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专利名称：一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于液相色谱质谱技术开发的全血中他克莫司定量检测试剂盒， 更具体地说是采用液相色谱质谱技术对全血中他克莫司进行高灵敏度定量检测的方法。本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。
背景技术：
他克莫司(tacrolimus，简称Π(506)是从链霉菌属培养物中分离得到的大环内酯 类新型免疫抑制剂，能有效抑制T淋巴细胞激活。Π(506与内源性细胞受体结合，形成一个 亲免素复合物，从而发挥药理作用。目前Π(506已在肝、肾、心、胰等器官移植中广泛用于抗 排斥及自身免疫系统相关疾病的治疗。Π(506的血药浓度与免疫抑制强度和毒副反应相关， 不仅治疗窗窄而且药动学个体差异大，临床使用冊506需要进行血药浓度监测。目前临床常规监测Π(506全血浓度的方法主要有微粒子捕捉酶免疫发光技术 (microparticle enzyme immunoassay, MEΙΑ)禾口酶联吸附免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。ELISA法和MEIA法对体内FK506及其代谢产物产生交叉 免疫反应，使实际测得结果为冊506及其代谢物之和。液相色谱质谱技术(LC-MS/MQ是近年来迅速发展的定量分析技术，具有高选择 性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内药物分析、新生儿遗传 疾病筛查和药物代谢研究等领域的实用方法。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简 便、易于推广的Π(506血药浓度的LC-MS/MS检测试剂盒，使其能广泛应用于我国Π(506临 床研究和常规血药浓度监测中，将有助于提高Π 506检测质量、促进检测方法标准化和规 范化。

发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，以满足他克莫 司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。技术方案本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定人全血样本中Π(506浓度的新型试剂盒。试 剂盒以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，取上清液进行 LC-MS/MS检测，记录Π(506和内标的峰面积。采用内标法，根据待测样本中的Π(506/内标 峰面积比值即可计算出Π(506浓度。测定结果为全血样本中Π(506浓度。本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤1.他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制精密称取 5mg他克莫司对照品，置IOmL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，配制成0. 5mg/mL的他 克莫司储备液。精密量取他克莫司储备液0. 5mL，置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，配 制成5 μ g/mL的他克莫司母液。分别精密量取他克莫司母液0、0. 01,0. 03,0. 1,0.3,0. 5mL,分别置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司标准曲线样本浓度分别为0、 l、3、10、30、50ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。分别精密量取他克莫司母液0. 025、0. 1、 0. 4mL,置50mL容量瓶中，加全血稀释至刻度，所配制他克莫司质控样本浓度分别为2. 5、 10、40ng/mL，分装，贴签标记，完成操作。2.样本处理液的配制精密称取14. 38g ZnSO4 · 7H20，置500mL容量瓶中，加蒸馏 水溶解，并稀释至刻度，即为lOOmmol/L硫酸锌溶液，分装，贴签标记，完成操作。3.内标液的配制精密称取Img子囊霉素对照品，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解， 并稀释至刻度，配制成20 μ g/mL的储备液，精密量取上述子囊霉素储备液lmL，置IOOOmL 容量瓶中，加乙腈溶解，并稀释至刻度，即为20ng/mL子囊霉素溶液，分装，贴签标记，完成 操作。4.流动相调节液的配制精密称取38. 5g乙酸铵，置500mL容量瓶中，加蒸馏水溶 解，并稀释至刻度，即为lmol/L乙酸铵溶液，分装，贴签标记，完成操作。本发明的试剂盒使用方法如下精密取全血样本IOOyL置1.5mL EP管中，加入样本处理液100 μ L，再加入内标 液300 μ L，涡流混勻2min，静置30min，离心5min (12000rpm)，取上清液进样20 μ L进行 LC-MS/MS定量分析。有益效果本发明试剂盒采用LC-MS/MS定量检测全血中Π(506浓度，检测结果为Π(506原型 药物浓度，能更准确的说明药物浓度-效疗-不良反应三者之前的关系。同时，本发明试剂 盒首次实现Π(506定量检测技术国产化，可替代目前临床常规MEIA和ELISA法，用于服用 Π(506患者的血药浓度测定。它的推广应用将有助于提高Π(506检测质量、促进检测方法标 准化和规范化，使临床冊506血药浓度的监测更为快捷、准确、可靠。


图1他克莫司样本处理和检测过程图2他克莫司(A)和内标子囊霉素(B) [Μ+Η]+的二级全扫描质谱3LC-MS/MS测定人全血中他克莫司和内标子囊霉素的典型色谱图 A空白全血
B空白全血加入1. Ong · mL"1他克莫司和20ng · mL—1内标子囊霉的色谱图
C 口服给予他克莫司胶囊ang后Ih的全血样本
I.他克莫司(FK5O6)IL 子囊霉素(internal standard)图4他克莫司典型标准曲线图
具体实施例方式1、适用仪器液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。2、样本要求采集静脉全血样本，置于抗凝管中，血样采集后应立即放置于2 8°C冰箱存放备 测。
3、检验方法全血样本前处理精密取全血样本IOOyL置1.5mL EP管中，加入样本处理液100 μ L，再加入内标 液300 μ L，涡流混勻2min，静置30min，离心5min (12000rpm)，取上清液进样20 μ L进行 LC-MS/MS定量分析。质谱条件离子源电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压5500V;温度 5500C ；源内气体1 (GSl，N2)压力:45psi.；气体2(GS2，N2)压力55psi.；气帘气体(N2)压 力20psi.；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N2)压力=Medium;用于定量分析的 离子反应为m/z 821.3 —m/z 768. 3 (他克莫司，DP电压42V ;CE电压29eV)，用于定性考 察的离子反应为m/z 821.3 —m/z 576. 3 (他克莫司，DP电压42V ;CE电压33eV)，内标定 量离子对m/z809. 4 — m/z 756. 4 (子囊霉素，DP电压55V ；CE电压:31eV)。色谱条件色谱柱CW柱(10 X 4. 6匪，5 μ m 粒径)；流动相乙腈-流动相调节液蒸馏水稀释1000倍，梯度洗脱；流速1.20mL · mirT1 (分流)；柱温:60°C ；进样量20 μ L。表1梯度洗脱条件
权利要求
1.一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的标准曲线样 本、质控样本、样本处理液、内标液、流动相调节液组成。
2.根据权利1所述的全血他克莫司定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下 步骤(1)他克莫司储备液、他克莫司母液、标准曲线样本、质控样本的配制；( 样本处理 液硫酸锌溶液的配制；C3)内标液子囊霉素的配制；(4)流动相调节液乙酸铵的配制。
3.一种全血中他克莫司定量检测方法，包括(1)全血样本预处理取一定量的全血，加入一定量的样本处理液，加入内标溶液及蛋白沉淀剂，涡流，高速 离心取上清液。(2)液相分离a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；b.流动相乙腈；ImM乙酸铵溶液；等度或梯度洗脱；控制流速。(3)质谱测定电喷雾离子源，正离子方式。
4.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法，其特征在于用用硫酸锌处理全血 细胞，用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。
5.根据权利3所述的全血中他克莫司定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相 为乙腈ImM乙酸铵溶液；反相色谱等度或梯度分离。
全文摘要
本发明提供了一种高灵敏全血他克莫司定量检测试剂盒及其制备方法。以子囊霉素为内标，先用硫酸锌溶液处理全血样本，然后用乙腈沉淀，采用C18键合相硅胶为固定相，以乙腈-1mM乙酸铵为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测，离子选择通道分别为m/z 821.3→m/z 768.3(他克莫司)和m/z 809.4→m/z 756.4(内标子囊霉素)。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到1.0ng/ml，各项方法学指标均可满足他克莫司临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。
文档编号G01N30/06GK102141552SQ20101010247
公开日2011年8月3日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者刘丽宏, 吴诚, 姜合作, 李鹏飞, 童卫杭, 马萍 申请人:中国人民解放军第二炮兵总医院