专利名称：可用于检测汉赛巴尔通体的17-kDa多肽的重组片段和合成肽的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于检测哺乳动物包括人中的传染原的诊断测定领域。本文公开的具体实施方案包括17-kDa蛋白的新型重组片段和合成多肽，它们可用于汉赛巴尔通 # (Bartonella henselae)的中。
背景技术：
汉赛巴尔通体是猫抓病(CSD)的病原体(Bass等，1997 ； Bran ley等，1996 ； Chomel, 2000)并且也可以导致免疫低下患者中的杆菌性血管瘤病(BA) (Arvand等，1998 ； Asharaf 和 Letha，2002 ；Birtles 等，1991 ；Chomel, 1996)。CSD 常见于被受感染的家猫抓伤或咬伤的儿童和年轻人(Chomel，2000)并且其特征是发热和近卫淋巴结病(regional lymphadenopathy)。正常情况下，该病在约三(3)个月内自行消退。然而，在免疫低下患者中，巴尔通体感染经常表现为更加严重且威胁生命的疾患，包括BA、心内膜炎、脑病和肺病 (Margileth 和 Baehren，1998 ；Regnery 和 Tappero，1995)。BA 的特征是皮肤和皮下血管病变，其中细菌侵袭内皮细胞导致血管瘤。BA最初描述于感染人免疫缺陷病毒的患者中并且已经延伸至包括患有累及不同器官诸如骨、肝和脾的增生性血管病变的患者(Regnery和 Tappero,1995)。汉赛巴尔通体通过分子和血清学检测进行鉴定(Eskow等，2001)。通过PCR扩增对细菌基因进行分子鉴定仅适用于具有适当设备、专家和质量控制规程的实验室。PCR可用于早期感染期间的检测，其中细菌仍然存在于外周血流中。通过PCR的分子检测被推荐用于手术切除的感染的心脏瓣膜，但对于外周血样品不太灵敏，其原因是病原体生物可利用度低。血清学目前是用于确定巴尔通体感染的最常用的诊断测试(Houpikian和 Raoult, 2002, 2003 ；Sander 等，2001)。通过培养对此难养生物(fastidiousorganism)进行细菌分离很困难，因为过长的孵育期导致低灵敏度，尤其对于接受抗生素治疗的患者(Agan 和 Dolan, 2002 ；La Scola 和 Raoult,1999)。免疫荧光测定(IFA)是用于检测汉赛巴尔通体接触的最常用的血清学测试。其是高度主观的测试，并且因此易于由那些执行测试的人作出错误的解释。在不同实验室中观察的差异性的灵敏度常常导致血清学结果解释的变化(Amerein等，1996 ；Bergmans等， 1997 ；Fournier 等，2002)。缺少关于表征汉赛巴尔通体的抗原的信息已经极大地阻碍了开发用于检测汉赛巴尔通体的灵敏的和特异的测定。美国专利号5，736，347描述了 17_kDa蛋白的鉴定 (Anderson等，1995 ；Sweger等，2000)，所述蛋白代表汉赛巴尔通体中据信在人中诱发抗体应答的少数已表征的抗原之一。然而，‘347专利未能提供全长17-kDa蛋白的灵敏度和特异性。仅进行了 PCR斑点印迹杂交和IFA检测测定，因此不能肯定地确定17-kDa蛋白可能是 ELISA测定中的良好的检测抗原，尤其对于IgM。因此，17-kDa蛋白是否能够用作检测IgM 应答的抗原远未明确，更不用说17-kDa蛋白上负责免疫原应答的一个或多个结构域。因此，对于改进的用于检测汉赛巴尔通体的测定和方法一直存在需求。本发明解决了现有技术的不足之处并且提供了出人意料的发现，即17-kDa蛋白C-末端上的长度跨越 10个氨基酸的单个结构域，对于结合获自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清中存在的抗体是必不可少的。
发明内容
本发明提供了可用于检测汉赛巴尔通体的汉赛巴尔通体的多肽片段。本发明提供了重组和合成多肽以及在检测对汉赛巴尔通体特异的抗体中使用它们的方法。所述多肽、 方法和试剂盒可用于检测最近的和/或正在发生的汉赛巴尔通体感染，它们可以用于诊断猫抓病(CSD)。在一个方面，本发明提供了一种具有如SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列的合成多肽，其中所述合成多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的 IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。SEQ ID NO :22的多肽含有10 个氨基酸的区段(即，EKLEKSDVRL)，该区段被认为对于SEQ ID NO 22多肽与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应但不与IFA血清阴性的血清反应是必不可少的 (但非足够的)。在另一个方面，本发明提供了合成多肽，其中所述合成多肽包含氨基酸置换、缺失或添加。所述置换可以是保守氨基酸置换。所述置换、缺失或添加可以涉及单个氨基酸或多个氨基酸。优选的实施方案包括具有氨基酸置换、缺失或添加的SEQ ID N0:22。更优选地，本发明提供合成多肽的氨基酸修饰(即，SEQ ID NO :24、25、26、27、28、29、30、31和32)。在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO 24, SEQ ID N0:25和SEQ ID NO 26组成的组的氨基酸序列的合成多肽。在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO :27所示的氨基酸序列的合成多肽。在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列的合成多肽。在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO :30和SEQ ID NO 31组成的组的氨基酸序列的合成多肽。还在另一个方面，本发明提供了一种包含如SEQ ID NO :10中所示的氨基酸序列的重组多肽，其中所述重组多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。在另一个方面，本发明提供了重组多肽，其中所述重组多肽包含氨基酸置换、缺失或添加。所述置换可以是保守氨基酸置换。所述置换、缺失或添加可以涉及单个氨基酸或多个氨基酸。优选的实施方案包括具有氨基酸置换、缺失或添加的SEQ ID NO=IO0更优选地，本发明提供重组多肽的氨基酸修饰(即，SEQ ID NO :42、43、44和45)。在另一个方面，本发明提供了具有选自由SEQ ID NO 42和SEQ ID NO 43组成的组的氨基酸序列的重组多肽。在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO :44中所示的氨基酸序列的重组多肽。在另一个方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO :45中所示的氨基酸序列的重组多肽。还在另一个方面，本发明提供了包含具有如SEQ ID NO 9中所示的核苷酸序列的分离的多核苷酸的载体。所述载体还包含与所述分离的多核苷酸可操作地连接的DNA转录启动子。在另一个方面，所述载体选自由pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 组成的组，且所述启动子选自由Iac启动子、trp启动子和tac启动子组成的组。在另一个方面，本发明提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含具有如SEQ ID N0:9中所示的核苷酸序列的分离的多核苷酸。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌 (E.coli)。示例性的大肠杆菌包括 NovaBlue、BL21(DE3)或 BL21pLsS (DE3)。还在另一个方面，本发明提供了一种制备具有如SEQ ID No 10、SEQ IDNO 42、SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 44或SEQ ID NO :45中所示的氨基酸序列的重组多肽的方法，其包括以下步骤(a)将分离的多核苷酸引入至宿主细胞中，所述分离的多核苷酸具有如SEQID NO 9中所示的多核苷酸序列；和(b)使所述宿主细胞在培养基中在合适的条件下生长以容许产生所述重组多肽； 和(c)分离所述重组多肽。在另一个方面，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中对汉赛巴尔通体特异的抗体的方法。示例性的检测来自哺乳动物的生物样品中对汉赛巴尔通体特异的抗体的方法包括下列的步骤使根据本公开的重组多肽结合在固相载体上；使结合的重组多肽与所述样品接触，如果所述样品中存在所述抗体，则形成抗体-抗原复合物；洗掉未结合的免疫球蛋白；并检测任何形成的抗原-抗体复合物的存在，诸如通过使这样的复合物与能够引起可视化反应的二抗接触，所述可视化反应诸如底物的颜色改变。在另一个方面，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤(a)将合成多肽固定在固相载体上，其中所述合成多肽具有选自由SEQ IDNO :24、 SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO :30、SEQID NO 31 和 SEQ ID NO 32组成的组的氨基酸序列；(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的合成多肽；(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和(d)检测所述结合的抗体，
其中所述结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。优选地，所述哺乳动物是人。还在另一个方面中，本发明提供了一种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤(a)将重组多肽固定在固相载体上，其中所述重组多肽具有如SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列；(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的合成多肽；(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和(d)检测结合的抗体，其中结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。优选地，哺乳动物是人。在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据示例性实施方案的试剂盒包含根据本公开的肽和在根据本公开的方法中使用所述肽的说明书。在另一个方面，本发明提供了一种可用于检测汉赛巴尔通体的试剂盒，所述试剂盒包含(a)具有如SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列的多肽；禾口(b)在ELISA测定中使用所述多肽的说明书。
图1描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的核苷酸和氨基酸序列。图2描绘了在巴尔通体细菌(Bartonella bacteria)中IV型分泌系统的组装的示意图(摘自 Shamaei-jTousi 等，J. Bact. 186 (14) :4796-4801，2004)。根据此模型，virB2 蛋白的主体存在于外膜外，并且17-kDa (即，virB5)蛋白包埋在周质膜内部。图3描绘了显示全长17-kDa蛋白的可接近性图(accessibility plot)。显示了不同重组片段之间的关系和它们的可接近性。图4描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段1的核苷酸和氨基酸序列。图5是用于克隆和表达其中表达的17-kDa片段的重组多肽的载体的示意图。图6是pET30EK/LIC载体中的17_kDa片段的1 %琼脂糖凝胶分析，显示来自转化的大肠杆菌细胞的环状和线性化质粒DNA样品的移动。图7描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段2的核苷酸和氨基酸序列。图8描绘了汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段4的核苷酸和氨基酸序列。图9描绘了本发明的汉赛巴尔通体中17-kDa蛋白的重组片段3的核苷酸和氨基酸序列。图10是显示转化的大肠杆菌细胞中重组片段3的诱导表达的考马斯蓝染色的SDS 电泳凝胶。图11描绘了表达后17-kDa重组蛋白片段的纯化图解。图12是来自小规模纯化重组片段3蛋白的每个步骤的洗脱样品的考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶。
图13是来自大规模纯化重组片段3蛋白的每个步骤的洗脱样品的考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶。图14A是使用作为包被抗原的重组片段3和IFA阴性血清的ELISA测定的光学读出数据的图。图14B是使用作为包被抗原的重组片段3和IFA阳性血清的ELISA测定的光学读出数据的图。图15是比较作为包被抗原的重组片段3与12个IFA阳性血清和6个IFA阴性血清中的全长17-kDa蛋白的ELISA测定的光学读出数据的图。图16描绘了多种合成多肽和重组17-kDa蛋白片段之间的关系。图17是用IFA阳性和IFA阴性血清比较作为包被抗原的肽3C㈧和肽3C-CS1⑶ 的ELISA测定的光学读出数据的图。图18描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对(固定的)17_kDa多肽的反应性的散点图(dot plot) ((A)描绘了肽3C;(B)描绘了肽3C-CS3 ;(C)描绘了肽3C_Del ； 和(D)描绘了肽3C-RD)。图19是合成多肽:3B、3C和3D的受试者工作特征曲线比较(ROC)。图20是全长17-kDa、重组片段3、合成肽3B、3C和3D的受试者工作特征曲线比较 (ROC)。图21描绘了图示每个患者的血清对合成多肽肽3C(A)和肽3E⑶的反应性的散点图。图22描绘了 NCBI和本发明之间17_kDa片段3的氨基酸序列的比较。图23描绘了 17-kDa片段3及其突变体的氨基酸序列。图24是通过Kpn I限制性酶线性化的17-kDa片段3突变克隆质粒的琼脂糖凝胶。图25是显示不同的转化大肠杆菌克隆(A和B)中17-kDa片段3各种突变的诱导表达的考马斯蓝染色的SDS电泳凝胶。图26是显示17-kDa片段3和突变蛋白(可溶的相对于包含体)的纯化的考马斯蓝染色的SDS PAGE。图27是显示17-kDa片段3保守突变E (13)D的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的 SDS PAGE。图28是显示17-kDa片段3保守突变L(16) V的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的 SDS PAGE。图29是显示17-kDa片段3缺失突变AQ(Il)的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的 SDS PAGE。图30是显示17-kDa片段3插入突变+V(17_18)的Ni-NTA纯化的考马斯蓝染色的 SDS PAGE。图31描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17-kDa多肽、17-kDa片段3保守突变(固定的)的反应性的散点图(㈧描绘了 17-kDa全长；(B)描绘了保守突变E(13) D ； (C)描绘了保守突变L(16) V ；和(D)描绘了所有三种多肽的R0C)。图32描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17_kDa多肽、17_kDa片段3、 和缺失突变(固定的)的反应性的散点图((A)描绘了 17-kDa全长；(B)描绘了 17-kDa片段3 ;(C)描绘了缺失突变AQ(Il)；和⑶描绘了所有三种多肽的R0C)。图33描绘了图示在ELISA测定中每个患者的血清对17_kDa多肽、17_kDa片段3、 和插入突变(固定的)的反应性的散点图(㈧描绘了插入突变+V(17-18) ； (B)描绘了所有三种多肽的R0C)。
具体实施例方式从下面对优选实施方案的描述并结合附图可以更好地理解本发明。对于本领域那些技术人员应当显而易见的是本文提供的本发明的所述实施方案仅是示例性的和说明性的且非限制性的。其改型的大量实施方案被认为包括在本发明及其等同形式的范围内。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用合并。定义贯穿本说明书使用的多个术语应当具有本文给出的定义。如本文所使用，术语“ 17-kDa”是指具有如SEQ ID NO :2 (登记号YP_034054)中所示的氨基酸序列的多肽。该多肽代表汉赛巴尔通体Houston-I株中的virB5蛋白(IV型分泌性蛋白系统中的12种蛋白质之一)。本发明人显示在ELISA测定中17-kDa多肽结合存在于巴尔通体患者血清中的抗体。如本文所使用，汉赛巴尔通体Houston-I株中的17_kDa基因具有如SEQ IDNO 1(登记号U23447)中所示的核苷酸序列。如本文所使用，术语“ELISA”是指“酶联免疫吸附测定”且是一种用于检测样品中抗体或抗原的存在的生化技术。如本文所使用，术语“IFA”是指免疫荧光测定。“来自患者的IFA血清阳性的血清” 是指针对已经感染了汉赛巴尔通体的细胞显示阳性免疫荧光染色的血清(获自患者)。“来自患者的IFA血清阴性的血清”是指针对已经感染了汉赛巴尔通体的细胞显示阴性免疫荧光染色的血清(获自患者)。如本文所使用，术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可互换使用。如本文所使用，术语“重组多肽”是指经由使用已经通过引入异源核酸被修饰的载体由宿主细胞重组表达的多肽。如本文所使用，“合成多肽”是指经化学合成的多肽(非天然存在的多肽)。为了本发明的目的，这些多肽意在包涵多肽变体，只要它们在ELISA测定中仍然具有结合存在于巴尔通体感染患者中的抗体的能力。本领域普通技术人员要理解的是，这些多肽的氨基酸序列变体可以包括氨基酸的(i)保守置换，( )置换，(iii)添加和 (iv)缺失。要进一步理解的是，具有充分高的％氨基酸序列同一性(例如，>90%)的多肽变体意在包涵在本发明的范围内，条件是该多肽保持其抗体结合能力。如本文所使用，术语“％氨基酸序列同一性”被定义为与17-kDa多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟练技术人员公知的多种方式来实现，例如，使用公共可获得的计算机软件诸如BLAST、 BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR)软件。如本文所使用，术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何脊椎动物，其具有或多或少地被毛发遮盖的身体，用来自乳腺的乳抚养幼仔，并且生出活幼仔，不包括产卵的单孔目动物。优选地，哺乳动物是人。
如本文所使用，术语“引物”是指可以通过模板引导的聚合而延伸的核苷酸序列。 为了本申请的目的，术语“核苷酸序列”意在包括DNA或其修饰体。如本文所使用，术语“生物样品”可以包括但不限于来自哺乳动物诸如人或家畜的血液(例如，全血，血清，等)、脑脊液、滑液等。从生物样品中提取核酸对于本领域熟练技术人员来说是已知的。如本文所使用，术语“R0C”是指受试者工作特征分析(Receiver OperatingCharacteristics Analysis)。ROC分析是用于评价临床检验的标准统计学工具。 对于假定为判定阈(即，区分两组响应的截止值)的判别变量的每个观察值ROC根据“灵敏度”和“1-特异性”评估系统的性能。对于ELISA，截止值可以在一定范围的观察值(即， OD45tlIim读数)内变换，并且可以对这些值的每一个建立灵敏度和1-特异性。灵敏度和特异性的最佳配对是在西北方向上具有最大距离的点。本发明提供了重组多肽和合成多肽，它们当在ELISA测定中测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。17-kDa蛋白上的C-末端结构域和抗体识别在某些实施方案中，17-kDa多肽的蛋白序列通过亲水性分析来表征(例如，Hopp 和 Woods，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :3824)。17-kDa 的亲水性图用来鉴定疏水和亲水区域，其指示隐匿在折叠的多肽内部的区域，和在多肽的外部上可接近的区域。可以使用本领域中可获得的计算机软件程序来实现对预测结构的操作。ELISA测定中抗体结合程度提供关于结构同源性的信息，和关于与用来生成在抗体识别中具有特异性的片段的多肽部分对应的区域的可接近性的信息。本发明人已经在17-kDa蛋白的C-末端上鉴定了 10个氨基酸的区域，该区域拥有所需的结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。在一个实施方案中，本发明提供了具有 EKLEKSDVRLA(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列的多肽。因此，包含这10个氨基酸残基的多肽代表可以在汉赛巴尔通体的检测中例如，在ELISA测定中使用的活性多肽。SEQ ID NO 33 的多肽本身不足以获得结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。然而，SEQ ID N0:22的多肽(其包含SEQ ID NO 33的10个氨基酸)拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。 因此，SEQ ID NO 33的10个氨基酸是必不可少的但不足以获得结合IFA阳性血清中存在的抗体的能力。重组多肽本发明具体地考虑了重组多肽和合成多肽的表达和制备，它们的特征在于能够结合IFA阳性患者血清中存在的抗体。在一个实施方案中，因此本发明包括具有图1中所示的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)的分离的核酸，和其简并变体，和其片段。由本文所述的核酸表达的重组蛋白包括图1中所示的那些蛋白(SEQ IDNO :2)，以及包含修饰的氨基酸的变体。 本文所述的重组蛋白拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体(且不与IFA阴性血清反应)的能力，并且它们含有10个氨基酸残基(SEQ ID N0:33)。在一个实施方案中，本发明提供了包含如SEQ ID NO. 10中所示的氨基酸序列的重组多肽。要理解，这些重组多肽包括变体。一种类型的变体包括重组多肽的氨基酸修饰； 诸如，例如，氨基酸的置换、缺失或添加。另一种类型的变体包括SEQ IDN0:10的片段。变体保留了针对来自感染巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清的抗体结合能力并且不与来自感染巴尔通体的患者的IFA血清阴性的血清反应。这样的重组多肽包涵在本发明的范围内。在一个实施方案中，可以采用保守氨基酸置换，例如，用天冬氨酸置换谷氨酸；用亮氨酸置换异亮氨酸；用丙氨酸置换甘氨酸或缬氨酸、或任何不同氨基酸(divergent amino acid)，用组氨酸置换精氨酸或赖氨酸，和用色氨酸置换酪氨酸和/或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，可以采用单个氨基酸的添加和缺失。本领域普通技术人员还要理解，在不改变当在ELISA测定中测试时肽结合抗体的能力的情况下，可以从多肽的每一端或两端，或从多肽的内部包含或缺失几个氨基酸。17kDa的重组表达载体和宿主转录和翻译控制序列是DNA调控序列，诸如启动子、增强子、终止子等，它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录和翻译时，该DNA序列与该表达控制序列“操作性连接”或“可操作地连接”。术语“操作性连接”包括在要表达的DNA序列前面具有适当的起始信号(例如，ATG)并且保持正确的阅读框从而容许在该表达控制序列的控制下表达该DNA序列并产生由该DNA序列编码的所需产物。如果期望插入至重组DNA分子中的基因不包含适当的起始信号，这样的起始信号可以插入至基因的上游(5')并位于该基因的阅读框中。“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义本发明的目的，启动子序列通过转录起始位点结合在其 3'末端并且向上游(5'方向)延伸以包含以本底之上的可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内会发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶Sl作图方便地确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。在一个实施方案中，本发明提供了本文公开的DNA序列的表达。如本领域中所公知的，DNA序列可以通过将它们操作性地连接至合适的表达载体中的表达控制序列并且采用该表达载体来转化合适的单细胞宿主来表达。当然，本发明的DNA序列与表达控制序列的这种操作性连接包括在DNA序列上游的正确阅读框中提供起始密码子ATG(如果尚未是 DNA序列的一部分的话)。可以采用大量的宿主/表达载体组合来表达本发明的DNA序列。 例如，可用的表达载体可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。合适的载体包括pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 等。启动子包含Iac启动子、trp启动子和tac启动子。在一个实施方案中，宿主细胞包含载体，所述载体包含本发明的分离的多核苷酸。 示例性的宿主细胞包括大肠杆菌(E. coli.)。各种大肠杆菌菌株包括，例如，NovaBlue株、 BL21 (DE3)或 BL2IpLsS(DE3)。要理解的是，并非所有载体、表达控制序列和宿主都将同样良好地发挥作用以表达本发明的DNA序列。然而，在不背离本发明的范围的前提下，本领域熟练技术人员将能够选择适宜的载体、表达控制序列和宿主，无需过多地进行试验来实现所需的表达。例如，在选择载体时，必需考虑宿主，因为载体必需在其中发挥作用。也要考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，和由该载体编码的任何其他蛋白诸如抗生素标志物的表达。在选择表达控制序列时，通常要考虑多种因素。这些因素包括，例如，体系的相对强度，其可控性，和其与待表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别地关于可能的二级结构。选择合适的单细胞宿主要考虑，例如，它们与所选择的载体的相容性，它们的分泌特性，它们正确地折叠蛋白的能力，和它们的发酵要求，以及由待表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性，和表达产物的纯化的简易性。考虑到这些和其他因素，本领域熟练技术人员将能够构建多种载体 /表达控制序列/宿主组合，这些组合将在发酵时或在大规模动物培养时表达本发明的DNA 序列。合成多肽本发明提供了合成多肽，所述合成多肽具有结合IFA阳性患者血清中存在的抗体并且不与IFA阴性血清反应的特性。在一个实施方案中，本发明包括具有至少SEQ ID NO 33中所示的氨基酸结构的合成多肽。要理解该合成多肽的长度可以为 10至 30个氨基酸。优选地，合成多肽可以包含15至25个氨基酸。优选合成多肽可以包含18个氨基酸残基。优选地，合成多肽具有SEQ ID NO 22中所示的氨基酸序列及其变体。合成多肽变体可以包含氨基酸的置换、缺失或添加。优选地，置换可以包括保守氨基酸置换。优选地， 缺失或添加可以包括单个氨基酸或若干个氨基酸。在一个实施方案中，合成多肽是SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :26、SEQID NO :27、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31 或 SEQ ID NO :32。本文所述的合成蛋白拥有结合IFA阳性血清中存在的抗体(且不与IFA阴性血清反应)的能力，并且它们包含10个氨基酸残基(SEQ ID N0:33)。ELISA 测定对IFA血清阳性的血清中的抗体结合的检测可以通过本领域中已知的技术来实现，例如，ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测一抗上的标记来评估。在另一个实施方案中，一抗通过检测二抗或二级试剂与一抗的结合来评估。在另外的实施方案中，标记二抗。本领域中已知有许多方式用于在免疫测定中检测结合，且这些方式包括在本发明的范围内。例如，为了选择重组或合成的多肽的特异性表位，可以在ELISA测定中评估抗体结合，其中所述多肽或其片段包含这样的表位。采用重组和合成的17-kDa多肽的诊断试剂盒本发明提供了一种用于诊断CSD的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒是包含本文所述的重组多肽或合成多肽、包括一抗或二抗在内的检测试剂、和包括酶底物和显色试剂在内的其他必需试剂的ELISA试剂盒。可以与这样的试剂盒一起存在的其他组分包括说明书，所述说明书详细说明了使用本发明的重组/合成多肽对汉赛巴尔通体的检测步骤。本发明的诊断试剂盒还包括阳性和阴性血清对照。本发明的诊断试剂盒开可以用于诊断涉及汉赛巴尔通体的其他感染性疾病诸如杆菌性血管瘤病(bacillary angiomatosis)。作为说明且不作为限制地提供下列的实施例。试验研究实施例1 17-kDa重组片段17-kDa基因(图1)最初在1995年被克隆(Anderson等，1995)；然而，关于该蛋白的功能了解很少。17-kDa基因位于与土壤杆菌属(Agrobacterium)中的virB毒力操纵子同源的基因簇内(Padmalayam等，2000)。编码的17_kDa蛋白是汉赛巴尔通体中的IV型分泌系统(TIVSS)的一种成分(图2)，并且其是已知介导内皮细胞的侵袭、促炎活化和抗凋亡保护的膜结合蛋白复合物(khmid等，2004)。从其氨基酸序列(图1)，推断17-kDa蛋白缺少跨膜结构域，不拥有信号序列，并且被认为是一种可溶性蛋白。在汉赛巴尔通体侵袭人内皮细胞后证明在其中有17-kDa蛋白的诱导(Schmiederer等，2001)。设计使用酵母双杂交系统来阐明TIVSS的亚基之间的相互作用的研究证明virB5(即，17-kDa)和virB7之间的物理结合作用(Shamaei-Tousi等，2004)。以前已经显示全长17-kDa多肽可以在Wfestern印迹(美国专利号5，736，；347)和 ELISA测定(Loa等，2005)中用于检测对汉赛巴尔通体特异的抗体。因为对此人类病原体鉴定的其他免疫原性抗原非常少，因此对此蛋白的一个或多个表位进行进一步的分析以努力设计更有效的用于检测汉赛巴尔通体感染的方法、测定和试剂盒。使用电脑模拟(in silico)的方式，生成％可接近性图(Accessibility Plot) (参见，图幻。该图显示了具有高％可接近性的两( 个区域的图形表示，表明这两个区域可能暴露在17-kDa蛋白表面上。具有高％可接近性的第一个区域包括从约#20至约#80 的氨基酸；并且具有高％可接近性的第二个区域包括从约#110至约#140的氨基酸。跨越约#80至约#110氨基酸的区域显示低％可接近性。基于％可接近性图，制备两个(2)重组片段，并且它们跨越这两个具有高％可接近性的区域。然后在ELISA测定中使用这两个制备的重组片段来测定它们结合感染汉赛巴尔通体的患者(即，IFA血清阳性)中存在的抗体的能力。因为跨越氨基酸#20至#80的区域具有最高的％可接近性，通过PCR克隆制备重组片段1 (参见，图3和4 ；详见下面的实施例幻。片段1跨越氨基酸#13至氨基酸#74(从N末端计)并且含有总计62个氨基酸。 片段1的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQID NOs 3和4)绘制在图4中。另外，制备片段2以跨越高％可接近性区域。片段2跨越氨基酸#63至氨基酸 #133。片段2的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO :5和6)描绘在图7中。制备片段4以覆盖低％可接近性区域，作为对照。片段4跨越氨基酸#81至氨基酸#109。片段4 的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 7和8)描绘在图8中。与片段2相比，制备片段3以覆盖具有高％可接近性的第二区域。片段3含有 17-kDa蛋白的C-末端的最后15个氨基酸。当与片段2比较时，片段3缺少片段2的N-末端的14个氨基酸。片段3跨越氨基酸#77至氨基酸#148。片段3的核苷酸和氨基酸序列 (SEQ ID NOs 9和10)描绘在图9中。实施例2 17-kDa重组片段的克隆生成总计四个⑷重组片段(参见，图3)。基于编码17-kDa蛋白(SEQ ID NO 2) 的基因的DNA序列(SEQ ID NO 1)，制备四⑷组正向和反向引物以从汉赛巴尔通体的基因组DNA中扩增17-kDa蛋白的4个片段(参见，表1)。每个引物包括5'端和3’端上的 LIC延伸以促进定向和框内克隆至pET30Ek/LIC载体中(在下面详述)。表1列举了这四 (4)组正向和反向引物的核苷酸序列。魁用于牛成编码汉蕃巴尔通体的17-kDa g白的四(4)个重組片段的多核苷Il 的引物
权利要求
1.一种具有如SEQ ID NO :22中所示的氨基酸序列的合成多肽，其中所述合成多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)的患者的IFA 血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。
2.根据权利要求1所述的合成多肽，其中所述合成多肽包含氨基酸的置换、缺失或添加。
3.根据权利要求2所述的合成多肽，其中所述置换是保守氨基酸置换。
4.根据权利要求3所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有选自由SEQIDNO 24, SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26组成的组的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有如SEQID N0:27中所述的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的合成多肽，其中所述缺失是单个氨基酸缺失。
7.根据权利要求6所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有如SEQID N0:32中所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求2所述的合成多肽，其中所述添加是氨基酸添加。
9.根据权利要求8所述的合成多肽，其中所述合成多肽具有选自由SEQIDN0:30和SEQ ID NO 31组成的组的氨基酸序列。
10.一种具有如SEQ ID NO 10中所示的氨基酸序列的重组多肽，由此所述重组多肽当在ELISA测定中进行测定时与来自感染汉赛巴尔通体的患者的IFA血清阳性的血清反应且不与IFA血清阴性的血清反应。
11.根据权利要求10所述的重组多肽，其中所述重组多肽还包括氨基酸的置换、缺失或添力口。
12.根据权利要求11所述的重组多肽，其中所述置换是保守氨基酸置换。
13.根据权利要求12所述的重组多肽，其中所述重组多肽具有选自由SEQIDNO :42和 SEQ ID NO :43组成的组的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的重组多肽，其中所述缺失是单个氨基酸缺失。
15.根据权利要求14所述的重组多肽，其中所述重组多肽具有如SEQIDNO 44中所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求11所述的重组多肽，其中所述添加是单个氨基酸添加。
17.根据权利要求16所述的重组多肽，其中所述重组多肽具有如SEQIDNO :45中所示的氨基酸序列。
18.—种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤(a)将合成多肽固定在固相载体上，其中所述合成多肽具有选自由SEQIDNO :24、SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 32 组成的组的氨基酸序列；(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的合成多肽；(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和(d)检测结合的抗体，其中所述结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。
19.一种检测来自哺乳动物的生物样品中的汉赛巴尔通体的方法，其包括以下步骤(a)将重组多肽固定在固相载体上，其中所述重组多肽具有选自由SEQIDNO :10、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO 44 和 SEQ ID NO 45 组成的组的氨基酸序列；(b)将生物样品加入至所述载体上以容许存在于所述生物样品中的抗体结合于所述固定的重组多肽；(c)洗涤以去除任何未结合的抗体；和检测结合的抗体，其中所述结合的抗体的存在指示所述哺乳动物被汉赛巴尔通体感染。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
22.—种载体，其包含具有如SEQ ID NO :9中所示的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的载体，其中所述载体还包含与所述分离的多核苷酸可操作地连接的DNA转录启动子。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体选自由pET、pENTR和pCR 8/GW/T0P0 组成的组，且所述启动子选自由Iac启动子、trp启动子和tac启动子组成的组。
25.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体是pET且所述启动子是Iac启动子。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求22所述的载体。
27.根据权利要求沈所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌是NoVaBlUe、BL21(DE3)或 BL21pLsS(DE3)。
29.一种制备具有如SEQ ID No :10中所示的氨基酸序列的重组多肽的方法，其包括以下步骤(a)将分离的多核苷酸引入至宿主细胞中，所述分离的多核苷酸具有如SEQIDN0:9中所示的多核苷酸序列；和(b)使所述宿主细胞在培养基中在合适的条件下生长以容许产生所述重组多肽；和(c)分离所述重组多肽。
30.根据权利要求四所述的方法，其中所述重组多肽还包含氨基酸的置换、缺失或添加的修饰，其中所述修饰的重组多肽具有选自由SEQ ID NO 42, SEQID NO 43, SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO 45组成的组的氨基酸序列。
31.一种用于检测汉赛巴尔通体的试剂盒，所述试剂盒包含(a)根据权利要求1所述的合成多肽；和(b)在ELISA测定中使用所述合成多肽的说明书。
32.一种用于检测汉赛巴尔通体的试剂盒，所述试剂盒包含(a)根据权利要求10所述的重组多肽；和(b)在ELISA测定中使用所述重组多肽的说明书。
全文摘要
本发明内容描述了汉赛巴尔通体的重组和合成多肽以及用于检测对汉赛巴尔通体特异的抗体的相关方法和试剂盒。17-kDa多肽、方法和试剂盒可用于检测最近的和/或正在发生的汉赛巴尔通体感染，它们可以用于诊断猫抓病(CSD)。
文档编号G01N33/53GK102197045SQ200980142311
公开日2011年9月21日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月22日
发明者E·莫戴察, L·黄, 约翰·霍因, 马丁·阿德尔森 申请人:医学诊断实验室有限公司
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