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专利名称：丙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及ー种快速定量检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
丙型肝炎病毒(!fepatitis C virus, HCV)是ー种有包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，呈球形，直径小于80mm,其基因组总长约9. 6kb,包含ー开放的阅读框(0RF)，后者经翻译成一个大的多蛋白前体(约3000个氨基酸)，并在翻译的同时和翻译后由宿主细胞的信号肽酶和HCV自身编码的蛋白酶加工成约10个成熟的HCV蛋白(包括结构蛋白及非结构蛋白)。全球丙型肝炎的感染率为3%，估计约有I. 7 2. O亿人感染HCV, HCV感染可导致慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的发生。随着分子生物学与流行病学的 发展，国内外研究已证实，丙型肝炎是肝细胞肝癌(Hapatitis C carcinoma, HCC)的重要病因，其中约有509Γ80%急性感染者转变为慢性，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌，成为威胁人类健康的重要因素。在我国一般人群抗HCV阳性率为3.2%，丙型肝炎患者约4000万，即每30个人中就有一名丙肝患者。丙型肝炎是ー种严重�：θ颂褰】档拇�染�。�目前尚无有效的治疗措施，因此，早期发现丙型肝炎患者、及时治疗已成为阻断丙型肝炎传播的重要手段。血清HCV RNA阳性是HCV感染的直接依据，HCV RNA载量反映了病毒复制的活跃程度和患者病程变化，一般在HCV感染后2飞周的血清中即可检出，是丙型肝炎的诊断和衡量抗病毒疗效的重要指标。我国目前应用的HCV RNA检测主要以国产试剂盒为主，其最低检测值为lX103IU/ml，与同类进ロ试剂盒相比，敏感性过低，给准确判定临床治疗效果带来一定影响。因此，研究检测HCVRNA的载量具有重要的理论价值及临床意义。目前最常见的HCV基因检测方法主要有定量逆转录ー聚合酶链反应(RT— PCR)和分支 DNA 检测(branched DNA, bDNA)。RT — PCR检测血清中的HCV RNA，基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的⑶NA，再通过PCR将⑶NA扩增，电泳后确证結果。此法可以扩增极微量HCV RNA，具有早期、敏感和特异等特点；它的引物均根据HCV基因5’端保守区域设计，但是由于引物选择的位置及方法学上的差异HCV RNA的检测结果出入较大，往往无法应用于大規模的人群筛检，常出现假阳性或假阴性的結果，且费时，检出率较低，难以在常规工作或基层实验室推广普及应用。bDNA是ー种核酸检测技木，属于信号扩增，是把HCV基因组通过特异性“捕获”探针固定在微孔板上，带有bDNA多聚物的病毒特异性延伸探针与固定的病毒核酸結合，bDNA多聚物上带有寡核苷酸的重复结合位点，结合的寡核苷酸偶联的酶催化荧光底物产生荧光信号，測定信号的強弱判断样品中HCVRNA的量。检测限为615IU/ml，特异性达到96. 0%-98. 8%，降低了污染机会，具有较高的重复性，但敏感性不高。此外，利用分子杂交直接检测HCV RNA也是ー种较为特异敏感的方法，但不如PCR法灵敏，且操作繁琐，即采用与HCV RNA互补的cDNA探针进行斑点杂交来直接检测血浆中的HCV RNA0基因芯片技术检测HCV RNA :由于该技术较为复杂，且成本较高，目前对其应用仍大多停留在实验阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。最新出现的实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。RT-PCR和bDNA技术，均无法像荧光定量PCR那样基本上满足上述所有的条件。与荧光定量PCR相比，这两种检测方法的敏感性低，且线性范围窄。而全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技木。实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是ー种在PCR扩增时在加入ー对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和ー个淬灭突光基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增吋，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同歩。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。本发明中的试剂盒是针对HCV RNA检测而设计的，建立定量检测血清中丙型肝炎病毒的实时荧光定量PCR体系。

发明内容
本发明的目的在于提供ー种能快速、准确、高敏感度的检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。本发明所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。荧光定量反应液用于检测HCV RNA，其反应体系包括检测HCV RNA的引物和探针序列正向引物序列(HCV-ForwardPrimer)为SEQ ID NO: I (5’-TGCTCATGTTGCACGGTCTAC-3’)；反向引物序列(HCV-ReversePrimer)为SEQ ID NO: 2 (5’ -TCTGCGGAACCGGTGAGT-3’)；突光探针序列(HCV-Taqman-Probe)为SEQ ID NO: 3 (5 ’ -FAM-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-TAMRA-3 ’ )；该荧光探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3，端标记TAMRA荧光淬灭基团。阳性对照样品包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒的原理为采用荧光定量PCR方法对丙型肝炎病毒进行定量检测。首先经逆转录酶作用，将HCV RNA逆转录为单链的cDNA，针对丙型肝炎病毒基因序列特异设计TaqMan探针及引物一対，当遇到丙型肝炎病毒特定基因序列吋，TaqMan探针可与之完全結合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测丙型肝炎病毒含量的目的。本发明提供的两端都标有突光发光基团的特异性突光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一祥，有ー个同步指数增长的过程，荧光信号的強弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
与现有检测试剂盒相比，本发明所述的丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒具有以下优势I.检测灵敏度高，特异性好本发明针对HCV RNA设计了特异性引物和荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低，最低可检出10拷贝/微升HCV RNA含量；2.线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的強弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差�。�3.操作简单，自动化程度高，FQ-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一歩完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率；4.结果判读明确、直观，可对结果进行定量分析。荧光定量PCR法结果的判读在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单、直观；5.检测的样本量大，一次最多可检测几百例；6.安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无�：Γ�7.没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。


图I是本发明所述的试剂盒检测浓度为10 IO7拷贝/微升HCV RNA标准品的FQ-PCR曲线图。图中，从左到右，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升、IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、10拷贝/微升的HCV RNA荧光定量PCR扩增曲线。图2是本发明所述的试剂盒检测部分阳性标本的FQ-PCR曲线图。上述附图均为检测仪器自带软件的原始检测图，图中横坐标英文含义为“PCR循环数”，纵坐标英文含义为“扩增反应的荧光值”。
具体实施例方式实施例I :本发明所述的试剂盒对于标准样品的灵敏度选择浓度分别为10拷贝/微升、IO2拷贝/微升、IO3拷贝/微升、IO4拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO7拷贝/微升的HCV RNA样品。本实验的标准品为宝生物工程(大连)有限公司合成的质粒DNA。采用本发明所述的试剂盒进行荧光定量PCR检测。本发明所述的试剂盒含有专门设计的能特异性检测HCV RNA的荧光探针及引物一对正向引物序列(HCV-ForwardPrimer)为SEQ ID NO: I (5’-TGCTCATGTTGCACGGTCTAC-3’)；反向引物序列(HCV-ReversePrimer)为SEQ ID NO: 2 (5，-TCTGCGGAACCGGTGAGT-3，)；
·
突光探针序列(HCV-Taqman-Probe)为·SEQ ID NO: 3 (5，-FAM-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-TAMRA-3’);该荧光探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3，端标记TAMRA荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测，荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行，反应体系为15 μ I,包括正、反引物各O. 15 μ I ( 20 μ M )，探针各O. 2 μ I (20 μ M )，模板DNA2. 5 μ l(100-300ng/y l)，2*Taqman universal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH204. 3 μ I。PCR扩增反应程序95°C预变性30秒；并按95°C 10秒，60°C 33秒，扩增反应40
次循环。结果为从左到右，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升、IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、10拷贝/微升的HCV RNA荧光定量PCR扩增曲线。本实验初步确定本发明所述的试剂盒具备较高的敏感性和特异性，假阳性低，最低可检出10拷贝/微升HCV RNA含量。实施例2 :本发明所述的试剂盒对于临床样品的灵敏度采用本发明所述的荧光定量PCR检测试剂盒对30例临床标本(来源于中山大学肿瘤医院含有丙肝病毒的患者血清)进行检測。本发明所述的试剂盒含有专门设计的能特异性检测HCV RNA的荧光探针及引物一对正向引物序列(HCV-ForwardPrimer)为SEQ ID NO: I (5’-TGCTCATGTTGCACGGTCTAC-3’)；反向引物序列(HCV-ReversePrimer)为SEQ ID NO: 2 (5’ -TCTGCGGAACCGGTGAGT-3’)；突光探针序列(HCV-Taqman-Probe)为SEQ ID NO: 3 (5，-FAM-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCA-TAMRA-3’)；该荧光探针的5'端标记FAM荧光报告基团，3，端标记TAMRA荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测，荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行，反应体系为15 μ I,包括正、反引物各O. 15 μ I ( 20 μ M )，探针各O. 2 μ I (20 μ M )，模板DNA 2. 5 μ I (100-300ng/ μ I), 2*Taqman universal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ I。PCR 反应条件95°C预变性 30 秒；并按 95°C 10 秒，60°C 33秒，扩增反应40次循环。结果为编号分别为5、8、9、12、16、21、29的样本对应检测孔有扩增曲线，检测结果为阳性，荧光定量PCR检测结果如图2所示，表明本试剂盒的检测结果具有极高的的特异性和可靠性。综上所述，本发明所述的试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明 确、直观，结果可靠、特异的。
权利要求
1.一种丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于 所述荧光定量反应液包括含有检测HCV RNA的弓I物和探针序列的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ ID NO: 1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQ ID N0:3，其5'端标记突光报告基团,3’端标记突光淬灭基团； 所述阳性对照样品为包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。
2.根据权利要求I所述的丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的5'端标记的荧光报告基团是FAM。
3.根据权利要求I所述的丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的3'端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。
全文摘要
本发明涉及一种丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述荧光定量反应液包括含有检测HCV RNA的引物和探针序列的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ ID NO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQID NO:3，其5′端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述阳性对照样品为包含所检测HCV基因组片断RNA质粒。本发明提供了一种能快速、准确、高敏感度的检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
文档编号G01N21/64GK102816871SQ20121033311
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司