专利名称：一种磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法
技术领域：
本发明属于荧光标记细胞技术，具体说一种磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞 的方法。
背景技术：
纳米技术是20世纪80年代末90年代初逐步建立并发展起来一门新兴的技术，并 在21世纪得到了迅速发展。纳米技术与生物技术、信息技术一起被看作是促进21世纪发展 的三大重要技术。纳米技术的应用前景贯穿了从以原子、分子为主体的微观领域、微观与宏 观的过渡区以及人类活动的宏观世界。与此同时，纳米尺度上的多学科交叉展现了纳米技 术巨大的生命力，迅速成为一个有广泛和潜在应用前景的技术领域。1993年，国际纳米科技 指导委员会将纳米技术划分为6个分支纳米电子学、纳米物理学、纳米化学、纳米加工学、 纳米计量学和纳米生物学。磁性荧光纳米粒子不仅具有良好的超顺磁性和表面易功能化等特点，而且利用荧 光可以定向识别并标记目标物质。磁性荧光粒子表面引入如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等多种 反应性功能基团，还可以通过共价键结合配体，使其与生物受体特异性结合从而在荧光显 微镜下观测其形态。目前，荧光标记技术使用的荧光素是异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、德克萨斯红、罗 丹明等。现有技术荧光标记蛋白质Marsshall法，利用蛋白质上的赖氨酸与荧光染料的N = C = S键结合形成复合物从而发出荧光。现有技术的缺点是赖氨酸与荧光染料的N = C =S键结合反应必须在pH8-9的碱性条件下进行，一旦环境条件和pH值改变，荧光素很容 易从蛋白质上解离下来，使得在荧光显微镜下难以准确观测其形态。因此发明一种利用磁性荧光纳米粒子与生物受体结合，在中性条件下进行荧光标 记；保持荧光素长期稳定的发光，提高标记效率，使得在荧光显微镜下准确观察其形态的磁 性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法是十分重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用磁性荧光纳米粒子与生物受体结合，在中性条件 下进行荧光标记；保持荧光素长期稳定的发光，提高标记效率；使得在荧光显微镜下准确 观察其形态的磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法。本发明的目的是这样实现的一种磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法，步骤如下(1)制备磁性荧光纳米粒子复合物A称取表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子，加入pH值6. 5-7. 5的磷酸缓冲液，超 声分散5_15min ；B向步骤A产物中加入0. 1-0. 5mol/L的N，N-二环己基碳酰亚胺缩合剂；37°C孵 育 10-25min ；
C向步骤B产物加入0. 05-0. 5mol/L的Y -氨基丁酸溶液，37°C孵育10_20min ；D将步骤C产物加入磁�。来斡肗，N- 二甲基甲酰胺和双蒸水洗涤磁粒2遍；E将步骤D所得磁粒加入青霉素和链霉素混合液，-20°C保存备用；(2)制备家蝇神经细胞悬液A取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置5-8分钟，浸入75%的酒精消毒；B将消毒过的家蝇，平放在表面皿上，切去头，收集家蝇头颅；C将家蝇头颅置入pH6. 5-7. 5的磷酸缓冲液，制成家蝇神经细胞悬液后通过80目筛，滤液备用；(3)磁性纳米粒子标记家蝇神经细胞A向家蝇神经细胞悬液，加入配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液；置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育15-30min ；B磁场下弃去清液，用pH6. 5-7. 5的磷酸缓冲液洗涤磁粒2次；C向上述磁粒加入pH6. 5-7. 5的磷酸PBS缓冲液、摇勻、制片、吹干，荧光显微镜下 观察细胞形态。本发明的要点是制备磁性荧光纳米粒子复合物，在中性条件下通过荧光标记家蝇 神经细胞表面的配体Y“氨基丁酸受体蛋白而标记家蝇的神经细胞。本发明磁性荧光纳米粒子复合物制备路线如下图所示 首先在N，N- 二环己基碳酰亚胺DCC催化下氨基修饰的磁性荧光纳米粒子与配体 Y “氨基丁酸GABA结合形成复合物；然后利用磁性荧光纳米粒子复合物标记并分离家蝇的神经细胞；标记过程在ρΗ =6. 5-7. 5的磷酸缓冲液媒介中进行。本发明荧光标记细胞的方法是通过荧光标记细胞壁表面特定的蛋白质而实现对 整个细胞的荧光标记。本发明使用的配体Y-氨基丁酸GABA的浓度为0.05-0. 5mol/L;N，N-二环己基碳 酰亚胺缩合剂DCC的浓度为0. 1-0. 5mol/L ；粒子孵育时间为10-30min。本发明向磁粒纳米粒子加入青霉素和链霉素混合液，是为了安全无菌保存。本发明的特点在于
(1)本发明制备的磁性荧光纳米粒子复合物表面经氨基功能化后与γ-氨基丁酸 GABA配体结合，根据配体与生物受体特异性结合原理与家蝇神经细胞表面的γ-氨基丁酸 GABA受体结合。(2)该荧光标记蛋白质过程在中性条件下进行。(3)该磁性荧光纳米粒子复合物能特异性的结合分离表面带有γ－氨基丁酸GABA 受体的家蝇的神经细胞，分离效率高。本发明的优点是1、中性条件荧光标记，能保持荧光素长期稳定发光；2、受体神经细胞，分离效率高；3、提高标记效率，荧光显微镜下形态观察准确。
图1为明光状态下磁性荧光纳米粒子标记的家蝇神经细胞图。图2为荧光激发状态下磁性荧光纳米粒子标记的家蝇神经细胞图。图3是磁性荧光纳米粒子复合物的原子力显微镜图。图4是磁性荧光纳米粒子复合物的透射电镜图。图5是磁性荧光纳米粒子复合物的振动样品磁强计(VSM)测试结果图。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
对本发明做进一步说明，但是本发明不受实施例的限制。实施例1 制备氨基修饰的磁性荧光纳米粒子复合物。称取一定量的表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子MFNP-NH2,加少量pH = 7. 4的 磷酸PBS缓冲液，超声分散5min后加入0. 2mol/L的N，N- 二环己基碳酰亚胺缩合剂DCC， 37°C孵育IOmin后，加入0. 2mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育15min后磁场 下依次用DMF和双蒸水洗涤磁粒2遍；磁粒加青霉素和链霉素混合液，-20°C保存待用。取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置数分钟后浸没于75%的酒精中消毒，小心 将家蝇平放在表面皿上去头。收集家蝇头颅，往其中加入pH = 7. 4的磷酸PBS缓冲液，制 成悬液后通过80目的筛子，滤液待用。取家蝇神经细胞悬液加少量配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育15min，磁场下弃去清夜，用pH =7.4的磷酸PBS缓 冲液洗涤磁粒2次后加少量磷酸PBS缓冲液，摇勻，制片，吹干后荧光显微镜下观察细胞形 态，见图1。结果显示表面有γ－氨基丁酸溶液GABA受体的家蝇的神经细胞被磁性荧光纳米 粒子分离并标记出来，明光下未见有未标记神经细胞，见图1 ；表明分离标记概率为100%。 在荧光显微镜下可见与MNFP结合的神经细胞因粒子中含有红色荧光素而显示红色。见图 2 ；被标记出来的细胞形态上为神经元细胞，细胞轮廓清楚，能看到明显的神经细胞轴突结 构。实施例2:
称取一定量的表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 6. 8 的磷酸PBS缓冲液，超声分散15min后加入0. 5mol/L的队^二环己基碳酰亚胺缩合剂00， 37°C孵育20min后加入0. 5mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁场 下依次用DMF和双蒸水洗涤磁粒。磁粒加青霉素和链霉素混合液，_20°C保存待用。取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置数分钟后浸没于75%的酒精中消毒，小心 将家蝇平放在表面皿上去头。收集家蝇头颅，往其中加入pH = 7. 0的磷酸PBS缓冲液，制成悬液后通过80目的筛子，滤液待用。
取家蝇神经细胞悬液加少量配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育20min，磁场下弃去清夜，用pH =7.0的磷酸PBS缓 冲液洗涤磁粒3次后，加少量磷酸PBS缓冲液，摇勻，制片，吹干后荧光显微镜下观察细胞形 态。分离效率80%。实施例3 称取一定量的表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 7. 5 的磷酸PBS缓冲液，超声分散15min后加入0. lmol/L的N，N-二环己基碳酰亚胺缩合剂DCC， 37°C孵育25min后加入0. 5mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育IOmin后磁场 下依次用N，N- 二甲基甲酰胺和双蒸水洗涤磁粒。磁粒加青霉素和链霉素混合液，-20°C保 存待用。取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置数分钟后浸没于75%的酒精中消毒，小心 将家蝇平放在表面皿上去头。收集家蝇头颅，往其中加入pH = 7. 5的磷酸PBS缓冲液，制 成悬液后通过80目的筛子，滤液待用。取家蝇神经细胞悬液加少量配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育30min，磁场下弃去清夜，用pH = 7. 5的磷酸PBS缓 冲液洗涤磁粒3次后加少量磷酸PBS缓冲液，摇勻，制片，吹干后荧光显微镜下观察细胞形 态。分离效率90%。实施例4 称取一定量的表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 6. 5 的磷酸PBS缓冲液，超声分散15min后加入0. 3mol/L的N，N-二环己基碳酰亚胺缩合剂DCC， 37°C孵育20min后加入0. lmol/L的Y -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁场 下依次用N，N- 二甲基甲酰胺和双蒸水洗涤磁粒。磁粒加青霉素和链霉素混合液，-20°C保 存待用。取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置数分钟后浸没于75%的酒精中消毒，小心 将家蝇平放在表面皿上去头。收集家蝇头颅，往其中加入pH = 6. 5的磷酸PBS缓冲液，制 成悬液后通过80目的筛子，滤液待用。取家蝇神经细胞悬液加少量配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育30min，磁场下弃去清夜，用pH-6. 5的磷酸PBS缓冲液 洗涤磁粒2次后，加少量磷酸PBS缓冲液，摇勻，制片，吹干后荧光显微镜下观察细胞形态。 分离效率90%。实施例5 称取一定量的表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子(MFNP-NH2)，加少量pH = 7. 2的磷酸PBS缓冲液，超声分散15min后加入0. 2mol/L的N，N-二环己基碳酰亚胺缩合剂DCC， 37°C孵育15min后加入0. 05mol/L的γ -氨基丁酸溶液GABA溶液，37°C孵育20min后磁场 下依次用DMF和双蒸水洗涤磁粒。磁粒加青霉素和链霉素混合液，_20°C保存待用。取活的家蝇成虫，置于4°C冰箱中放置数分钟后浸没于75%的酒精中消毒，小心 将家蝇平放在表面皿上去头。收集家蝇头颅，往其中加入pH = 7. 2的磷酸PBS缓冲液，制 成悬液后通过80目的筛子，滤液待用。取家蝇神经细胞悬液加少量配体的磁性荧光纳米粒子复合物双抗悬浊液，置于 37°C、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育20min，磁场下弃去清夜，用pH = 7. 2的磷酸PBS缓 冲液洗涤磁粒3次后加少量磷酸PBS缓冲液，摇勻，制片，吹干后荧光显微镜下观察细胞形 态；分离效率88%。实施例6 实施效果经过实施例1中几个步骤进行处理的配体的磁性荧光纳米粒子复合物复合物，经 过原子力显微镜和透射电镜观察，测定磁性荧光纳米球的粒径相对均勻，粒子表面光洁，可 作为载体和探针用于研究；见图3、图4。实施例7 实施效果经过实施例3中几个步骤进行处理的配体的磁性荧光纳米粒子复合物复合物，经 过振动样品磁强计(VSM)测试，磁相应良好，可用于磁分离。见图5。实施例8 实施效果经过实施例4中几个步骤进行处理的配体的磁性荧光纳米粒子复合物复合物，经 过振动样品磁强计(VSM)测试，磁相应良好，可用于磁分离。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进 等，均应包括在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法，步骤如下(1)制备磁性荧光纳米粒子复合物A 称取表面已修饰氨基的磁性荧光纳米粒子，加入pH值6.5-7.5的磷酸缓冲液，超声分散5-15min；B 向步骤A产物中加入0.1-0.5mol/L的N，N-二环己基碳酰亚胺缩合剂；37℃孵育10-25min；C 向步骤B产物加入0.05-0.5mol/L的γ-氨基丁酸溶液，37℃孵育10-20min；D 将步骤C产物加入磁场，依次用N，N-二甲基甲酰胺和双蒸水洗涤磁粒2遍；E 将步骤D所得磁粒加入青霉素和链霉素混合液，-20℃保存备用；(2)制备家蝇神经细胞悬液A 取活的家蝇成虫，置于4℃冰箱中放置5-8分钟，浸入75％的酒精消毒；B 将消毒过的家蝇，平放在表面皿上，切去头，收集家蝇头颅；C 将家蝇头颅置入pH6.5-7.5的磷酸缓冲液，制成家蝇神经细胞悬液后通过80目筛，滤液备用；(3)磁性纳米粒子标记家蝇神经细胞A向家蝇神经细胞悬液，加入连有配体的磁性荧光纳米粒子复合物的双抗悬浊液；置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中孵育15-30min；B磁场下弃去清液，用pH6.5-7.5的磷酸缓冲液洗涤磁粒2次；C向上述磁粒加入pH6.5-7.5的磷酸PBS缓冲液、摇匀、制片、吹干，荧光显微镜下观察细胞形态。
全文摘要
本发明属于荧光标记细胞技术，一种磁性荧光纳米粒子标记家蝇神经细胞的方法。现有荧光标记技术的缺点是荧光素很容易从蛋白质上解离下来，使得荧光显微镜下难以准确观测其形态。本发明方法如下制备磁性荧光纳米粒子复合物；制备家蝇神经细胞悬液取活的家蝇成虫，浸入75％的酒精消毒；将家蝇切去头；放入pH中性磷酸缓冲液，制成家蝇神经细胞悬液，通过80目筛，滤液备用；加入双抗悬浊液；置于培养箱中孵育15-30min；洗涤磁粒；加入磷酸缓冲液、摇匀、制片、吹干，荧光显微镜下观察细胞形态。本发明的优点是能保持荧光素长期稳定发光；受体神经细胞分离效率高；荧光显微镜下形态观察准确。
文档编号G01N33/533GK101858908SQ20101017985
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者任天瑞, 周健, 李兴玉 申请人:上海师范大学
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