专利名称：乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及基因芯片领域，具体地是涉及肽核酸低密芯片，尤其是涉及乙肝突变位点的肽核酸检测芯片。
肝炎是世界性传染疾�。夜枪系母窝状蠊窝椎幕疾÷屎头⒉÷识季邮澜缜傲�。乙肝病毒基因不同位点的突变可引起免疫逃避、抗病毒治疗逃避，使得临床检测出现漏检、用药不当，以至延误治疗。本实用新型涉及的乙肝突变位点的肽核酸检测芯片采用标记的RNA和肽核酸杂交来检测乙肝突变位点，能提高检测的灵敏度和特异性，而与之相关的其他研究和产品，至今尚未见报道。
本实用新型的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，其特征在于，所述的基片是玻璃基片，尼龙膜之一；所述的肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性探针，1条阴性探针及空白点样液对照。
上述基片是未经任何修饰的玻璃裸片、醛基化玻片、氨基化玻片和尼龙膜之一。
上述基片是氨基化玻片、醛基化玻片之一；所述氨基化玻片修饰层是经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化的硅化层，所述醛基化玻片修饰层是在硅化层基础上覆盖有经戊二醛处理的醛基化层。
上述基片形状是任意几何形状之一，厚度为0.6～1.7mm。
上述基片形状是长方形，厚度为0.8～1.0mm。
上述长方形基片的面积是25.4×76.2mm。
上述肽核酸探针与对照的点涂层的大小，可以根据点直径的大�。慵渚嗟谋浠浠徽罅性诨系姆植际靠筛荽治鲅返氖勘浠浠�。
上述肽核酸探针与对照的点涂层的大小是当点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。(如图2所示)上述肽核酸探针与对照的点涂层的形状是圆形。
上述阳性探针分布位于阵列的四角。
上述的肽核酸探针中，前C区与S区检测探针共计24条，已知突变位点探针12条，野生位点探针12条。包括了S区包括已知的5个突变位点546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A以及前C区包括7个已知的突变位点1896G-A、1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。肽核酸探针的长度为14-18mer，均设计在乙肝DNA反义链，其氨基末端连有O-linker(8-amino-3，6-dioxaoctonic acid)，对应着DNA链的3′端。2条阳性对照探针，位于乙肝DNA反义链，分别源于乙肝前C区或S区的核酸保守序列。阴性肽核酸探针源于人ATM基因中的17mer的核酸序列。
本实用新型的优良效果是该乙肝突变位点的肽核酸检测芯片能同时高通量地检测很多突变位点，平行分析多个样品。肽核酸阵列在基片上的分布可以根据需要而设定。与常规的基因芯片相比，肽核酸芯片能提高检测灵敏度和特异性。本实用新型所提供的乙肝病毒突变位点的的肽核酸检测芯片，能获得与突变位点相关的临床信息，指导临床用药。
图2是乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片肽核酸探针的点涂层分布图。其中，A1、A6、F1、F6均为阳性对照1PCS，B1、B6、F1、F6均为阳性对照2PCC；C1与C6均为阴性对照NC；D1与D6为点样液对照；A2、3、4、5分别为探针S1、S3、S5、S7；B2、3、4、5分别为探针S2、S4、S6、S8；C2、3、4、5分别为探针S9、C1、C3、C5；D2、3、4、5分别为探针S10、C2、C4、C6；E2、3、4、5分别为探针C7、9、11、13；F2、3、4、5分别为探针C8、10、12、14。
图3是上、下游引物扩增乙肝DNA所得到的PCR产物电泳图谱。其中，泳道1的白色条带是目的扩增片段，长度为2136bp。泳道2是TaKaRa DL-2000分子量Marker，白色条带从上到下长度分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图4是部分突变位点杂交图。上排的三个点分别为1896、1762与1764联合位点、1862三个位点的野生探针杂交结果。下排的三个点是与上排位点相对应的突变探针的杂交结果。根据荧光信号的强弱，可以断定检测样品的1896与1862位点未发生突变，1762与1764联合位点发生突变。
实施例1乙肝病突变位点的肽核酸芯片结构如附
图1所示在厚度为1.0mm、面积是25.4×76.2mm的长方形氨基化玻璃基片1上阵列式分布肽核酸探针与对照的点涂层2，其中含有乙肝前C区和S区已知突变位点和野生位点的24条肽核酸探针，2条阳性探针，1条阴性探针及空白点样液对照。点涂层2的形状是圆形，点直径为100μm，点间距为300μm，肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。阳性探针分布位于阵列的四角。其中，A1、A6、F1、F6均为阳性对照PCS，B1、B6、F1、F6均为阳性对照PCC；C1与C6均为阴性对照NC；D1与D6为点样液对照；A2、3、4、5分别为探针S1、S3、S5、S7；B2、3、4、5分别为探针S2、S4、S6、S8；C2、3、4、5分别为探针S9、C1、C3、C5；D2、3、4、5分别为探针S10、C2、C4、C6；E2、3、4、5分别为探针C7、9、11、13；F2、3、4、5分别为探针C8、10、12、14。
实施例2玻片的修饰与PNA探针的固定1、玻片的修饰将空白玻璃载片用10％NaOH清洗，再用1％HCI酸液洗，水洗后甩干，即得到干净的玻璃裸片。用1％3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液中处理30分钟，然后用丙酮清洗3次，每次5分钟，80℃烘烤15分钟，得到的氨基化玻片。继续用10％的戊二醛水溶液处理30分钟，然后用双蒸水清洗，真空干燥后得到醛基化修饰的玻片。2、肽核酸探针的固定肽核酸探针的设计与选择见下表
肽核酸探针在醛基化玻片上的固定，用饱和的NaHCO3溶液作为点样液，肽核酸探针浓度均为50μM，经点样仪点到相对应的玻片上(核肽酸探针在醛基化玻片上的分布见附图2)，点直径为100μm，点间距为300μm。所得的PNA阵列的大小为1.6m×1.6mm。将点样后而得到的PNA芯片在37℃水合2个小时，进行以下处理。1)将玻片用0.2％的SDS溶液清洗两次，每次5分钟，以除去未结合的肽核酸。2)将玻片浸于纯水中清洗两次，每次5分钟。3)将玻片用0.26％的硼氢化钠溶液(用75％的磷酸盐，25％的乙醇溶液配置)处理5分钟。4)将玻片用0.2％的SDS溶液处理3次，每次1分钟。5)将玻片用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的纯水清洗两次，每次1分钟。6)用平板离心机，800rpm 10分钟，甩干玻片，以杂交使用。
实施例3乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和标记1、乙肝样品DNA的提取1)取100μl乙肝血清，加入3倍体积的裂解液(4M硫氰酸胍、巯基乙醇、0.1M Tris-CI，pH7.5)混匀。
2)加入等体积的氯仿、异戊醇溶液(24∶1)，充分混匀。室温下12000rpm离心15分钟。
3)小心将上清液移入另一1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。-20℃放置2个小时。4℃，12000rpm离心15分钟。
4)离心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm离心10分钟。
5)沉淀自然干燥后溶于16μl纯水中。2、PCR目的片段的扩增和纯化1)PCR扩增体系为25μl，其中包括10×PCR缓冲液 2.5μl2mM dNTP2.5μl上游引物(5μM) 2.0μl下游引物(5μM) 2.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl乙肝DNA 16.0μl其中10×PCR缓冲液的成分为500mM Tris-CI(pH8.3)，20mM MgCI2、0.75％牛血清白蛋白BSA。上游引物序列为5′GAGGCATACTTCAAAGACTGT 3，其5′末端连有T3启动子序列ATTAACCCTCACTAAAGGG；下游引物起序列为5′GATGGGATGGGAATACA 3′。
2)PCR扩增采用MJ Research PTC-225PCR仪，程序为94℃ 1.5min 1个循环94℃ 20sec、55℃ 20sec、72℃ 2.5min共计35个循环72℃ 8min 1个循环3)取5μl PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。如图3所示。
4)PCR产物的纯化采用玻璃奶纯化。3、PCR产物的体外转录标记采用Promega T3转录试剂盒，体外转录反应体系为10μl，Cy3-UTP购于AmershamPhamacia公司。具体步骤如下1)T3转录反应包括T3 5×转录buffer 2μl100mM的ATP、CTP、GTP 各0.75μl
100mM的UTP 0.5μl100mM Cy3-UTP， 0.25μlPCR纯化产物 4μl(5-50ng)T7酶混合物 1μl10μl2)将反应混合物混匀，37℃温育1小时。
3)体外转录得到的RNA经调整浓度，使之溶于30mM的MgCI2溶液，于94℃孵育30分钟从而得到片段化的RNA。
实施例4肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析1.肽核酸阵列的杂交1)将1μl片段化标记的RNA稀释到10μl事先预热到杂交温度的经DEPC处理过的肽核酸杂交液中(10mM的磷酸盐缓冲液pH7.0，内含0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)，混匀。
2)将上述荧光标记的RNA样品滴到肽核酸阵列上，在阵列区域盖上盖玻片。
3)将该玻片放入预热到杂交温度、盛有纯水的湿盒(购于Sigma公司)中，以避免阵列干燥。
4)将玻片置于杂交炉中，杂交温度为65℃，时间为1.5个小时。
5)杂交结束后将玻片放入10mM的DEPC处理的磷酸盐缓冲液清洗5分钟。
6)然后放入5mM的DEPC处理的磷酸盐缓冲液2次。每次5分钟。
7)在室温下，使用平板离心机在800rpm下离心5分钟，将玻片甩干。2.肽核酸阵列的检测和结果分析杂交后的肽核酸芯片经激光共聚焦扫描仪ScanArray4000扫描并收集信号，分析检测结果。扫描结果显示阴性对照和点样液对照无荧光信号，阳性对照有荧光信号，根据对比相对应的正�：屯槐涮秸氲挠庑藕徘咳趵辞鸶梦坏闶欠裼型槐涞姆⑸�。图4即是前C区1896、1762与1764联合位点、1862三个位点共计6个探针的杂交结果。上排的三个点分别为1896、1762与1764联合位点、1862三个位点的野生探针杂交结果。下排的三个点是与上排位点相对应的突变探针的杂交结果。根据荧光信号的强弱，可以断定检测样品的1896与1862位点未发生突变，1762与1764位点由原来的1762A、1764G联合突变为1762T、1764A。
实施例5以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜之一为基片的乙肝病毒突变位点的肽核酸检测芯片以玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜之一为基片的乙肝病毒突变位点的肽核酸检测芯片，玻璃裸片和氨基化玻片的制备如实施例2步骤1玻片的修饰。氨基化和未经化学修饰的裸片、尼龙膜之一采用杂交液pH7.0的10mM的磷酸盐缓冲液(0.1mMNaCI、5mMEDTA、0.1％SDS)作为点样液。肽核酸探针浓度均为50μM，经点样仪点到相对应的玻片上(肽核酸探针在基片上的分布图见附图2)，点直径为100μm，点间距为300μm。肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。点样后的玻璃裸片、氨基化玻片或尼龙膜，经紫外交联5分钟后可直接用于杂交。乙肝样品DNA的提取、PCR扩增和标记同实施例3，肽核酸阵列的杂交和检测，信号分析见实施例4。
权利要求1.一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，其特征在于，所述的基片是玻璃基片，尼龙膜之一；所述的肽核酸探针与对照的点涂层是指在基片上均匀分布的，含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性探针，1条阴性探针及空白点样液对照。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的基片是未经任何修饰的玻璃裸片、氨基化玻片、醛基化玻片和尼龙膜之一。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述基片是氨基化玻片、醛基化玻片之一；氨基化玻片修饰层是经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化的硅化层，所述醛基化玻片修饰层是在硅化层基础上覆盖有经戊二醛处理的醛基化层。
4.如权利要求1、2或3所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的基片形状是任意几何形状之一，厚度为0.6～1.7mm。
5.如权利要求4所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的基片形状是长方形，厚度为0.8～1.0mm。
6.如权利要求5所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述长方形基片的面积是25.4×76.2mm。
7.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针与对照的点涂层的大�。梢愿莸阒本兜拇笮。慵渚嗟谋浠浠徽罅性诨系姆植际靠筛荽治鲅返氖勘浠浠�。
8.如权利要求7所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针与对照的点涂层的大小是当点直径为100μm，点间距为300μm时，肽核酸阵列的大小为1.6mm×1.6mm。
9.如权利要求1、7或8所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的肽核酸探针与对照的点涂层的形状是圆形。
10.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，其特征在于，所述的阳性探针分布位于阵列的四角。
专利摘要本实用新型公开了一种乙型肝炎病毒突变位点的肽核酸检测芯片，包括基片和阵列式分布的肽核酸探针与对照的点涂层，所述的基片是玻璃基片，尼龙膜之一；所述的肽核酸探针与对照的点涂层是指含有乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知突变位点和野生位点的24条检测探针，2条阳性对照探针，1条阴性对照探针及空白点样液对照；本发明的芯片可同时平行检测乙肝前核心抗原区和表面抗原区已知的突变位点，具有快速、高效、诊断精确的特点。
文档编号G01N33/574GK2596361SQ0227006
公开日2003年12月31日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者鲁艳芹, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心
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