因表达，从而引起免疫应答。作为非甲基化寡核苷酸，有时使用CpG寡脱氧核糖核苷酸(以下有时称作CpG0DN)，作为dsRNA，有时使用poly (1:C)，作为ssRNA，有时使用poly (U)，作为B-DNA，有时使用 poly (dA:dT) / (dT:dA)等。CpG ODN是指在细菌DNA中出现频率高的包含非甲基化CG序列(5’ _CG_3’ )的合成寡核苷酸。CpG ODN中存在具有多聚G尾的CpG-A ODN (也称作D型)或强有力地激活B细胞、诱导Thl型细胞因子的产生的CpG-B ODN (也称作K型)等。作为CpG-B 0DN，例如可使用具有5’ -TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(序列号I)等序列者。另外,作为CpG-A 0DN，例如可使用具有5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’(序列号2)等序列者。这些CpG ODN还可以具有将磷酸二酯键部分地转变为硫代磷酸酯键等的结构。CpG ODN优选为10聚体 30聚体，poly(1:C)优选为10聚体 10000聚体，poly(U)优选为10聚体 10000聚体，poly (dA:dT)/ (dT:dA)优选为10聚体 10000聚体。本发明提供一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法。该筛选方法的第I实施方式包含:混合步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将HMGB蛋白和标记核酸进行混合；定量步骤，其中，对与标记核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及判定步骤，其中，对在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量与在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量进行比较，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。在混合步骤中，作为HMGB蛋白，HMGBl、2或3的重组体均可优选使用。发明人等首次发现了 HMGB蛋白会与全部的免疫原性核酸结合。作为标记核酸并无特别限定，可例示出CpG ODN、poly (1:C)、poly (U)、B-DNA,5’三磷酸化RNA、microRNA等合成核酸，HSV-1或牛痘病毒DNA等病毒DNA、微生物DNA、牛胸腺DNA等。但是，合成核酸由于其更为均质而更为优选。上述合成核酸优选为10聚体 100聚体，更优选为15聚体 25聚体。标记并无特别限定，可利用生物素、FITC等荧光色素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、放射性同位元素等进行。作为待测物质，当利用待测物质单体刺激包含人细胞的动物细胞时,只要是不会激活免疫应答则无特别限定，可以使用核酸、核酸类似物、蛋白质、低分子化合物等。利用待测物质刺激动物细胞 时是否激活了免疫应答可通过对在待测物质的刺激下IFN-β、IFN-α 1、IFN- α 4等I型IFN (干扰素)或趋化因子、炎症性细胞因子等的表达是否增加进行测定来研究。当这些基因或蛋白质的表达增加时，可判断免疫应答发生了激活。在混合步骤中，待测物质的浓度优选为0.1 100 μ M0另外，HMGB蛋白的浓度优选为I 200μ g/ml。另外，标记核酸的浓度优选为0.1 100 μ M。优选在含有适当的蛋白酶阻碍剂的缓冲液等溶媒中将它们混合并使其反应0.5 24小时。定量步骤可通过使用了链霉亲和素结合磁性珠粒或抗FITC抗体结合磁性珠粒等的拉下分析来进行，也可通过电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA)等来进行。例如，当标记核酸使用生物素标记核酸来进行使用了链霉亲和素结合磁性珠粒的拉下分析时，在通过混合步骤获得的样品中添加链霉亲和素结合磁性珠粒，使样品中的生物素标记核酸结合在链霉亲和素结合磁性珠粒上。接着，利用磁性珠粒的磁力，将与标记核酸结合的HMGB蛋白回收。将所回收的样品供至例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，将凝胶上的HMBG蛋白转印至例如PVDF膜上，使用抗HMGB抗体进行染色后，可以通过光密度测定解析等进行定量。在判定步骤中，将在待测物质的存在下及非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量进行比较，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。另外，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。在第I实施方式的筛选方法中，可进行以下变形。作为标记核酸，使用选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的化合物、例如由序列号40所记载的碱基序列构成的硫代磷酸寡核苷酸。这里，将上述的标记核酸和HMGB蛋白分别预先用具有相互间引起FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer,突光共振能量转移)的关系的突光物质进行标记。作为具有这种关系的荧光物质对，例如可举出N，N，N’，N”-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)和5-羧基荧光素(FAM)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)和FAM、BHQ-1和2’，7’ - 二甲氧基-4’，5’ - 二氯-6-羧基荧光素(JOE)等。由此，当上述化合物与HMGB蛋白发生结合时则引起FRET，对激发波长所产生的荧光波长发生变化。因此，通过观察试样的荧光，可以容易地检测出上述化合物与HMGB蛋白是否发生了结合。在混合步骤中，在待测物质的存在下及非存在下将经标记的标记核酸与经标记的HMGB蛋白进行混合。然后，在定量步骤中，通过利用荧光观察测定是否发生了 FRET，定量地评价标记核酸与HMGB蛋白的结合程度，从而对与标记核酸结合的HMGB蛋白进行定量。接着，在判定步骤中，将在待测物质的存在下及非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量进行比较，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。另外，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核Ife结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。
通过这种变形，可以更为简单、高效地进行由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选。由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法的第2实施方式包含:放置(孵育)步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将经固相化的HMGB蛋白进行放置；标记核酸接触步骤，其中，使标记核酸与放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白接触；定量步骤，其中，对与经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸进行定量；以及判定步骤，其中，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量少于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定待测物质是由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量多于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定待测物质是由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。通过该筛选方法，可以更为简单、高效地进行由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选。在放置步骤中，在待测物质的存在下及非存在下将经固相化的HMGB蛋白进行放置。作为HMGB蛋白，HMGB1、2或3的重组体均可优选使用。HMGB蛋白预先固相化在固相载体上后使用。作为固相载体并无特别限定，例如可以利用由玻璃、陶瓷、金属氧化物等无机物质、天然高分子、合成高分子等构成的微孔板、微芯片、珠粒、薄膜、薄片等形态的载体。固相载体的表面可用氨基(-NH2)、羧基(-C00H)等官能团修饰。例如，作为固相载体使用96孔微孔板时，将以I 100 μ g/ml的浓度溶解于磷酸缓冲生理盐水(PBS)等缓冲液中的HMGB蛋白的溶液注入到微孔板的各孔中，在4 37°C下放置0.5 24小时，从而可以将HMGB蛋白固相化。优选该微孔板在使用前用PBS等缓冲液进行洗涤以将未结合的HMGB蛋白除去。另外，为了抑制非特异性吸附，优选添加含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (2%BSA-PBS)等缓冲液进行封闭。作为待测物质，只要·是当利用待测物质单体刺激包括人细胞的动物细胞时不会激活免疫应答的物质则无特别限定，可以使用核酸、核酸类似物、蛋白质、低分子化合物等。作为待测物质的溶媒，可以使用PBS等缓冲液。在待测物质的非存在下进行放置步骤时，仅使用不含待测物质的缓冲液即可。放置步骤中的待测物质的浓度优选为0.1 100 μ M。另夕卜，在放置步骤中，还可设置在对照物质的存在下进行放置步骤的试验组。作为对照物质，可以使用已知与HMGB蛋白结合了的核酸或已知未与HMGB蛋白结合的化合物等，例如作为已知与HMGB蛋白结合了的物质，可以使用B-DNA。放置步骤优选在4 37°C下进行0.5 24小时。优选在放置步骤后用PBS等缓冲液进行洗涤以将未反应的待测物质或对照物质除去。在标记核酸接触步骤中，使标记核酸与放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白接触。作为标记核酸并无特别限定，可例示出CpG ODN、poly (1:C)、poly (U)、B_DNA、5，三磷酸化RNA、microRNA等合成核酸、HSV-1或牛痘病毒DNA等的病毒DNA、微生物DNA、牛胸腺DNA等。但是，合成核酸由于其更为均质而更为优选。上述合成核酸优选为10聚体 100聚体，更优选为15聚体 25聚体。当HMGB蛋白为HMGBl时，标记核酸可以为RNA。标记并无特别限定，可利用生物素、FITC等荧光色素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、放射性同位元素等进行。优选在标记核酸接触步骤后用PBS等缓冲液进行洗涤以将未反应的标记核酸除去。这里，在放置步骤中添加的待测物质有时会阻碍标记核酸与HMGB蛋白的结合，进行这种阻碍的待测物质即为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。在定量步骤中，对结合在经固相化的HMGB蛋白的标记核酸进行定量。标记核酸的定量方法并无特别限定。例如，在用生物素对标记核酸进行了标记时，使利用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等标记了的抗生物素抗体发生反应，将未反应的抗体洗涤后，使与结合于抗体的HRP或AP等酶相对应的底物发生反应，获得发光或发色。使用酶标仪等对所得的发光或发色进行定量。或者，在用生物素对标记核酸进行了标记时，还可代替抗生物素抗体而使用用HRP或AP进行了标记的链霉亲和素。例如，当用FITC对标记核酸进行了标记时，可以使抗FITC抗体反应后对标记核酸进行定量，还可以对标记核酸的FITC照射激发光并使用荧光酶标仪等对所产生的荧光进
行定量。例如，当用放射性同位元素对标记核酸进行了标记时，可以使用微孔板闪烁计数器等对标记核酸进行定量。在判定步骤中，将与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量和与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量进行比较，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量少于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。另外，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量多于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。图44示出由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法的一个方式。在放置步骤(图44a)中，在待测物质3的存在下及非存在下以及阳性对照物质2的存在下，将经固相化的HMGB蛋白I进行放置。接着，在标记核酸接触步骤(图44b)中，使生物素标记B-DNA4接触。接着，在定量步骤(图44c及图44d)中，对与经固相化的HMGB蛋白I结合的生物素标记B-DNA4进行定量。图44c中，使酶标记的抗生物素抗体5反应。接着，添加酶的底物6 (图44d)并使用酶标仪等对发光或发色进行定量。在待测物质3的非存在下(阴性对照)进行了放置步骤的样品中，标记核酸与经固相化的HMGB蛋白I结合。而在阳性对照物质2的存在下进行了放置步骤的样品中，标记核酸对经固相化的HMGB蛋白I的结合被阻碍。在图44的待测物质3的情况下，在待测物质3的存在下进行了放置步骤的样品中，生物素标记B-DNA4 (标记核酸)对经固相化的HMGB蛋白I的结合被阻碍。于是，由于与结合于在待测物质3的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白I上的生物素标记B-DNA4的量相比，结合于在待测物质3的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白I上的生物素标记B-DNA4的量少，因此判定待测物质3为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。`由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法的第3实施方式包含:接触步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下使经固相化的核酸与HMGB蛋白接触；定量步骤，其中，对与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及判定步骤，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。通过该筛选方法，可以更为简单、高效地进行由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选。在接触步骤中，在待测物质的存在下及非存在下使经固相化的核酸与HMGB蛋白接触。作为核酸，例如可以使用由序列号40所记载的碱基序列构成的硫代磷酸寡核苷酸。核酸的固相化方法并无特别限定，例如可通过使进行了生物素标记的上述核酸与被覆有链霉亲和素的多孔板结合等来进行。作为HMGB蛋白，HMGB1、2或3的重组体均可优选使用。作为待测物质，只要是利用待测物质单体刺激包括人细胞的动物细胞时不会激活免疫应答的物质则无特别限定，可以使用核酸、核酸类似物、蛋白质、低分子化合物等。作为待测物质的溶媒，可以使用PBS等缓冲液。接触步骤中的待测物质的浓度优选为0.1 100 μ M0接触步骤优选在4 37°C下进行0.5 24小时。优选在接触步骤后用PBS等缓冲液进行洗涤以将未反应的待测物质或对照物质除去。接触步骤中添加的待测物质有时会阻碍核酸与HMGB蛋白的结合，进行这种阻碍的待测物质即为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。在定量步骤中，对与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白进行定量。标记核酸的定量方法并无特别限定。例如可以预先用荧光物质标记HMGB蛋白后对该荧光进行定量。或者还可使用针对HMGB蛋白的抗体对HMGB蛋白进行定量。在判定步骤中，将在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量和在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量进行比较，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂。另外，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。通过上述筛选方法获得的由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的促进剂可以以激活由病毒、微生物、寄生虫等导致的感染症的防御机制、增大抗病毒活性、控制免疫细胞的分化平衡以改善过敏病症、激活抗肿瘤应答等的目的来进行使用。这些免疫应答是带来有利效果的例子。实施例 (拉下分析)在质量分析前，用poly (dA:dT) / (dT:dA) (B-DNA，10 μ g/ml)刺激小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast、MEFs) 4小时。在刺激后，使用Dounce型勻浆机(Wheaton science 公司)在匀浆缓冲液(20mM HEPES ρΗ7.4、20% 甘油、50mM KCl、2mMMgCl2UmM PMSFUO μ g/ml抑酶肽、10 μ g/ml亮抑酶肽)中将细胞匀浆。细胞质蛋白抽提物是通过将匀浆后的样品在14500rpm下离心30分钟而制备的。将细胞质蛋白抽提物与对5’末端进行了生物素标记的B-DNA1.4μ g/ml —起孵育后，添加链霉亲和素结合磁性珠粒(Invitrogen公司)并在4°C下孵育15分钟。在反应缓冲液(20mM Tris-Cl pH8.4、20mMMgCl2、50mM KCl)中使拉下的样品与DNase I (Invitrogen公司)反应,将上清供至银染色(Invitrogen公司)或质量分析。体外拉下分析如下进行。首先在竞争物质的存在下或非存在下、在室温下将HMGBl、2或3的重组体处理30分钟。将上清与生物素标记B-DNA在4°C下混合30分钟后，添加链霉亲和素结合磁性珠粒(Invitrogen公司),在结合缓冲液(50mM Tris-Cl pH7.5、150mM NaClUmM EDTA、1%NP_40、100 μ g/ml 亮抑酶肽、ImM PMSFUmM Na3VO4)中进行孵育。接着，用结合缓冲液充分地洗涤混合物，利用SDS-PAGE分离后，使用抗HMGB1、2或3抗体进行免疫印迹。(小鼠、细胞、试剂)除了带有Balb/c遗传背景的Τ1Γ9+小鼠以外，使用带有C57BL/6遗传背景的小鼠。Tlrf' Hmgbl+、Hmgb2_/_ 小鼠的制作通过常规方法进行。MEFs、RAW264.7、NIH3T3、HEK293T 细胞、Tlr9+小鼠的骨髓来源 cDCs (conventional dendritic cells,常规树突状细胞)及pDCs (plasmacytoid dendritic cell precursors,衆细胞样树突状细胞前体)的维持通过常规方法进行。Hmgbl+巨噬细胞、cDCs及pDCs如下制备:将胎儿肝脏造血前体细胞(利用Miltenyi公司的MACS Lineage depletion kit对无分化标记物的细胞进行了纯化的产物)在SCF (20ng/ml)、IL-3 (10ng/ml)及IL-6 (10ng/ml)的存在下培养2天后，在 20ng/ml M-CSF (巨噬细胞)、20ng/ml GM-CSF (cDCs)、100ng/ml 人 Flt3L (pDCs)的存在下培养6天，从而制备。SCF、IL-3及IL-6由P印roTech公司购入。IFN-Y及TNF-α由R&D SYSTEMS购入。IFN-β也由Toray株式会社热心地提供。B-DNA及牛胸腺DNA由Sigma公司购入。生物素标记poly (dA:dT) / (dT:dA)由北海道System Science公司购入。ISD (IFN-stimulatory DNA)、CpG ODN、FITC标记无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体(PS，20聚体)及FITC标记无碱基天然脱氧核糖均聚体(PD，20聚体)由Fasmac公司购入。H)是指将PS的硫代磷酸酯键转变为磷酸二酯键的物质。纯化牛痘病毒DNA(M0株)由A.Kato及M.Kidokoro提供。HSV DNA也由Y.Kawaguchi热心地提供。5’ -三憐酸RNA由C.Reis e Sousa 及 J.Rehwinkel 提供。大肠杆菌 DNA (微生物 DNA)及 R837 由 Invitrogen公司购入。poly (U)及脂多糖(LPS)由Sigma公司购入。poly (I:C)由GE HEALTHCAREBIOSCIENCE公司购入。B-DNA、poly(1:C)及其他的核酸配体只要无特别记载，则以IOyg/ml的浓度进行使用。CpG-A ODN和DOTAP (Roche公司)的复合体形成通过常规方法进行。MitoTracker Deep Red633 由 Invitrogen 公司购入。抗HMGBl 抗体及抗HMGB2 抗体由 Abcam公司购入。抗HMGB3抗体由Transgenic公司购入。抗IRF3抗体(ZM3)由Zymed公司购入。抗β -肌动蛋白抗体(AC-15)由Sigma公司购入。抗NF-κ B ρ65抗体(C20)由Santa CruzBiotechnology公司购入。抗磷酸化STATl抗体(58D6)由Cell Signaling公司购入。(质粒构建)
小鼠HMGB cDNA以MEFs来源的总RNA为基�。寺≈镣ü齊T-PCR获得的pGEX4T3载体(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司)的Sal I及Not I位点。带有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的HMGB蛋白使用谷胱甘肽琼脂糖珠粒(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司)进行纯化。HMGB蛋白及GST蛋白通过凝血酶(Novagen公司)处理进行分离。小鼠RIG-1 (序列号3)、HMGBl (序列号4)及Rab5 (序列号5)的cDNA通过伴有相对于MEF来源的总RNA的逆转录的聚合酶链反应(以下有时也称作RT-PCR)获得，分别克隆至 pCAGGS-CFP、pCAGGS-YFP 及 pCAGGS-RFP 载体(参照 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA、101、15416-15421,2004)的 XhoI 及 NotI 识别部位，获得 CFP-RIG-1、YFP-HMGBI 及 RFP_Rab5。(免疫印迹解析)细胞溶解及免疫印迹解析通过常规方法进行。IRF 二聚体通过使用了Native-PAGE及之后的抗小鼠IRF3抗体的免疫印迹解析来进行。IRF3 二聚体的定量通过NIH Image软件来进行。通过3次独立的实验获得了相同的结果。(RNA 解析) RNA抽提及逆转录反应通过常规方法进行。实时定量RT-PCR分析(定量RT-PCR)使用 LightCycler480 (商品名，Roche 公司)及 SYBR Green System (Roche 公司)来进行。所有数据用使用对甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)基因获得的结果进行了标准化而得到的相对表达单位来表示。数据测定3次，表示为平均土标准偏差。对于所有的数据，在2次以上的独立实验中获得了相同的结果。用于定量RT-PCR 的引物序列如下。HMGBl 正义链 5’ -CCAAAGGGGAGACCAAAAAG-3’(序列号 6)、HMGBl 反义链 5’ -TCATAGGGCTGCTTGTCATCT-3’(序列号 7)、HMGB2 正义链5’ -TGCCTTCTTCCTGTTTTGCT-3’(序列号 8)、HMGB2 反义链 5’ -GGACCCTTCTTTCCTGCTTC-3’(序列号 9)、HMGB3 正义链 5’ -GGAGATGAAAGATTATGGACCAG-3’(序列号 10)、HMGB3 反义链 5’ -CTTTGCTGCCTTGGTG-3’(序列号 11)、GBPl 正义链 5’ -CTCAGCAGCAGTGCAAAAGG-3’(序列号 12)、GBPl 反义链 5’ -GCTCCTGGAGGGTTTCTGTG-3，(序列号 13)、IRF7 正义链5’ -GCAAGGGTCACCACACTA-3’(序列号 14)、IRF7 反义链 5’ -CAAGCACAAGCCGAGACT-3’(序列号 15)、IL-12p40 正义链 5’ -GACACGCCTGAAGAAGATGAC-3’(序列号 16)、IL-12p40 反义链 5’ -TAGTCCCTTTGGTCCAGTGTG-3’(序列号 17)、GAPDH 正义链5’ -CTCATGACCACAGTCCATGC-3’(序列号 18)、GAPDH 反义链 5’ -CACATTGGGGGTAGGAACAC-3 ’(序列号 19)、IL-6 正义链 5’ -ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’(序列号 20)、IL-6 反义链 5’ -CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’(序列号 21)、RANTES 正义链 5’ -ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3’(序列号 22)、RANTES 反义链5’ -GATGTATTCTTGAACCCACT-3’(序列号 23)、I κ B-α 正义链 5’ -TTGGTGACTTTGGGTGCT-3’(序列号 24)、IkB-α 反义链 5’ -TGACATCAGCCCCACATTT-3’(序列号 25)、IFN- α I 正义链 5’ -GCCTTGACACTCCTGGTACAAATGAG-3’(序列号 26)、IFN-α I反义链 5’ -CAGCACATTGGCAGAGGAAGACAG-3’(序列号 27)、IFN-α 4 正义链5’-GACGACAGCCAAAGAAGTGA-3’(序列号 28)、IFN_a 4 反义链 5 ’-GAGCTATGTCTTGGCCTTCC-3 ’(序列号 29)、IFN-β 正义链 5’-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3’(序列号 30)、IFN-β 反义链 5，-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3 ’(序列号 31)。
但实施例50、54及56的定量RT-PCR中使用的引物的碱基序列如下。Ifna4 正向链(Fw) 5’ -CAATGACCTCAAAGCCTGTGTG-3’(序列号 47)、Ifna4 反向链(Rv ) 5 ’ -CACAGTGATCCTGTGGAAGT-3 ’(序列号 48)、Ifnbl (Fw) 5，-CCACCACAGCCCTCTCCATCAACTAT-3，(序列号 49)、Ifnbl (Rv) 5，-CAAGTGGAGAGCAGTTGAGGACATC-3’(序列号 50)、116 (Fw)5’ -ACGATGATGCACTTGCAGAA-3’(序列号 51)、116 (Rv) 5，-GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC-3，(序列号 52)、Tnfa (Fw) 5’ -TCATACCAGGAGAAAGTCAACCTC-3’(序列号 53)、Tnfa (Rv) 5，-GTATATGGGCTCATACCAGGGTTT-3，(序列号 54)、Ccl5 (RANTES)(Fw) 5，-ACGTCAAGGAGTATTTCTACAC-3，(序列号 22)、Ccl5 (RANTES) (Rv)5，-GATGTATTCTTGAACCCACT-3’(序列号 23)、Gapdh (Fw) 5，-CTCATGACCACAGTCCATGC-3，(序列号 18)、Gapdh (Rv) 5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’(序列号 19)。(统计解析)对照组及试验组的结果利用Student’ s t检验进行评价。(ELISA)小鼠IFN-β、IL-6 及 IL-1 β 利用 ELISA 进行测定。IFN-β ELISA 试剂盒由 PBLBIO MEDICAL LABORATORIES 公司购入。IL-6 及 IL-1 β ELISA 试剂盒由 R&D SYSTEMS 公司购入。对于所有数据，在追加的独立的2次试验中获得了相同的结果。
(RNA 干涉)siRNA载体通过将寡核苷酸插入到pSUPER.retro, puro逆转录酶病毒载体的EcoRI及HindIII位点而得以构建。小鼠HMGB1、2及3 (pan-HMGB-siRNA,以下有时称作HMBG-si)、HMGB2、及海肾萤光素酶(Renilla Iuciferase)(对照，以下有时称作 Ctrl-si)的 siRNA 的靶序列分别为 5，-GTATGAGAAGGATATTGCT-3’(序列号 32)、5 ’ -GCGTTACGAGAAACCAGTT-3 ’(序列号 33 )及 5 ’ -GTAGCGCGGTGTATTATACA-3 ’(序列号 34 )。转基因的MEFs细胞用Puromycin (Sigma公司)2 μ g/ml选择48小时，RAW264.7细胞用Puromyc η4 μ g/ml 选择 48 小时。电泳迁移率变动分析(Electrophoreticmobility shift assay) (EMSA)EMSA通过常规方法进行。使用NF- κ B的共有序列(5，-TCGACCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGCCGGGACTTTCCGG-3’，序列号35)。在NF- κ B-DNA复合体中存在的ρ65的存在通过使用了抗Ρ65抗体的超迁移带的检测来进行确认。(病毒感染)使MOI (multiplicity of infection,感染复数)为 1.0 的 HSV-1 或 VSV 感染细胞12小时。在测定HSV-1及VSV的收率时，通过常规方法进行空斑形成试验。对于所有数据，在追加的独立的2次试验中获得了相同的结果。病毒的制备通过常规方法进行。(荧光显微镜观察)在底面为玻璃制的35mm组织培养皿(松浪硝子工业株式会社)上培养HeLa细胞(5X104个)。荧光显微镜观察使用激光扫描型共聚焦显微镜1X81 (奥林巴斯株式会社)来进行。2层及3层彩色图像通过连续获取模式进行拍摄而防止了交叉激发。(寡核苷酸) 使用作为硫代磷酸寡核苷酸的CpG-B (序列号37，以下有时标记为“CpG_B (S)”)、CpG-Rev (序列号38，以下有时标记为“CpG-Rev (S)，，)及CpG-M (序列号39，以下有时标记为“CpG-M (S)”)以及PS。将这些化合物的碱基序列示于图46。图46中，带有下划线的CG (CpG-B (S)), GC (CpG-Rev (S))及GG (CpG-M (S))是各硫代磷酸寡核苷酸中的特征碱基序列。另外，除上述之外，还使用下面的硫代磷酸寡核苷酸。CpG0DN1018 (S)5 ’ -TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3 ’(序列号 55 )、0DN1019 (S )5 ’ -TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3 ’(序列号56)。另外，还使用下面的寡核苷酸。CpG-A5’ -ggTGCATCGATGCAgggggG-3’(序列号2)。CpG-A的小写文字标记的碱基带有硫代磷酸酯骨架、大写文字标记的碱基带有磷酸二酯骨架。(小鼠脾细胞的制备)摘出C57BL/6J小鼠的脾脏，向其中用25G的注射针(Nipro)注入带有DNase I.collagenase D的PBS,将渗出的细胞悬浮液回收。进而，在新的带有DNase1-collagenase D的PBS中将脾脏切碎，将其回收进行37°C孵育(30分钟)。将两者通入细胞筛网(筛孔尺寸40 μ m，BD)，用PFE(在PBS pH7.2(Invitrogen)中添加有 ImM EDTACGIBCO)及 2%FCS (HyClone)的溶液)进行洗漆后，混悬在 I XRBC Lysis Buffer (eBioscience)中，使红细胞溶血。用PFE对所得细胞再洗涤2次后，再次通入至细胞筛网(筛孔尺寸40 μ m,BD)中，混悬在RPMI培养基中。(利用westernblotting解析信号转导通路的激活)
实施例53中，作为一抗使用以下的抗体。兔抗IRF3多克隆抗体(Invitrogen)、兔抗磷酸化 IRF3 (Ser396) (4D4G)抗体(Cell Signaling)、小鼠抗 I κ B a (L35A5)抗体(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 I κ B a (Ser32) (14D4)抗体(Cell Signaling)、兔抗 JNK 抗体(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 JNK (Thrl83/Tyrl85) (81E11)抗体(CellSignaling)、兔抗 p38MAP 激酶抗体(Cell Signaling)、兔抗磷酸化 p38MAP 激酶(Thrl80/Tyrl82)抗体(CellSignaling)。另外,作为二抗使用以下的抗体。抗兔IgG HRP结合抗体(GEHealthcare)、抗小鼠 IgG HRP 结合抗体(GE Healthcare)。(被细胞质DNA或RNA激活的免疫应答中的HMGB的作用)(实施例1)利用B-DNA (图1a)或 poly (I:C)(图 lb)刺激 Hmgbl+/+MEF 细胞或 HmgblvIffiF细胞6小时，或者用脂多糖(LPS) (200ng/ml)(图1c)刺激Hmgb 1+/+MEF细胞或HmgblvIffiF细胞2小时。利用定量RT-PCR对IFN-PmRNA的诱导水平进行测定。将结果示于图1。表示与Hmgbl+/+MEF细胞比较时p < 0.01。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。Hmgbr7^MEF细胞中，由DNA或RNA向细胞质的传递所导致的IFN-β诱导降低。(实施例2)利用B-DNA (图 2a)或 poly (I:C)(图 2b)刺激 Hmgb2+/+MEF 细胞或 Hmgb2+MEF细胞6小时，或者用LPS (200ng/ml)(图2c)刺激Hmgb2+/+MEF细胞或HmgbZ+MEF细胞2小时。利用定量RT-PCR对IFN-PmRNA的诱导水平进行测定。将结果示于图2。表示与Hmgb2+/+MEF细胞比较时P < 0.001。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。
`
HmgbZ+MEF细胞中的IFN-β诱导的降低通过DNA向细胞质的传递而观察到，但通过RNA的传递未观察到。(实施例3)将B-DNA或poly(1:C)脂质导入(脂质转染)到通过表达以所有HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF中。接着，利用定量RT-PCR 测定 IFN-β (图 3a 及 e)、IFN-α 4 (图 3b 及 f)、IL_6 (图 3c 及 g)、RANTES (图 3d及h)的mRNA的表达水平。将结果示于图3。表示与Ctrl-s1-MEF比较时P <0.01。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。缺失了全部HMGB的MEF缺损了对细胞质DNA或RNA的免疫应答。(实施例4)通过将由各种供给源制备的核酸、S卩HSV-1DNA (图4a)、牛痘病毒DNA (图4b)、5’-三磷酸RNA (图4c)、微生物DNA (图4d)、牛胸腺DNA (图4e)、ISD (图4f)脂质导入至缺失了全部HMGB的MEF中，传递至细胞质。ISD的碱基序列为5’-TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA-3’(序列号36)。作为对照，还进行了利用LPS的刺激(图4g)。利用定量RT-PCR测定脂质导入6小时后的IFN-PmRNA的表达量。将结果示于图4。表示与Ctrl-s1-MEF比较时p <0.01。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。利用LPS(200ng/ml)将缺失了全部HMGB的MEF刺激2小时的结果是诱导了 IFN-β(图4g)。而缺失了全部HMGB的MEF缺损了由各种供给源制备的核酸传递至细胞质的6小时后的IFN-β诱导(图4a h)。(由细胞质核酸受体所媒介的信号通路的激活及抗病毒免疫应答中的HMGB的必要性)(实施例5)将B-DNA或poly (1:C)脂质导入(脂质转染)至通过表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF中。通过Native-PAGE及后续的免疫印迹评价IRF3的二聚体化。将结果示于图5。(实施例6)将B-DNA或poly(1:C)脂质导入(脂质转染)至通过表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF中。通过EMSA评价NF-κ B的激活。将结果示于图6。(实施例7)探讨了利用病毒感染进行的I型IFN的诱导。使VSV或HSV-1感染至通过表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF。利用定量RT-PCR测定I型IFN、即IFN-β (图7a及b)、IFN-α I (图7c及d)、IFN- α 4 (图7e及f)的mRNA的表 达水平。将结果示于图7。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。表示与Ctrl-s1-MEF比较时p < 0.01。“**”表示与Ctrl-s1-MEF 比较时 p < 0.05。(实施例8)已知在作为树突状细胞(DCs)亚型之一的浆细胞样树突状细胞的前体细胞(plasmacytoid dendritic cell precursors, pDCs)中，介由 TLR9 可诱导大量的 I 型 IFN的产生。据报道，在脾脏来源的PDCs中，当通过作为DNA病毒的I型单纯疱疹病毒(herpessimplex virustype 1,HSV_1)受到感染时,介由TLR9可诱导I型IFN的表达,而在骨髄来源的pDCs或cDCs (conventional DCs，常规树突状细胞)中，在利用HSV-1的I型IFN的表达诱导中也存在TLR9非依赖性的通路。利用TLR 配体、即 poly (I:C)(图 8a 及 b)、CpG_B ODN (图 8c 及 d)刺激 Hmgbl+/+或Hmgbl+cDCs。作为对照，还进行了利用LPS的刺激(图8e及f)。接着，利用定量RT-PCR测定IL-6 (图8a、c、e)及TNF-α (图8b、d、f)的mRNA的表达水平。将结果示于图8。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。表示与野生型细胞比较时P < 0.0l0(实施例9)利用TLR 配体、即 CpG-B ODN (图 9a)及 poly (U)(图 9b)刺激 Hmgbl+/+ 或Hmgbl^pDCs0作为对照，还进行了利用R837 (TLR7激动剂)的刺激(图9c)。接着，利用定量RT-PCR测定IFN-β的mRNA的表达水平。将结果示于图9。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示与野生型细胞比较时P < 0.01。(使用了对HMGB的高结合亲和性核酸类似物的由核酸激活的免疫应答的干涉)(实施例10)已知MEF中TLR9的表达量很少。在有无利用I μ M的CpG-B ODN进行的30分钟前处理之后，通过B-DNA (图10a)、poly (I:C)(图10b)或LPS (图10c)向细胞质的传递来刺激MEF。利用定量RT-PCR测定IFN-β的mRNA的表达水平。将结果示于图10。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。表示经前处理的细胞的结果相对于未经前处理的细胞的结果为P < 0.01。(实施例11)在有无利用5 μ M PS或I μ M CpG-B ODN进行的30分钟前处理之后，通过I μ g/ml的poly (U)(图1la)的脂质导入或25 μ g/ml的R837 (图1lb)的任一种对骨髄来源的Tlrg+pDCs刺激8小时。利用定量·RT-PCR测定IFN-β的mRNA的表达。将结果示于图11。
表示经前处理的细胞的结果相对于未经前处理的细胞的结果为P < 0.01。(HMGB的鉴定及其对DNA及RNA的结合)(实施例12)对HMGB进行鉴定。将利用B-DNA刺激4小时后的MEF的细胞质抽提物供至使用了生物素结合B-DNA及链霉亲和素结合磁性珠粒的拉下分析。利用DNase I处理将结合于B-DNA的蛋白洗脱。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE及后续的银染色被可视化(图12a)，接着利用质量分析进行解析。图12a表示银染色的结果。图12b表示使用了针对HMGBl、2及3的抗体的免疫印迹解析的结果。(实施例13)探讨HMGB对DNA、RNA及无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体(PS)的结合。将结果示于图 13。在 1、3、10、30、100μ g/ml 的非标记核酸(B_DNA、poly (1:C)、poly (U)、牛胸腺DNA、微生物0嫩)、卩837(1、3、10、30、1001^/1111)(上及中段框)、无碱基天然脱氧核糖均聚体(PD ；0.01,0.1,0.3、1、3 μ g/ml ;下段框)及无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体(PS ；0.01、
0.1、0.3、1、3μ g/ml ;下段框)的存在下进行使用了重组HMGBl或2以及生物素结合B-DNA的体外拉下分析。在下段框中，还使用阶段性增加的非标记B-DNA或CpG-B ODNC0.1、0.3、
1、3μg/ml)。CpG-B ODN及PS的半数抑制浓度(IC5tl)相比较于非标记B-DNA的半数抑制浓度分别为1/150及1/100。(实施例14)使用重组HMGBl及生物素结合poly(U)，在阶段性增加的非标记CpG-B ODN,PS或R837 (0.1、1或10 μ g/ml)的存在下进行体外拉下分析。将结果示于图14。(实施例15)使用重组HMGB3及生物素结合B-DNA，在I或10 μ g/ml的非标记B-DNA或poly(I:C)的存在下或非存在下进行体外拉下分析。将结果示于图15。(由核酸激活的免疫应答中的HMGB的必需的作用)(实施例16)在Hmgb 1+/+或 HmgblvIffiF 中脂质导入(脂质转染)B-DNA (图 16a、b、c)或 poly(I:C)(图 16d、e、f)。接着，利用定量 RT-PCR 测定 IFN- α 4 (图 16a 及 d)、IL_6 (图 16b 及e),RANTES (图16c及f)的mRNA的表达水平。将结果示于图16。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。表示与Hmgbl+/+MEF细胞比较时P < 0.01。在HMGBl的非存在下，各种细胞因子及趋化因子基因的诱导降低。(实施例17)
利用阶段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图 17a 及 b)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10μ g/ml)(图17c及d)对野生型及同一窝仔来源的Hmgbl+MEF刺激6小时，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(图17e及f )对野生型及同一窝仔来源的Hmgbl+MEF刺激2小时。利用定量RT-PCR测定IFN-β (图17a、C、e)及IL-6 (图17b、d、f)的mRNA的表达。将结果不于图17。(实施例18)在Hmgbl+7+或 Hmgbl+cDCs (conventional dendritic cells)中脂质导入(月旨质转染)B-DNA (图18a、b、c)或poly (I:C)(图18d、e、f)。接着，利用定量RT-PCR测定IFN-β (图 18a 及 d)、IFN-α 4 (图 18b 及 e)、IL-6 (图 18c 及 f)的 mRNA 的表达水平。将结果示于图18。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。ND表示未检测到。表示与 Hmgbl+/+cDCs 细胞比较时 p < 0.01。在HMGBl的非存在下，各种细胞因子及趋化因子基因的诱导降低。认为对cDCs的poly (1:C)的应答由RLR及TLR3这两者媒介。(实施例19)探讨在HMGB2的非存在下的细胞因子基因的诱导。利用阶段性增加的B_DNA(0.1、1>5>10 μ g/ml)(图 19a 及 b)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图 19c 及 d)对野生型及同一窝仔来源的Hmgbl+MEF刺激6小时，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(图19e及f )对野生型及同 一窝仔来源的Hmgbl+MEF刺激2小时。利用定量RT-PCR测定IFN- β(图19a、c、e)及IL-6 (图19b、d、f)的mRNA的表达。将结果示于图19。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。(实施例2O)探讨Hmgbl+MEF中的HMGB2的敲除的影响。利用B-DNA(图20a及b)或poly(I:C)(图20c及d)对通过表达以HMGB2为靶的siRNA (HMBG2_si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的HmgbIvIffiF进行刺激，利用定量RT-PCR测定IFN-β (图20a及c)或IFN- α 4 (图20b及d)的mRNA的表达。对于表达对照siRNA (Ctrl-si)的Hmgbl+/+，为了比较也进行了解析。将结果示于图20。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。
表示与表达对照siRNA (Ctrl-si)的细胞比较时P < 0.01。(实施例21)探讨以HMGB2为靶的siRNA的效果。将野生型的MEF通过所示的siRNA逆转录酶病毒进行转化，并通过免疫印迹解析对各HMGB蛋白的表达进行了解析。将结果示于图21。(实施例22)探讨以全部HMGB为靶的siRNA的效果。将野生型的MEF通过表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG2-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行转化，并利用定量RT-PCR解析HMGBl (图22a)、HMGB2 (图22b)及HMGB3 (图22c)蛋白的表达。将结果示于图22。表示与导入了 Ctrl-si的MEF比较时p < 0.01。(实施例23)探讨以全部HMGB为靶的siRNA的效果。将野生型的MEF通过表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG2-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行转化，并利用免疫印迹解析对各HMGBl蛋白的表达进行解析。将结果示于图23。
(实施例24)探讨HMGB缺失细胞中对由各种核酸产生的细胞质刺激的免疫应答的缺损。利用HSV-1DNA (图24a)、牛痘病毒DNA (图24b)、5’-三磷酸RNA (图24c)、微生物DNA (图24d)、牛胸腺DNA (图24e)、ISD (图24f)所示的核酸对通过表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF刺激6小时，或者利用LPS (200ng/ml)(图24g)对通过表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA(Ctrl-si)的逆转录酶病毒进行了转化的MEF刺激2小时。利用定量RT-PCR测定IL-6基因的mRNA表达水平。将结果示于图24。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示与导入了 Ctrl-si的MEF比较时ρ < 0.01。(实施例25 )探讨HMGB缺失细胞中对各种浓度的核酸配体的免疫应答的缺损。利用阶段性增加的 B-DNA (0.1、1、5、10μ g/ml)(图 25a、d)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图25b、e)对表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的MEF刺激6小时，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(图25c、f)对表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的MEF刺激2小时。利用定量RT-PCR测定IFN-β (图25a、b、c)或IL-6 (图25d、e、f)的mRNA的表达。将结果示于图25。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。(实施例26)探讨HMGB缺失细胞中对各种浓度的核酸配体的免疫应答的缺损。利用阶段性增加的 B-DNA (0.1、1、5、10μ g/ml)(图 26a、c)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图26b、d)对表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的MEF刺激6小时，或者利用LPS (10、50、100、500ng/ml)(图26e)对表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照 siRNA (Ctrl-si)的 MEF 刺激 2 小时。利用 ELISA 测定 IFN-β (图 26a及b)或IL-6 (图26c、d、 e)的表达。将结果不于图26。数据全部表不为平均土标准偏差(η = 3)。(实施例27)探讨HMGB缺失细胞对各种细胞因子刺激的应答。将表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照 siRNA (Ctrl-si)的 MEF 用 B-DNA (10 μ g/ml)刺激 6 小时、用 IFN-β (500单位/ml)刺激6小时(图27b)、用IFN-Y (I单位/ml)刺激2小时(图27c)或用TNF-α(10ng/ml)刺激 2 小时(图 27d)。利用定量 RT-PCR 测定 IFN-β (图 27a)、IRF7 (图 27b)、GBPl (图27c)及IkB-α (图27d)的mRNA的表达量。将结果示于图27。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。基本上，即便这些配体为不同的量，也获得了相同的结果。(实施例28)探讨HMGB缺失细胞中被IFN- Y诱导的STATl的激活。利用IFN- Y (I或10单位/ml)对表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的MEF刺激30分钟。利用抗磷酸化STATl (p-STATl)及抗β -肌动蛋白抗体分别检测被磷酸化的STATl及β_肌动蛋白。将结果示于图28。(实施例29)探讨HMGB缺失RAW264.7细胞中对由核酸产生的细胞质刺激的免疫应答的缺损。利用B-DNA (图29a)或poly (I:C)(图29b)对表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的RAW264.7细胞刺激所示时间。利用定量RT-PCR测定IFN-β基因的mRNA表达量。将结果示于图29。表示与Ctrl-si表达细胞比较时p < 0.01。(实施例30)利用阶段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图 30a 及 d)或 poly (I:C) (0.1、1、5、10μ g/ml)(图30b及e)对表达HMBG-si或Ctrl-si的RAW264.7细胞刺激6小时，或者利用 LPS (10、50、100、500ng/ml)(图 30c 及 f)对表达 HMBG-si 或 Ctrl-si 的 RAW264.7细胞刺激2小时。利用定量RT-PCR测定所示的细胞因子基因的mRNA表达量。将结果示于图30。数据全部表示为平均土标准偏差(n = 3)。(实施例31)探讨HMGB缺失ΝΙΗ3Τ3细胞中对由核酸产生的细胞质刺激的免疫应答。利用B-DNA(图31a)或poly (I:C)(图3lb)对表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA(Ctrl-si)的NIH3T3细胞刺激所示时间。利用定量RT-PCR测定IFN-β基因的mRNA表达量。将结果示于图31。"*"表示与Ctrl-si表达细胞比较时P < 0.01。(实施例32)利用阶段性增加的B-DNA (0.1、1、5、10 μ g/ml)(图 32a 及 c)或 poly (I:C) (0.1、
1、5、10 μ g/ml)(图32b及d)对表达HMBG-si或Ctrl-si的NIH3T3细胞刺激6小时，或者利用 LPS (10、50、100、500ng/ml)(图 32e)对表达 HMBG-si 或 Ctrl-si 的 NIH3T3 细胞刺激2小时。利用定量RT-PCR测定IFN-β (图32a及b)或IL-6 (图32c、d、e)的mRNA表达量。将结果示于图32。数据全部表示为平均土标准偏差(n = 3)。(实施例33 )探讨由B-DNA刺激导致的炎性体(infIammasome)通路的激活与细胞死亡中的HMGB的关系。在Hmgb 1+/+或Hmgbl-/-胎儿肝脏造血前体细胞来源的巨噬细胞(图33a)及表达以全部 HMGB 为靶的 siRNA (HMBG-si)或对照 siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 细胞(图 33b)中脂质导入B-DNA，利用ELISA对12小时后分泌的成熟IL-1 β的量进行测定。RAW264.7细胞通过用50ng/ml的LPS刺激16小时，激活炎性体。将结果示于图33。数据全部表示为平均土标准偏差(n = 3)。结果示于图33。表示与野生型细胞或Ctrl-si表达细胞比较时P <0.01。ND表示未检测到。利用阶段性增加的B-DNA刺激表达HMBG-si或Ctrl-si的RAW264.7细胞。细胞在24小时的刺激后回收，利用台盼蓝进行染色。计算相对于未处理细胞的活细胞的百分率。将结果示于图33c。表达HMGB-si的RAW264.7细胞相对于被DNA诱导的细胞死亡更有耐受性。数据全部表示为平均土标准偏差(n= 3)。(实施例34)使VSV (图34a)或HSV-1 (图34b)感染表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的MEF，在24小时后测定病毒滴度。将结果示于图34。数据全部表示为平均土标准偏差(n = 3)。表示与Ctrl-si表达细胞比较时p < 0.01。(实施例35)使VSV (图35a、b、c)或HSV-1 (图35d、e、f)感染表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照 siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 细胞。接着，测定 IFN-β (图 35a 及 d)、IFN- α I (图35b及e)及IFN-α 4 (c及f)的mRNA表达量。将结果示于图35。表示与Ctrl-si表达细胞比较时P <0.01。“**”表示与Ctrl-si表达细胞比较时P <0.05。ND表示未检测到。(实施例36)使VSV或HSV-1感染表达以全部HMGB为靶的siRNA (HMBG-si)或对照siRNA(Ctrl-si)的RAW264.7细胞。接着，测定病毒滴度。将结果示于图36。表示与Ctrl-si表达细胞比较时P < 0.01。(在由核酸所媒介的TLR的激活中HMGB是必要的)(实施例37)利用poly (I:C)(图37a及b)或CpG_B ODN (图37c及d)刺激表达以全部HMGB为靶的 siRNA (HMBG-si)或对照 siRNA (Ctrl-si)的 RAW264.7 细胞，利用定量 RT-PCR 测定IL-6 (图37a及c)及TNF-α (图37b及d)的mRNA表达量。将结果示于图37。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示与Ctrl-si表达细胞比较时P <0.01。ND表示未检测到。(实施例38)利用CpG-A ODN以及CpG-A ODN和DOTAP对表达以全部HMGB为靶的siRNA(HMBG-si)或对照siRNA (Ctrl-si)的RAW264.7细胞进行刺激，利用定量RT-PCR测定IFN-β (图 38a)及 IFN-a 4 (图 38b)的 mRNA 表达量。DOTAP (商品名、Roche Diagnostics株式会社)是用于介由阳离子脂质体将DNA、RNA等带负电的分子导入至真核细胞中的试剂。将结果示于图38。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示与Ctrl-si表达细胞比较时P < 0.01。 (实施例39)探讨通过使用核酸类似物的刺激对被核酸激活的免疫应答的阻碍。在MEF中脂质导入B-DNA后，利用I μΜ CpG-B ODN共刺激0、1、2、3小时，利用ELISA测定IFN-β的诱导。将结果示于图39。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示与未伴有CpG-BODN刺激的由B-DNA产生的刺激进行比较时P < 0.01。(实施例40)在有无利用5 μ M PS或I μ M CpG-B ODN进行的30分钟前处理之后，利用50 μ g/ml的poly (I:C)(无脂质导入)(图40a)或25 μ g/ml的R837 (图40b)对骨髄来源的Tlr9^cDCs刺激4小时。利用定量RT-PCR测定IL_12p40mRNA的表达量。将结果示于图40。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。表示未经前处理的细胞的结果相对于经前处理的细胞的结果为P < 0.01。ND表示未检测到。(实施例41)探讨HMGBl及RIG-1的细胞内分布。将带有CFP标签的RIG-1 (CFP-RIG-1)及带有YFP标签的HMGBl (YFP-HMGBI)的表达载体与带有RFP标签的Rab5 (RFP_Rab5) —起或者在没有RFP-Rab5的情况下导入到HeLa细胞中。在从基因导入的16小时后，利用poly(I:C)刺激细胞2小时，使用激光扫描型共聚焦显微镜进行荧光显微镜观察。图41示出共导入了表达载体(CFP-RIG-1、YFP-HMGBK RFP_Rab5)的细胞的荧光显微镜照片。图41的上段及下段表示分别单独的(从左至右为RIG-1、HMGBU Rab5)及重合的(从左至右为 CFP-RIG-1+YFP-HMGB1、CFP-RIG_I+RFP_Rab5、YFP-HMGBI+RFP-Rab5,CFP-RIG-1+YFP-HMGB1+RFP-Rab5)的照片。比例尺表示5 μ m。表示在多个细胞中观察到的代表性结果。RIG-1及HMGBl这两者部分地与Rab5重合，这表示RIG-1及HMGBl向核内体膜的动员以及大概是由HMGB导致的RIG-1的激活。(实施例42)在poly (I:C)刺激后，利用 MitoTracker Deep Red633 (mitoTR, Invitrogen公司)将共导入有CFP-RIG-1及YFP-HMGBI表达载体的细胞进行染色，使用激光扫描型共聚焦显微镜进行荧光显微镜观察。图42表示细胞的荧光显微镜照片。图42的上段及下段分别表示分别单独的(从左至右为CFP-RIG-1、YFP-HMGBU mitoTR)及重合的(从左至右为 CFP-RIG-1+YFP-HMGB1、CFP-RIG-1+mitoTR、YFP-HMGBl+mitoTR、CFP-RIG-1+YFP-HMGBl+mitoTR)的照片。比例尺表示 5 μ m。如此处所示，RIG-1与mitoTR重合，在HMGBl及mitoTR之间完全观察不到重合。与实施例41所示的结果一起，该结果可如下解释。在利用HMGBl的poly (1:C)识别后，RIG-1被激活，集中分布在线粒体中，因此与IPS-1/MAVS发生相互作用。这些观察为核酸识别及免疫应答激活的一系列活动中的“快照”，在此观察中，RIG-1的一些部分与HMGBl发生相互作用，而其他部分从HMGBl解离而与IPS-1/MAVS相结图43表示基于上述实施例的结果`制成的由核酸介导的免疫应答的激活、SP由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的概略图。全部的免疫原性核酸结合在HMGB上(promiscuous sensing,广范性识别),这对于之后的利用用于激活免疫应答的特异性模式识别受体所进行的识别(discriminative sensing,特异性识别)是必要的。(实施例43) 对使用了利用微孔板固相化的HMGB蛋白的由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂的筛选方法进行评价。每孔100 μ I地将以5 μ g/ml的浓度溶解于PBS的重组HMGBl蛋白注入到96孔板中，在25°C下放置I小时进行固相化。利用PBS溶液洗涤各孔2次后，每孔100 μ I地添加2%BSA-PBS溶液，在25°C下放置I小时进行封闭。利用PBS溶液洗涤各孔2次后，每孔100 μ I地添加仅PBS溶液、溶解有75 μ g/ml的B-DNA, 100 μ g/ml的poly (I:C)、100ng/ml的LPS及25 μ g/ml的R837的PBS溶液，在25°C下放置I小时。接着，用PBS溶液洗涤各孔2次后，每孔100 μ I地添加I μ M的对5’末端进行了生物素标记的B-DNA或仅PBS溶液，在25°C下放置I小时。接着，利用PBS溶液洗涤各孔2次后，每孔100 μ I地添加用PBS溶液稀释了 200倍的HRP标记抗生物素抗体(R & D公司)，在25°C下放置I小时。利用PBS溶液洗涤各孔2次后，每孔100 μ I地添加HRP的底物溶液(BD Biosciences公司)，在25°C下使其发色15分钟。利用酶标仪(Model 680，Bio-rad公司)对各孔的吸光度进行定量。图45 (a)表示发色后的微孔板的照片，图45 (b)表示各样品的吸光度的曲线图。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。(硫代磷酸寡核苷酸及PS对由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的效果)进行使用了作为硫代磷酸寡核苷酸的CpG-B (S)、CpG-Rev (S)及CpG-M (S)以及PS的实验。将这些化合物的碱基序列示于图46。在图46中，带有下划线的CG (CpG-B(S)),GC (CpG-Rev (S))及GG (CpG-M (S))是各硫代磷酸寡核苷酸中特征性的碱基序列。(体外拉下分析)(实施例44)与实施例13 同样操作，以 0.1、0.5、2.5、12.5,62.5 μ g/ml 的 CpG-B (S)XpG-Rev(S)XpG-M (S)及PS作为竞争物质，进行使用了重组HMGBl及生物素结合B-DNA的体外拉下分析。将结果示于图47。CpG-Rev (S)及CpG-M (S)(未显示数据)显示了强于PS的竞争性。(由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的抑制)
(实施例45)在MEF 的培养基中添加 0.1、0.25、0.5、0.75、1μΜ 浓度的 CpG-B (S)XpG-Rev (S)或PS，处理I小时。接着，在这些MEF中脂质导入5 μ g/ml的B-DNA或5 μ g/ml的poly(I:C)并刺激24小时，利用ELISA法测定IFN-β的产生。将结果示于图48。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。(a) (c)表示用B-DNA刺激的结果，Cd) (f)表示用poly(1:C)刺激的结果。结果，在利用CpG-B (S)(图48a及d)或CpG-Rev (S)(图48b及e)处理过的MEF中，IFN-β的产生明显减弱。另外可知，在此次试验的浓度下，使用PS时的MEF的IFN-β产生抑制比使用CpG-B (S)或CpG-Rev (S)时弱(图48c及f)。由以上的结果可知，在MEF的IFN-β产生抑制中，碱基部分的存在是重要的。已知在介由TLR9的免疫应答的激活中CpG-B (序列号I)的第8个及第9个碱基为CG的序列是重要的，在利用将该序列转变为GC、将磷酸二酯键全部置换成硫代磷酸酯键的CpG-Rev (S)(序列号38)进行了处理的MEF中，IFN-β的产生明显减弱。由此结果可知,在由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的抑制中，非甲基化CG序列(5’-CG-3’)并不重要，重要的是(I)具有硫代磷酸酯键及(2)具有碱基。(实施例46)将野生型小鼠来源的骨髄细胞如上所述地通过人Flt3L进行分化诱导而获得pDCs。将该pDCs (以下有时称作“Flt3-DCs”)在3 μ M的CpG-M (S)的存在下处理I小时后，脂质导入I μ M的CpG-A (TLR9激动剂)或5 μ g/ml的poly (U) (TLR7激动剂)并刺激24小时，利用ELISA法测定IFN-α及IFN-β的产生。将结果示于图49。(a)及(b)表示IFN-α产生量的测定结果，(c)及(d)表示IFN-β产生量的测定结果。另外，(a)及(c)表示用CpG-A刺激的结果，(b)及(d)表示用poly (U)刺激的结果。数据全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。结果可知，Flt3-DCs通过利用CpG-M (S)的处理，显著地抑制了利用CpG-A或poly (U)刺激时的IFN-α及IFN-β的产生。(体内败血症模型)(实施例47)将对小鼠的LPS投予作为败血症的模型使用。将致死量的LPS投予至小鼠时，血中的炎症性细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-6的浓度在LPS投予后立刻上升，在2 3小时后迎来峰值，之后数小时内返回至基底浓度。另一方面，当追寻小鼠的生存经过时，多个个体至达到死亡，从LPS投予开始需要经过12 48小时。该时期中，作为在血中高浓度存在的细胞因子发现的是HMGBl。HMGBl的血中浓度在LPS投予后的8小时内未见变化，之后上升，在投予后的16 36小时后维持高浓度。由于血中的HMGBl浓度与败血症的严重程度相关、投予HMGBl的中和抗体时存活率会提高，因此可以看出HMGBl有助于败血症的致死性的重要性。另外，已知在败血症模型中肝细胞会发生坏死，认为由坏死细胞释放出的核酸等DAMPs有可能恶化症状。对通过阻碍这些所谓的炎症介质而能改善症状的可能性进行了探讨。在对C57BL/6小鼠腹腔投予LPS1.25mg/只时所引起的败血症模型中，探讨了CpG-M (S)的效果。在投予LPS的I小时前，尾静脉投予100 μ g/只的CpG-M (S)或生理盐水，测定小鼠的存活率。将结果示于图50。在投予了 CpG-M (S)的小鼠中，可见存活率的改善。通过LPS的投予，在肝脏等中发生细胞死亡，释放出核酸，通过这些核酸，诱导了由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。虽然并不拘泥于特定的理论，但通过CpG-M (S)的投予，认为可抑制这种由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活。如图50所示，在未进行CpG-M (S)投予的对照组(η = 10)中，在LPS注射后12 48小时后所有个体死亡，而投予CpG-M (S)后注射了 LPS的样品组(η = 10)中，70%存活。(碱基序列的探讨)(实施例48)对MEF以ΙμΜ前处理具有5聚体、10聚体(序列号41)、15聚体(序列号42)及20聚体(序列号43)碱基数的poly (dA)(嘌呤碱基)碱基序列的硫代磷酸寡核苷酸(以下有时标记为“poly (dA) (S)”)或具有5聚体、10聚体(序列号44)、15聚体(序列号45)及20聚体(序列号46)碱基数的poly (dC)(嘧啶碱基)碱基序列的硫代磷酸寡核苷酸(以下有时标记为“poly (dC) (S)”)l小时。接着，通过脂质导入5 μ g/ml浓度的B-DNA，刺激前处理后的MEF，使用RT-PCR探讨3小时后或6小时后的IFN- β的mRNA诱导。将结果示于图51。数据 全部表示为平均土标准偏差(η = 3)。(a)表示poly(dA)(S)的结果，(b)表示poly (dC) (S)的结果。作为阳性对照，使用通过CpG-M (S)进行了前处理者，作为阴性对照使用不添加寡核苷酸而进行了前处理者。poly (dA) (S)及poly(dC) (S)均抑制了由B-DNA刺激所引起的IFN- β mRNA的诱导。特别是使用了作为嘌呤碱基的poly (dA) (S)时的IFN-PmRNA的诱导抑制是显著的。另外，15聚体以上长度的硫代磷酸寡核苷酸的IFN- β mRNA诱导抑制效果较大。(阻碍核酸识别受体信号的非免疫原性寡脱氧核苷酸的探索)(各种寡脱氧核苷酸(ODN)的I型IFN产生抑制功能的比较)(实施例49)有报告指出，当通过脂质转染法将poly (dA:dT) / (dT:dA)(采用B型结构的dsDNA,以下称作“B-DNA”)、作为dsRNA的poly (I:C)导入至小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞内时，会产生I型IFN (IFN-α/β )及炎症性细胞因子。因此，首先以利用核酸刺激导致的I型IFN产生量为指标，探讨在培养基中预先添加ODN (以下称作“0DN前处理”)所导致的免疫应答抑制。对于在核酸刺激的I小时前进行了或未进行利用各种ODN的前处理的情况，使用ELISA对MEF中的I型IFN产生量进行定量。结果是，在前处理中使用CpG-BCS),CpG-Rev CS),CpG-M (S)、CpG 0DN1018 (S)、0DN 1019 (S)时，依赖于培养基中的 ODN浓度上升，抑制了 I型IFN的产生。另外，没有碱基、仅由硫代磷酸酯骨架构成的ODN (PS)与利用具有上述碱基的ODN进行前处理的情况相比，I型IFN产生抑制能力更低。将结果示于图52。更详细地说，在MEF 中，在利用各种 ODN (CpG-B (S)、CpG-Rev (S)、CpG-M (S)、CpG ODN 1018 (S)、0DN 1019 (S)、PS)的前处理的 I 小时后，利用 5 μ g/mL B-DNA (A-F)或5 μ g/mL polyCl:C)(G_L)进行刺激，利用ELISA对24小时后的培养液上清中的IFN-β进行定量。使用各自独立的2个样品，示出平均值和标准偏差。图52中，表示P <0.05、
表示P < 0.01，表示在CpG-M (S) ( + )和CpG-M (S) (_)的值间存在显著性差异。(实施例50)探讨蛋白质的合成障碍是由ODN产生免疫应答抑制的原因的可能性。对于CpG-B(S)及CpG-M (S)，使用定量RT-PCR探讨MEF中的I型IFN及炎症性细胞因子的mRNA的诱导。结果如图53所示，当将CpG-B (S)或CpG-M (S)用于前处理时，I型IFN及炎症性细胞因子均抑制了 mRNA的表达诱导。因此，说明这些ODN以比mRNA表达诱导更上游为靶进行免疫应答抑制。另外，当将具有与CpG-M (S)相同的碱基序列且由磷酸二酯骨架构成的ODN (CpG-M)用于前处理时，未见利用CpG-M (S)进行前处理时的I型IFN及炎症性细胞因子的表达诱导的抑制。更详细地说，在MEF中，在利用各种ODN (与CpG-B (S)、CpG-M (S)、CpG-M (S)相同的序列、具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M))的前处理的I小时后，将5μ g/mL B-DNA或5 μ g/mL poly (1:C)导入至细胞内进行刺激。在刺激后的3、6小时后将总RNA回收，利用定量RT-PCR对(A) Ifna4、(B) IfnbU(C) I16、(D)Ccl5的mRNA诱导进行定量。使用各自独立的2个样品，示出平均值和标准偏差。图53中，N.D.表示无法检测。为P < 0.05，
为P <0.01，表示在与CpG-M (S) (_)的值之间具有显著性差异。(核酸的摄入效率的解析)(实施例51)根据实施例50的解析可知，通过对MEF实施ODN前处理，可以抑制由B_DNA、poly(1:C)刺激所导致的IFN产生。对该情况，探讨ODN是通过何种机制抑制了 IFN产生。使用B-DNA.poly (1:C)刺激细胞时，有必要通过脂质转染法导入核酸。因此，在实施例50中考虑到了下述可能性:由于ODN阻碍了利用脂质转染所进行的B-DNA、poly (I:C)向细胞内的摄入，作为结果，抑制了 IFN产生。因此，对于当使5’末端经FITC标记的B-DNA摄入到细胞内时、被认为不会激活TLR9的CpG-Rev CS), CpG-M CS), ODN 1019 (S)的前处理的有无对B-DNA摄入所造成的影响进行了探讨。将结果示于图54。在导入了 FITC标记B-DNA的MEF中，使用流式细胞仪观测FITC来源的荧光。流式细胞仪解析使用FACSCalibur(BD)进行。在该条件下，在利用阻碍IFN产生的CpG-B CS), CpG-Rev CS), CpG-M (S)进行了前处理的样品(图54C、D、E)中，观测到与未处理的对照(图54B)相比为同等程度或更强的荧光，可知没有阻碍B-DNA的摄入。另一方面，在利用ODN 1019 (S)进行了前处理的MEF (图54F)中，与对照的细胞组(图54B)相比，发出FITC来源的荧光的细胞更少，因此可知ODN1019 (S)阻碍了利用脂质转染进行的B-DNA在MEF中摄入。更详细地说，对于不进行利用各种ODN的前处理、未导入FITC标记B-DNA的MEF(A)、仅导入 3μ g/mL FITC 标记 B-DNA 的 MEF (B)及利用 ΙμΜ CpG-B(S)(C)UuM CpG-Rev(S) (D)UuM CpG-M (S) (E)UuM ODN 1019 (S) (F)进行前处理 I 小时后导入 3 μ g/mLFITC标记B-DNA的MEF，利用流式细胞仪检测摄入到细胞内的FITC标记B-DNA来源的荧光。以FITC来源的荧光的荧光强度作为横轴，用直方图示出细胞数。图54中，各框中的数值表示FITC阳性细胞在整体中所占的比例。ODN 1019 (S)是如何阻碍利用脂质转染的核酸向细胞质内导入的机制是不清楚的，但这种抑制作用的解析在这里并非重点。因此，本说明书中，关于ODN 1019 (S)对摄入的阻碍机制不进行更多的解析，在以下实验中使用与CpG-B (S)同样地不阻碍核酸摄入的CpG-M (S)。(CpG-M (S)与HMGB蛋白质的结合及核酸受体信号通路的抑制)(实施例52)由上述结果可知，·利用CpG-M (S)的IFN产生抑制并不是由于核酸的摄入阻碍所导致的。因此，对利用CpG-M (S)的抑制的作用点为何进行了探讨。着眼于与核酸识别有关的信号转导分子进行了解析。已知通过B-DNA或poly (1:C)的刺激不仅可激活I型IFN的诱导、还可激活NF- κ B通路及MAP激酶通路，对通过阻碍B-DNA或poly (1:C)与HMGB蛋白质的结合而可抑制这些信号转导通路的激活的可能性进行了探讨。对于CpG-M (S)与HMGB蛋白质的结合，使用体外拉下分析进行了探讨。对HMGBl的重组蛋白质进行纯化并与生物素标记B-DNA进行混合时，如图55A所示，HMGBl与B-DNA结合。该结合通过添加CpG-B(S)作为竞争物而被完全阻碍。接着，探讨是否能够通过CpG-M(S)来阻碍该HMGBI与CpG-B(S)的牢固结合。如图55B所示，将生物素标记CpG-B (S)与HMGBl蛋白质混合，在其中添加CpG-M (S)时，可以用量依赖性地阻碍CpG-B (S)与HMGBl的牢固结合。由于与添加未经生物素标记的CpG-B (S)时同等地阻碍结合，因此说明CpG-M (S)与CpG-B (S)同等程度地牢固地与HMGBl结合。另外，同时，如图55B所示，CpG-M (S)与仅为没有碱基的硫代磷酸酯骨架的ODN (PS)及与CpG-M (S)为相同序列并具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M)相t匕，更加牢固地与HMGBl结合。更详细地说，对HMGBl的重组蛋白质2 μ g和终浓度为2.5 μ g/mL的生物素标记 B-DNA，添加终浓度为 0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5μ g/mL 的 CpG-B (S)作为竞争物(Competitor)，进行孵育(室温，30分钟)。使用链霉亲和素结合磁性珠粒将生物素标记B-DNA拉下,对于共沉淀的蛋白质,使用抗HMGBl抗体并利用western blotting对HMGBl进行检测。将结果示于图55A。另外，对HMGBl的重组蛋白质2μ g和终浓度为0.2μ M的生物素标记CpG-B (S)，添加终浓度为0、1、2、4、8、16、32μΜ的未进行生物素标记的CpG-B(S)XpG-M (S)、仅为没有碱基的硫代磷酸酯骨架的ODN (PS)、与CpG-M (S)为相同序列且具有磷酸二酯骨架的ODN (CpG-M)作为竞争物。使用链霉亲和素结合磁性珠粒将生物素标记CpG-B拉下,对于共沉淀的蛋白质,使用抗HMGBl抗体并利用western blotting对HMGBl进行检测。将结果示于图55B。(实施例53)在实施例49的探讨中，被认为对HMGBl具有高结合亲和性的CpG-M (S)与仅为硫代磷酸酯骨架的PS相比，利用核酸刺激的IFN诱导的抑制能力更强，在实施例50的探讨中，考虑到CpG-M (S)抑制I型IFN及炎症性细胞因子的mRNA诱导、而CpG-M并不抑制，认为是否是由于利用CpG-M (S)的免疫应答抑制作用通过CpG-M (S)与HMGB蛋白质牢固地结合而阻碍了由于免疫原性核酸与HMGB蛋白质的结合所导致的与下游免疫受体的结合及信号转导。根据该假说，CpG-M (S)的抑制作用不仅止于I型IFN的诱导，还波及到NF-κ B和MAP激酶的激活通路。因此，接着对CpG-M (S)对利用核酸刺激的这些转录因子或信号转导分子的激活的抑制作用进行了探讨。据报道，在利用B-DNA或poly(1:C)等核酸刺激的I型IFN的诱导中，作为转录因子的IFN regulatory factor 3 (干扰素调节因子3、IRF3)发挥着重要的作用。已知IRF3在无刺激时作为单体存在于细胞质内，而通过磷酸化等受到激活时，则形成均二聚体移向核内。因此，以磷酸化为指标探讨了 IRF3的激活。将结果示于图56。可知利用核酸刺激的IRF3的磷酸化通过CpG-M (S)的前处理而被显著抑制。接着，以I κ Ba的磷酸化为指标探讨了 NF-κ B通路的激活,还以c-Jun N-terminal kinase (c_Jun氨基末端激酶、JNK)、p38的磷酸化为指标探讨了 MAP激酶通路的激活。结果可知，通过CpG-M (S)的前处理，这些转录因子、信号转导分子的激活也还是显著减弱。由以上结果教导了 =CpG-M (S)通过与HMGB蛋白质相结合，阻碍了 B-DNA或poly (1:C)与HMGB蛋白质的结合，抑制了利用它们的固有免疫受体刺激所产生的信号通路。更详细地说，对于进行了或未进行利用ΙμΜ CpG-M (S)的I小时前处理的C57BL/6J 小鼠来源的 MEF，将 lyg/mL B-DNA (A)或 I μ g/mL poly (I:C) (B)导入至细胞质内进行刺激。将刺激后0.5、1、1.5、2、3、4小时后的蛋白质样品回收，通过westernblotting 检测 IRF3、I κ Ba、JNK、p38 的磷酸化(P-1RF3、ρ_Ι κ Ba、p-JNK、ρ-ρ38)。(CpG-M (S)抑制作用中TLR9的相关性的探讨)(实施例54)
由上述结果可知，CpG-M (S)对B-DNA在细胞内的摄入并无影响，而是阻碍细胞内核酸识别受体下游的信号转导通路的激活。这强烈教导了 CpG-M(S)以HMGB蛋白质为靶抑制了免疫应答。然而，CpG-M (S)具有与作为TLR9激动剂的CpG-B (S)仅I个碱基不同的序列。因此，对于在TLR9所表达的细胞种类中CpG-M (S)是否仍能抑制核酸刺激所导致的免疫系统的激活进行了探讨。另外，对于CpG-M (S)自身被TLR9识别而作为激动剂发挥作用的可能性进行了探讨。使用Tlr9基因缺损(Τ1Γ9+)小鼠及对照(Tlr9+/_)小鼠来源的cDC探讨了针对细胞内核酸刺激的应答是否被CpG-M (S)前处理所抑制。如图57所示，当利用B-DNA或poly (1:C)刺激这些小鼠来源的cDC时，在两种cDC中同等地诱导了 I型IFN及炎症性细胞因子的基因的表达。此时，通过CpG-M (S)的前处理，在Tlr9+/_cDC、TIrg+cDC的任一情况下均抑制了 I型IFN及炎症性细胞因子基因的表达诱导。由以上可知，在MEF以外的细胞种类中CpG-M (S)也抑制了核酸刺激所导致的免疫系统活性。另外，该抑制作用不依赖于TLR9的信号，推测是通过比TLR9更上游的、大概是HMGB蛋白质与CpG-M (S)的结合所引起的。进而，在不通过B-DNA或poly (1:C)进行刺激、仅添加CpG-M (S)时，既不会诱导I型IFN也不会诱导炎症性细胞因子，因此可知CpG-M (S)与作为TLR9的激动剂的CpG-B (S)不同，其不具有免疫原性。更详细地说，通过ΙμΜ CpG-M (S)对Tlr9基因缺损小鼠(ΤΙΜ+)及对照小鼠(Tlr9+/_)来源的cDC进行前处理或者作为对照不进行前处理，在I小时后将5μ g/mLB-DNA,5 μ g/mL poly (1:C)导入至细胞内进行刺激。在刺激后的3、6小时后将总RNA回收，通过定量 RT-PCR 对(A) Ifna4、(B) IfnbU (C) 116、(D) Tnfa 的 mRNA 的诱导进行定量。使用各自独立的2个样品，示出平均值和标准偏差。图54中，N.D.表示无法检测。表示P < 0.05，“#”表示P < 0.01，表示在CpG-M (S) ( + )与CpG-M (S) (_)的值间具有显著性差异。(由CpG-M(S)导致的TLR通路抑制的探讨)(实施例55)由实施例54的结果认为，CpG-M (S)以TLR9的更上游为靶，抑制由核酸刺激所导致的免疫系统活性。因此，探讨了作为识别相同核酸的膜受体的TLR7的下游信号通路是否也会同样被CpG-M (S)所抑制。CpG-M (S)作为TLR9的激动剂不具有免疫原性。因此，使用大量表达TLR7及TLR9、且当识别到具有作为各自配体的ssRNA、CpG基序的DNA时则产生大量I型IFN的细胞pDC，探讨TLR7、TLR9在核酸识别时的I型IFN诱导是否被CpG-M (S)所抑制。如图58所示，当利用作为TLR9配体的CpG-A或作为TLR7配体的poly (U)刺激PDC时，诱导了 IFN-α的产生，但该产生可被利用CpG-M (S)的前处理所抑制。更详细地说，利用(A)作为TLR9配体的I μ M CpG-A, (B)作为TLR7配体的5 μ g/mL poly (U)刺激用3μΜ CpG-M (S)进行了前处理或未进行前处理的C57BL/6J小鼠来源的PDC，使用ELISA对24小时后培养上清中的IFN- α进行定量。“**，，表示在CpG-M (S)(_)与(+ )的数值间以P < 0.01具有显著性差异。(实施例56)接着，使用定量RT-PCR解析I型IFN基因的表达诱导时，如图59所示，在使用CpG-A, poly (U)任一者进行刺激时，均在mRNA的水平上抑制了 I型IFN基因的表达。由此教导了，CpG-M (S)以利用TLR7、TLR9进行核酸识别所共有的机制为靶，抑制了 I型IFN的诱导。更详细地说，使用 定量RT-PCR对将用10 μ M CpG-M (S)进行了前处理或未进行前处理的C57BL/6J小鼠来源的pDC利用I μ M CpG-A进行刺激时的(A) Ifna4、(B) Ifnbl的mRNA诱导进行定量，并使用定量RT-PCR对将用10 μ M CpG-M (S)进行了前处理或未进行前处理的C57BL/6J小鼠来源的pDC利用5 μ g/mL poly (U)进行刺激时的(C) Ifna4、(D)Ifnbl的mRNA诱导进行定量。均使用各自独立的2个样品，示出平均值和标准偏差。N.D.表示无法检测。为 P < 0.05，“**”为 P <0.01，表示在 CpG-M (S) ( + MPCpG-M (S)(-)的值间有显著性差异。(CpG-M (S)的核酸刺激所导致的获得性免疫激活的抑制及病态模型的评价)由上述结果可知，在体外CpG-M (S)显示了固有免疫应答抑制功能。迅速识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns ;PAMPs)或自身组织来源的损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns ;DAMPs)并进行应答的固有免疫在迅速排除生物体内的非己的方面很重要。但是同时，激活获得性免疫以引起特异性更高的免疫应答也是固有免疫的重要作用。因此，首先以CD8+T细胞的激活为指标探讨体内的固有免疫应答及由此激活的获得性免疫应答是否可被CpG-M (S)所抑制。进而，在利用CpG-M (S)的获得性免疫抑制的基础上，着眼于由上述结果所示的CpG-M (S)不具有免疫原性，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis ;EAE)或败血症等病态模型中探讨 CpG-M(S)所造成的影响。(由CpG-M(S)产生的抗原特异性⑶8+T细胞的激活抑制)(实施例57)
固有免疫的激活与获得性免疫的激活密切相关。众所周知，通过投予抗原和佐剂可激活抗原特异性的获得性免疫，认为佐剂激活固有免疫，在树突细胞等中表达共刺激分子而促进成熟化，从而促进对T细胞的抗原提呈。很多报告指出，通过核酸和抗原的投予可引起抗原特异性的获得性免疫，这里以使用B-DNA作为核酸、投予卵清蛋白(ovalbumin ；OVA)作为抗原时所诱导的OVA特异性CD8+T细胞为指标来探讨CpG-M (S)是否能够抑制获得性免疫的激活。在利用OVA和B-DNA对小鼠进行免疫时，准备了投予CpG-M (S)组和未投予组。在免疫后第8天制备脾细胞，使用OVA特异性MHC I类分子四聚体，利用流式细胞仪检测与OVA特异性反应的CD8+T细胞。如图60所示，与仅通过OVA致敏小鼠的情况(0.97%)相比，与B-DNA —起用OVA进行免疫时，OVA特异性⑶8+T细胞的比例(12.6%)显著增加。此时，投予了 CpG-M (S)的小鼠中，该比例(2.41%)显著减弱。即说明，CpG-M (S)可以抑制由核酸导致的获得性免疫的激活。更详细地说，对C57BL/6J小鼠腹腔内投予(A)仅OVA (B-DNA (_))、(B)0VA和B-DNA (B-DNA ( + ))、或(C) OVA 和 B-DNA、进而加有 CpG-M (S) (B-DNA ( + ).CpG-M (S)(+ ))。使用MHC I类分子四聚体，利用流式细胞仪分析8天后的脾脏中的OVA特异性CD8+T细胞的比例。图60表示对⑶8+T细胞设门的细胞。另外，用红框将⑶44阳性且MHC四聚体阳性的部分围起来。标记的数字表示对CD8+T细胞设门的细胞集团中CD44阳性且MHC四聚体阳性部分的比例。(EAE 病情中的 CpG-M (S )评价)(实施例58)EAE是人类多发性硬化症(Multiple sclerosis ;MS)的动物模型之一。MS是中枢神经系统中自身免疫性的脱髓鞘炎症疾�。谛∈蟮腅AE中，可以将髓鞘来源的肽(M0G肽35-55、Operon、以下称作 “M0G 妝”)随弗氏完全佐剂(complete Freund’ s adjuvant ；CFA)一起投予至正常小鼠中，通过进行免疫使其发病。还有报告指出，MS和EAE所共有的病理观察为B细胞、T细胞、巨噬细胞向中枢神`经系统的浸润及由此导致的神经障碍，核酸与其病情的恶化有关。因此，考虑到通过投予CpG-M (S)是否能够减轻EAE的病情而进行了实验。在EAE中，通过对尾巴或四肢的麻痹等神经障碍的严重程度进行评分，可以评价自身免疫性炎症的发展。EAE的病情得分基于表I的标准进行判定。将MOG肽和CFA皮下注射至小鼠后背部进行免疫。注射I周后开始，每隔2天投予3次CpG-M (S) (η = 4)或作为对照的PBS(η = 4)，对之后的病情进行评价。将结果示于图61。在CpG-M (S)投予组中，与对照组相t匕，EAE的病情显著减轻。即表明，CpG-M (S)可以减轻EAE的病情。更详细地说，在C57BL/6J小鼠后背部投予MOG肽及CFA的I周后开始每隔2天通过尾静脉注射投予3次CpG-M (S) (CpG-M (S) ( + )、n = 4)或作为对照的PBS (CpG-M (S)(-)、η = 4)。图61中以从MOG肽投予开始起算的天数为横轴、用平均值和标准偏差示出各组的病情得分的经过。“*”为卩< 0.05，“#”为卩< 0.01，“*#”SP < 0.001，表示在CpG-M (S) ( + )和CpG-M (S) (_)的值间有显著性差异。表I
权利要求
1.一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，其由选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物中的I种以上的化合物构成。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其中，所述化合物是不含非甲基化CG序列且长度为5 100个碱基的硫代磷酸寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的抑制剂，其中，所述化合物由序列号40所记载的碱基序列构成，或者由下述碱基序列构成:其是在序列号40所记载的碱基序列中缺失、取代或添加有I个或多个碱基的碱基序列，且是具有针对HMGB蛋白的结合能力的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的抑制剂，其中，所述化合物是硫代磷酸寡核苷酸的衍生物，该衍生物为无碱基硫代磷酸酯脱氧核糖均聚体。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的抑制剂，其在细胞内阻碍激活免疫应答的核酸与HMGB蛋白的结合。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的抑制剂，其中，由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活选自:抗原特异性的获得性免疫体系、多发性硬化症、由死细胞导致的过剩的免疫应答、器官移植排斥反应、自身免疫疾病、炎症性肠病、过敏、败血症、由炎症导致的肿瘤增殖以及由含核酸的病原体所引起的炎症性疾病。
7.一种由HMGB蛋白介导的免疫应答的激活的抑制用组合物，其含有权利要求1 6中任一项所述的抑制剂及药学上可容许的载体。
8.一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含: 混合步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将HMGB蛋白与标记核酸进行混合； 定量步骤，其中， 对与标记核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及 判定步骤，其中，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。
9.一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含: 放置步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下将经固相化的HMGB蛋白进行放置； 标记核酸接触步骤，其中，使标记核酸与放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白接触； 定量步骤，其中，对与经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸进行定量；以及 判定步骤，其中，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量少于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制齐U，当与在待测物质的存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量多于与在待测物质的非存在下进行了放置步骤后的经固相化的HMGB蛋白结合的标记核酸的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂。
10.一种由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，其包含: 接触步骤，其中，在待测物质的存在下及非存在下使经固相化的核酸与HMGB蛋白接触； 定量步骤，其中，对与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白进行定量；以及判定步骤，其中，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免 疫应答激活的抑制剂，当在待测物质的存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质 的非存在下与经固相化的核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HM GB蛋白介导的 免疫应答激活的促进剂。
全文摘要
本发明提供由选自硫代磷酸寡核苷酸及其衍生物的1种以上的化合物构成的由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂以及由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂或促进剂的筛选方法，该筛选方法包含在待测物质的存在下及非存在下将HMGB蛋白与标记核酸进行混合的混合步骤；对与标记核酸结合的HMGB蛋白进行定量的定量步骤；当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量少于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时，判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的抑制剂、当在待测物质的存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量多于在待测物质的非存在下与标记核酸结合的HMGB蛋白的量时、判定该待测物质为由HMGB蛋白介导的免疫应答激活的促进剂的判定步骤。
文档编号G01N33/50GK103096899SQ20118004444
公开日2013年5月8日 申请日期2011年9月14日 优先权日2010年9月17日
发明者谷口维绍, 柳井秀元 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
