专利名称：肺癌的诊断分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过使用体液样品来早期检测出肺癌的分析法、方法和试剂盒。尤其是，本发明涉及通过评估例如自身抗体生物标记的一个或一组标记的存在而检测肺癌。
背景技术：
对于美国和许多其它国家的男人和妇女，肺癌是癌症死亡的主要原因。仅在美国，此病致死数量已经在过去五年中每年递增至接近164，000,其中大多死于非小细胞性肺癌(NSCLC)。这超过了乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的死亡量总和。许多专家相信，肺癌的早期检出是提高存活率的关键。研究表明，当在早期、非转移期检出此�。捎猛饪剖质跞コ迥甏婊盥士纱�85%。但在癌已经转移到其它器官尤其是远端部位后，存活率急剧下降，只有2%的患者存活五年。不幸地是，肺癌是异质性疾病并且通常是无症状的，直至达到晚期。因此，仅有15%的肺癌患者在早期、非转移期被发现。于是，对于能帮助对无症状人员进行筛�。谧钤缙谧钅苤瘟破诩觳獬龇伟┑墓ぞ哂星苛业男枨蟆Ｒ丫芯浚夭縓射线和计算机断层扫描(CT)是检测早期肺癌的潜在的筛选工具。不幸的是，高昂费用和高比例的假阳性使得这些放射成像工具的广泛应用是不切实际的。例如，美国国家癌症研究所(U.S.National Cancer Institute)的一份近期研究作出结论，用胸部X射线筛选肺癌能检测出早期肺癌，但是产生许多假阳性检验结果，导致不必要的继续检验，Oken 等人 Journal of the National Cancer Institute, 97 (24) 1832-1839，2005。在参加该试验接受X射线的67，000名患者中，将近6，000名(9%)的结果不正常，需要随访。在这些人中，仅 有126人(X射线结果不正常的6，000名患者的2% )在首次胸部X射线检验后12个月内被诊断为肺癌。正在进行的采用CT扫描的试验遇到了类似的假阳性问题。基于不确定的射线成像结果的数量，计算出的CT筛选的特异性大约是65%。当对每次进行的CT筛选扫描所检测出的癌症患者的数量进行评估时，专家非常关注单个人保健费用的节�。蛭⑸谋＝》延弥械囊淮蟛糠挚晒橐蛴谠谄毡樯柚蟹⑾值男枰徊窖芯康牟蝗范ǖ姆尾拷峤诘氖浚渲行矶嘧詈蠓⑾质橇夹缘�。PET扫描是另一种可选择的诊断方法，但是PET扫描价格昂贵，通常不适合用于筛选方案。目前，年龄和吸烟史是在大型筛选研究中已被用作选择标准的仅有的两个风险因素。能检测出射线照相学上明显的癌症患者(> 0.5cm)以及隐匿性的和癌变前的癌症患者(射线照相检测的极限值以下)的血液检验将鉴别个体，对于这些个体辐射学筛选是最可靠的并且事实上将减少需要进一步研究的良性肺部发现的数量。因此很明显，急需克服上述射线照相技术的局限性的改进的肺癌筛选和检测工具。
发明内容
本发明可用于全面肺癌筛选策略，尤其是当与射线照相成像和其它筛选形式一起使用时。本发明可用来富集群体，用于进一步射线照相分析以排除可能存在的肺癌。简言之，本发明涉及一种检测出患者可能存在肺癌的方法，其中一个实施方案是通过提供患者的血液样品，并分析该患者血液样品存在一个或一组与肺癌相关的自身抗体。该小组是可鉴别的，例如通过评估与小组成员相关的癌症的最大可能性。各种各样的统计工具中的任何一个可用来估计多种变量对于结果的同时贡献。
本发明的第一方面涉及一种用于选择患者进行肺癌放射照相检验的方法，其包括:(a)从所述患者提供液体样品；(b)确定在所述样品中与肺癌相关的标记的存在；以及(C)选择在所述样品中具有所述标记的放射照相检验患者。在一些实施方案中，所述标记可以是自身抗体。在一些实施方案中，所述患者可以是无症状的。在一些实施方案中，所述患者可以是没有放射照相可检测的肺癌的高危患者。在一些实施方案中，所述标记可在所述患者存在放射照相可检测的肺癌前达五年就表达了。本发明的第二方面涉及一种包括肺癌标记的组合物，其中所述标记是一种分子的结合配偶体，在所述患者存在放射照相可检测的肺癌前达五年所述分子就存在于患者的液体样品中。在一些实施方案中，在所述样品中的所述分子可以是自身抗体。在一些实施方案中，所述组合物可包括珠子。在一些实施方案中，所述组合物可包括膜。在一些实施方案中，所述组合物可包括平面。本发明的第三方面涉及一种分析设备，其包括根据本发明的第二方面所描述的组合物。在一些实施方案中，所述设备可包括微阵列。本发明的第四方面涉及一种检测受试者中可能存在的肺癌的方法，其包括以下步骤:(I)从所述受试者提供样品；并且(2)分析所述样品对于至少两个与肺癌相关的标记的存在；其中(a)肺癌可能在所述受试者中存在，如果所述标记的至少一半在所述样品中存在；或者(b)肺癌可能在所述受试者中存在，只要(i)获得与所述样品中所述至少两个标记的每个标记的存在相关的归一化值，
(ii)合计所述归一化值以得出总和；并且(iii)比较所述总和及参考值，所述参考值是所述至少两个标记的最大肺癌预测值，所述总和是所述参考值的至少30%。在一些实施方案中，所述至少两个标记可为自身抗体。在一些实施方案中，所述方法可包括至少三个标记。在一些实施方案中，所述方法可包括至少四个标记。在一些实施方案中，所述方法可包括至少五个标记。 在一些实施方案中，所述方法可包括至少六个标记。本发明的第五方面涉及一种诊断设备，其包括至少两个肺癌标记和固相。在一些实施方案中，所述标记可以是自身抗体的表位。在一些实施方案中，所述固相可包括珠子。在一些实施方案中,所述固相可包括膜。在一些实施方案中，所述设备可包括阵列。本发明用来分析主要CT筛选试验所获得的样品，把早期和晚期肺癌以及隐匿性疾病同风险匹配(risk-matched)对照区别开。对肺癌存在的预测，本分析的准确度为接近90%，并在射线照相检出肺癌之前五年。本分析可作为筛选检验应用于无症状患者或者高风险组的患者，他们使用公认的检验和方案尚未诊断出肺癌，也就是，例如他们没有在射线照相上可检测出的肺癌。相对于高昂费用和低特异性的现有的肺癌筛选方法，如胸部X射线或低剂量CT，本发明提供另一种可选择的方法。本分析使癌症检出率最大化，同时限制检测需要进一步确诊的良性肺部结节，因此本分析是有效的、价格可取的工具，可轻易地并入全面的早期检测策略。有了下述说明和所附的权利要求，将更好理解这些及其它本发明的特点、方面和优点。详细描述病理状态的早期诊断是有益的。然而不是所有的病理状态都具有轻易可检出的、单一标志。其它病理状态在病原学和表型上是异质性的，或者贯穿其发育阶段。在这样的情形下，一种单一的、敏感的和特异性的诊断标志或标记不太可能存在。然而，现在有可能开发一种采用了多元(plurality)标记的合适的诊断分析法，单独的标记可能不具有足够的预测能力，但是在某种组合下，实际应用中一组标记具有足够的特异性和敏感性。而且，多重技术和数据处理能力赋予了开发具有使用方便和对界定群体或普通群体更好的预测能力的、特殊化和个性化的诊断分析法的灵活性。本发明提供了一种新的检测疾病如肺癌的分析法和方法，其比传统方式更早更准确。简言之，获取患者或研究对象的样品如血液样品，并分析是否存在一组抗体生物标记。对于肺癌，采用一个或一组标记，每个标记在某种程度上与肺癌相关，当使用一组标记时，其中大多数产生在异质性的群体中对肺癌可能性的可预测的测量。正如下面更详细的阐述的，根据本发明的分析法和方法正确地鉴别了早期和晚期肺癌患者。鉴别早期肺癌患者是特别有价值的，因为目前的分析法和筛选模式在此方面以强有力和节省成本 的方式是能力有限的。与目前使用的分析法相比，本筛选分析法提供了更好的可预测性，产生更少的假阳性，目前使用的分析法通常也是昂贵的。本分析法也是多用途的，通过使用一种能同时测试大量样品的分析格式，例如采用微阵列，与任一群体相关的对照样品可并行地进行以获得高度可信的区别数据，其中多元对照与尽可能多的参数匹配来检验群体。这能校正可能产生的并会混淆结果的个体差异，例如种族、性别、年龄、多样性等。定义此处使用的下述术语应该具有下述意义。“肺癌”是指肺内的恶性过程、状态和组织。“蛋白质”是肽、寡肽或多肽，该术语此处可互换使用，是一种氨基酸聚合物。在文库方面，多肽不必编码具有生物活性的分子。所关心的抗体结合表位或抗原决定簇。表位是完整功能分子的部分，在蛋白质的方面，可包括少到大约三个至大约五个连续的氨基酸。“标准化”涉及计量或测量的统计学处理，对观察结果的背景和随机干扰进行校正或调整以确定该计量、统计或测量是否是真实的反映、响应或反应结果，还是不显著的和随机的。“非小细胞性肺癌”(NSCLC)是肺癌的一种亚型，其占全部肺癌的大约80%，与小细胞性癌症相比，后者特点是小的、卵形细胞，也被称作燕麦形细胞癌。包括在NSCLC亚型中的是鳞状细胞癌、腺癌以及大细胞癌。“体液”是从人体获得或源自人体的任何液体样品，例如血液、唾液、精液、泪液、组织提取物、分泌物、体腔冲洗物、血清、血浆、组织液及类似物，可作检验的患者样品。然而，优选的可使用的液体是可在测试前经过处理如净化，例如通过离心分离。体液样品是一种液体样品。“血液样品” 一般指从个体`获得的静脉血的小量的等分部分。血液可经过处理，例如采用肝素或EDTA使凝血因子失活，去除血红细胞产生血浆样品。可允许血液凝块，固态和液相分离，产生血清。所有的这些“处理过的”血液样品落入此处定义的“血液样品”的范围内。“表位”是指与抗体结合的特殊的分子结构。别称是抗原决定簇。多肽表位可以是3至5个氨基酸那么小。“生物标记”是指因素、指示物、得分、计量、数学处理等类似被评价的，以及发现在结果的预测中有用，例如生物实体的当前状态或将来健康状态。生物标记也称作标记。“小组”是指一系列被编排的标记，在分析中它们一起被测量。小组能由2个标记、3个标记、4个标记、5个标记、6个标记、7个标记、8个标记、9个标记、10个标记、11个标记、12个标记或者更多标记组成。在本申请中教导的统计学处理和分析方法以及其中能应用在本发明的实践中的提供了在所关心的分析中对一些有益标记的任何标记的使用。“结果”是那些被预测的或检测出的。“自身抗体”是指针对包括于病理细胞如被感染的细胞和肿瘤细胞中的“自体”(自身)蛋白质的免疫球蛋白或抗体(该术语此处可互换使用)。这种情况下对抗肿瘤的抗体来源于个体自身肿瘤，是他/她自身细胞的基因畸变。“加权和”是指来自单个标记的得分的编辑，每个标记具有预测值。具有更高预测值的标记对和的贡献越大。用于已知的统计范例例如对数回归，单个标记的相对值是统计衍生的以最大化多变量表式的值。能使用一些市场上可获得的统计学软件包。在更多的因子的公式中例如回归方程，每个因子的系数提示那个因子(标记)的“加权”。“统计学显著性”是指区别不可能只是与机会相关。“标记”是在诊断中评价和使用的因素、指示物、计量、得分、数学处理等类似的。标记能够是例如多肽或抗原，或者是能够结合抗原的抗体。标记也能是结合配对或结合配偶体的任何一个，作为实体的结合配对或结合配偶体对另一个具有特异性，例如抗体和抗原、激素和受体、配体和配体所结合的形成复合物的分子、酶和辅酶、酶和底物等等。“预测标记”是指在使用已知技术检测到肺癌前已存在的标记。因此，在患者以放射照相学检测发现的癌症前本分析检测肺癌特异性自身抗体，例如注意到放射照相学检测的癌症之前5年。这样的自身抗体是预测标记。“目标群体”指任何以特殊的标记、状态、环境、疾病等为代表的亚系列群体。因此，目标群体能是特殊的患者，例如具有特殊形式或阶段的肺癌，或吸烟群体。目标群体可包括具有一种或多种风险因素的人。目标群体可包括有可疑检验结果的人，例如肺中存在异常需要进一步和更经常地监测。“放射照相的”指任何成像方法，例如CAT、PET、X射线等。“放射照相学可检测到的癌症”指通过放射照相手段诊断或检测的癌症。癌症的存在一般通过组织学确认。“组织样品”指来自特别组织的样品。对于液体形式的组织样品，样品能是体液或来自液体组织例如血液，或处理过的血液等份。相也与获得液体的实体组织相关，例如渗出液、用过的组织培养液、切碎的实体组织的冲洗液等。生物标记的选择
肺癌相关标记能通过任何可以获得的技术人员使用的手段来选择和鉴别，肺癌相关标记例如自身抗体、对其有特异性亲和力的蛋白或和其结合的蛋白。在抗体生物标记的情况中，能使用多种基于免疫学的方法中的任何方法。如本领域已知的，具有结合特异性的适体(aptamer)、镜像异构适体(spiegelmer)以及类似物也可以代替抗体使用。许多已知的依赖抗体-抗原反应的高通量方法能够在本发明中使用。来自目标群体中个体的分子能与那些来自对照群体的相比以鉴别任何肺癌特异性的分子，例如使用减法挑选等。可选择地，目标群体和正常(对照)群体样品能用于鉴别来自分子文库的对目标群体特异性的分子。能够用文库实行亲和筛选形式，用抗体作为探针筛选文库的候选分子。使用抗体来筛选候选分子也称为“生物淘洗(biopanning)”。然后验证目标群体-特异性的分子及其使用，确定单个标记作为目标群体成员的预测指标的能力。一种合适的手段是获得对肺癌是或不是特异性的分子文库以及筛选那些文库寻找结合目标群体成员抗体的分子。因为蛋白或多肽表位能够是3个氨基酸，也能长度少于10个氨基酸、长度少于20个氨基酸等，文库的单个成员的平均长度是设计的选择。因此，文库的较小成员能大约3-5个氨基酸以模拟单独的抗原决定簇，而20个或更多氨基酸的成员可能模拟或包含2个或更多的抗原决定簇。文库也不需要限制于多肽，因为其它分子例如糖类、脂类、核酸及其组合能是表位，并且因此用作或鉴别肺癌的标记。因为生物标记鉴别过程寻求鉴别表位而不是完整的蛋白或其它分子，被扫描的或被筛选的文库不需要是肺癌特异性的，而且能从正常个体分子获得，或能够从随机分子的群体获得，虽然使用从肺癌患者得到的样品能增加鉴别合适的肺癌生物标记的可能性。尽管如此，不考虑包含表位的分子的功能，表位或交叉反应分子在肺癌患者中存在并且是免疫原性的。那些方法的实例说明在使用T7的肺癌特异性cDNA噬菌体文库和M13随机肽文库的实施例中描述。如本领域已知的，二者在噬菌体展示文库中携带。一个T7噬菌体NSCLC的cDNA文库是购买的(Novagen,Madison,WI,USA),第二个是通过腺癌细胞系NC1-1650构建的(受赠于 H.0ie, NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)。因此，如本领域已知的建立噬菌体文库。提取并挑选来自目标组织或细胞的总RNA0进行第一条链的cDNA的合成，确保对N-末端和C-末端的氨基酸序列都表现。该cDNA产物连接到相容的噬菌体载体以产生文库。该文库在合适的细菌宿主中扩增，对于裂解性噬菌体如T7，裂解细胞得到 制备的噬菌体。在标准条件下滴定裂解液并提纯后存贮。对于其它噬菌体，病毒可排出到培养液中如M13的情况，在该情形下收集上清液病毒并滴定。噬菌体文库用组织样品进行生物淘洗(biopan)或筛�。橹酚叛〉厥且禾逖啡缋醋苑伟┗颊叩难蜓澹约袄嗨频淖橹罚缋醋哉＝】倒┨宓难蜓澹醇鸨慌涮迨侗鸬那痹诘恼故痉肿永绶伟┗颊咛迥诘难房固�。在一种实施方案中，组织样品是血液样品如血浆或血清，目的是鉴别标记，这些标记是被目标群体如非小细胞性肺癌患者的血浆或血清中的抗体所识别的。为了去除被来自该文库的非目标群体的抗体识别的噬菌体，例如将噬菌体显示文库暴露于正常血清或血清池。未反应的噬菌体从那些与非目标群体样品进行反应的噬菌体中分离出。然后未反应的噬菌体暴露于NSCLC血清来分离被NSCLC患者血清中的抗体识别的噬菌体。收集反应的噬菌体，在合适的细菌宿主中扩增，裂解液经收集、存贮、确定为“样品I”或是“生物淘洗I”。生物淘洗和扩增过程可重复多次，通常采用相同的对照和目标样品来提高纯化过程。来自生物淘洗的噬菌体代表一种富集群体，它们更可能含有被来自NSCLC患者样品中的抗体特定识别的表达分子。由于许多噬菌体文库表达多肽，所以选择的噬菌体可被说成表达和表现NSCLC相关抗体的“捕获肽”。为了进一步选择表达与NSCLC-特异性抗体结合的分子的噬菌体集落，生物淘洗中选出的单个曬菌体裂解液可被自动地点放到例如载玻片(Schleicher and SchuelI,Keene,NH)上，米用 Arrayer (Affymetrix, Santa Clara,CA)来制备带有多个被 NSCLC 患者血清中的抗体结合的候选的噬菌体-表达分子的微阵列。为了鉴别哪种噬菌体展示分子可能是NSCLC-特异性捕获分子(能结合NSCLC-特异性抗体)，例如将筛选载玻片与单个NSCLC患者血清样品一起孵育，理想的不是那些在生物淘洗中所使用的，并使用标准免疫分析方法进一步筛选。与噬菌体结合的抗体可被鉴定，如本领域已知，例如通过采用合适的免疫试剂的双色标记，其中噬菌体载体表达产物用第一种有色或可检测的报告分子标记，来对每个位点的表达产物计量，与噬菌体表达多肽结合的抗体用第二种颜色或区别于第一种报告分子的可检测的报告分子标记。一种解释鉴别NSCLC样品中的抗体结合的与NSCLC相关的或NSCLC特异性的捕获分子的数据的实用方法，是通过多变量的计算机辅助回归分析，这些多变量显示载玻片上所有多肽的平均信号和标准偏差。对单个噬菌体进行统计处理，来确定特异性，并且对多个噬菌体也进行统计处理，来确定是否噬菌体子集对于确定样品是否来自患有还是可能患有NSCLC的患者，能提供更好的预测能力。监测多个样品的统计处理能确定分析的差异性。随着群体取样增加，这种差异性可用于评价分析间的差异性并提供可靠的群体参数。因此，与载玻片、芯片等上的其它噬菌体相比，例如，当信号是> 1、> 2、> 3或更高的标准差偏离正常值(芯片上的平均信号)时，那些与患者样品中的抗体结合更好的噬菌体被考虑作候选噬菌体。在此处所述的一些试验中，候选噬菌体代表用生物淘洗过四次的T7文库构建的筛选芯片上的噬菌体展示多肽的大1/100。候选的噬菌体集落编排在“诊断芯片”上并进一步评价在分辨NSCLC患者的样品与非NSCLC群体的样品中独立预测值。根据诊断标记对受试者中存在或将来存在放射学上可检测的肺癌的预兆/检测/鉴别的能力来选择。由于一些病情有多种病因、多种细胞源等，以及呈现异质背景的任何疾�。蛔榛蚨喔霰昙歉赡茉げ饣蛘锒夏侵痔厥獠∏�。肺癌即是一种这样的病情。如在生物统计领域已知的，能应用一些不同的统计方案来确定相关多重变量的共同预测能力，例如一组标记或与一组标记的反应性。因此，例如能使用动态统计模型来解释来自多个因素的数据，来开发依赖使用两个或以上这样因子的预后检测。其它方法包括Bayesian模型，使用条件概率、最小二乘法分析、部分最小二乘法分析、对数多重回归、神经网络(neural networks)、辨别式分析、基于自由分配等级的分析、其组合、其变量等来选择一组合适的标记用于包括在诊断分析中。目的是处理多元变量，然后处理数据来最大化期望的计量，参见例子，例如Pepe&Thompson, Biostatistics 1,123-140, 2000 ；Mclntosh&Pepe, Biometrics 58,657-664, 2002 ；Baker, Biometrics 56,1082-1087,2000 ；DeLong 等人，Biometrics 44,837-845,1988 ；以及 Kendziorski 等人，Biometrics 62,19-27,2006。因此，在某些情况中，统计处理寻求最大化预测计量，例如接收器工作特性(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)。处理得出公式`途径或算法来最大化依赖于选择的系列变量的结果，揭示任何一个或所有变量对最大化的结果的相对影响。标记的相对影响能在描述系数与变量关系的衍生公式中看到。因此，从这样的分析中选出例如在此后描述的实施研究中鉴定的五个标记的两组，通过包含五个标记的公式来描述最大AUC、得分，用公式中的任何一个标记的相对加权获得用那个任何一个变量的系数来代表的最大预测能力。系数代表加权，衍生公式能看作得出加权和的被加权的变量的总和。目标是在被选择的和优选地最小的多个变量(标记)中找到最大化中的平衡点，例如特异性和敏感性、或阳性预测值，使得在那些参数的启发下能进行机械化诊断分析。为了最大化结果，变量的加权或影响是从目前确定和分析过的数据衍生的，并且随被分析患者的增加重新计算。随患者数量增加，代表关于平均值的可信界限值的群体平均值的计量的可信度也增加。如在此后的实施例中提到的，用实例说明的一组五个标记包括具有单个特异性超过观察到的CT扫描的特异性的标记。任何特异性超过65%的任何一个标记能有利地作为肺癌的诊断分析，因为本分析法和在肺癌诊断中目前的标准一样有效，并且产生费用更低，且以一种非侵入的方式。也要注意，无论怎样的计量，与任何一个标记相比，五个标记一起使用提供更高的预测能力。标记可能在不同的亚群体中有预测性，或者两个或更多标记的表达可能是协同的，例如它们可能有共同的生物存在或功能。总合预测值不是必须可加的，并且标记的不同组合为预测提供不同的准确程度。使用最大化预测力和五个标记的组合的统计处理是基于参照群体研究的结果。因此，原则上，因为两个或更多标记的协同存在以及基于多元标记的诊断的计量，例如此后教导的一组五个标记中的一个，患者样品用五个标记进行检验和诊断，基于五个标记进行计算。如在此讨论的，因为统计处理例如对数回归，任何一个变量对多重计量的贡献可能是对于最大化总和较大或较小的贡献。如果患者得分、总分等是五个标记的总合计量的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多，甚至在患者可能是一个或更多标记阴性的情况中，因为一些或更多重要的加权标记是阳性的，则更可能认为患者是肺癌阳性的。临界得分、总分等这些可能是参考或标准值，其可以是群体平均值，患者/实验样品的相似度的可接受的水平到分数、总分等得出阳性检验结果，提示肺癌存在的可能性，是设计的选择，并且通过提供检测阳性样品的可信范围或水平的统计分析来确定或冒假阳性的危险通过经验开发。如此前教导的，所述水平能是五个标记的总合计量的或群体总和的、参考值等的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多。临界或“耐受值”即来自群体得分、 总分等的患者得分、总分等的可接受的相似度程度是能够被增加的，即患者的得分必须十分接近群体得分来增加敏感性。虽然如本领域已知的知道ROC曲线的形状是预测值等的相关考虑因素，但是标记或一组标记的预测能力能使用任何统计种类来测量例如特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确性、例如ROC曲线的AUC，其中ROC曲线是特异性和敏感性间的相互关系。与单独使用任何一个标记相比，因为一起考虑的多个标记的更大的总合预测能力，多重标记的应用使更强并且在更大的群体中更可能进行诊断的诊断检验成为可能。如此后更详细讨论的，本发明仔细考虑了不同分析形式的使用。微阵列使同时检验多重样品成为可能。因此，微阵列能包括一些对照样品，阳性和阴性的。然后分析法能够对多个样品进行同时处理，例如样品是来自一个或多个已知感染患者的样品、以及来自正常人的一个或多个样品、和一个或多个待一起检验和比较的样品、实验、病人的样品、待检验的样品等。考虑到分析中信号强度的归一化、校准和标准化，在分析中包括内部对照。例如，能够多份运行每个阳性对照、阴性对照和实验，能系列稀释多个样品。对照和实验点也能随机安排在微阵列设备上以尽量减少由于样品在检验设备上的位点引起的变化。因此，具有内部对照的微阵列或芯片可以同时在微阵列和芯片上诊断实验(患者)检验。以受控方式获得的这些多元检验方法和数据使在分析设备内进行患者诊断成为可能，因为准备了合适的对照，并且如果该组标记是单个具有高可能预测能力的，例如ROC曲线的AUC >.85，并且五个标记的AUC总和>.95，那么能够获得诊断结果。当发现一组标记的每个标记都具有相对可比特征例如后面实施例的，则分析能以定性的形式操作。因此，肺癌病人样品可能对五个标记都是阳性，这样的样品是十分可能是肺癌阳性的。能通过确定几率来验证，基于5个标记作为整体，如在此讨论的，获得患者五个标记的计量和或得分，然后比较该数字和标记的预测能力，使用以上讨论的统计工具衍生。对四个标记是阳性的患者，因为四个标记的能力可能是事实的，也应该考虑处于危险，能够用肺癌来诊断和/或应该进行更细致的检查。只对三个标记是阳性的样品可能需要再次检验，一个使用其它标记的检验，放射照相的或其它检验，或在其它给定的时间范围用本分析进行另一次检验。因此，对于一组η标记，衍生了预测能力公式，例如回归公式，规定了解释五个标记对结果的关系的最大可能图。患者可能少于η个标记是阳性，当多数例如50%或一半以上的标记在患者中存在，为进一步考虑，在该情况中可认为是阳性的或可能是阳性的。病人也应该表现肺部疾病潜在症状的明显迹象，因为某些组标记可能对特殊的疾病例如NSCLC是特异性的，可能患者需要进一步的分析以排除其它肺部疾病。因此，在使用η个标记的任何一个分析中，能获得基于被检验的标记的阳性信号总数的整个数目的首要的、定性的结果。合理的临界可能是50%或更多的标记阳性。因此，如果检验四个标记，那么2、3或4个标记阳性的样品假定考虑是可能有肺癌的。如果检验五个标记，那么3、4或5个标记阳性的样品假定考虑是阳性的。临界值能根据设计选择而变化。基于数据的采集和统计处理，从群体的观点，优选的标记组可能是动态的并且可能随时间变化，可能随新的标记的开发而变化，可能随群体的变化、增长等而变化。同样，当被检验的群体大小增加时，标记子集的可信度、加权的系数以及诊断准确可能性可以变得更确切，如果标记是生物或机制相联系的、因而衍生的，可信区间或误差区间会减小。因而，本发明也仔细考虑能在一般群体中使用的标记子集的应用。可选择地，关注的分析设备可包括仅仅一个标记子集，例如在此后实施例中使用的5个标记的组，其对某种群体是优选的。能够通过分析噬菌体集落插入片断编码的多肽来确定表达多肽的氨基酸顺序。例如噬菌体插入片断能用市场上可得到的噬菌体载体引物来PCR扩增。基于大小和PCR产物酶消化形式的不同来鉴别独特的集落，并且独特的PCR产物然后被纯化和测序。通过与已知序列相比鉴别 编码的多肽，已知序列例如使用BLAST搜索程序的GenBank数据库。因此，例如以下的表I和2总结了在肺癌患者中结合自身抗体的肺癌cDNA的T7噬菌体集落。表I
噬菌体集落 # ID _基因符号肽序列
PC84*ZNF440^TLE RN HVN VN S VVN PLVILLPI EYl KELTLEKSLMNIRNVGKHFIVPDPIVD
MKGFTWEKRLINVRNVEKHSRVPV
jMFVYMKGPTLGKISMNVSSVGKHY I
权利要求
1.一种用于减少与针对肺癌的放射照相筛选有关的假阳性的数目的组，所述组包含: 至少三种癌症自身抗原，其能够测量液体样品中的自身抗体生物标记，所述自身抗体生物标记被表明检测到之前未被检测到肺癌的异质性患者群体的肺癌，其中所述生物标记的组共同提供比所述组中的任何一种生物标记更大的组合的敏感性。
2.根据权利要求1所述的组，其中所述生物标记单独或组合地对肺癌有大于65%的特异性。
3.根据权利要求1所述的组，其中所述生物标记的组对肺癌有大于70%、大于80%或大于90%的特异性。
4.根据权利要求1所述的组，其中所述生物标记的组对肺癌有大于30%的敏感性。
5.根据权利要求1所述的组，其中所述生物标记的组对肺癌有大于40%、大于60%、大于70%、大于80%或大于90%的敏感性。
6.根据权利要求1所述的组，其中所述放射照相检验是CT检验或X射线。
7.—组标记在制备用于减少与针对肺癌的放射照相筛选有关的假阳性的数目的装置中的用途，其中所述装置: a)测量一组基于血液的生物标记，其中所述生物标记已被表明在患者群体中正确地预测放射照相手段是否将检测到肺癌； b)预测放射照相手段将检测到肺癌的可能性；并且， c)基于对所述生物标记组的检验，为放射照相检验选择被推断为最可能患肺癌的那些患者。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述生物标记的组对肺癌有超过所观察到的CT扫描的特异性的特异性。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述生物标记具有大于65%的特异性。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述生物标记的组共同提供比所述组中的任何一种生物标记更大的组合的敏感性。
11.一种用于早期检测患者的肺癌的方法，包括: (a)提供一种筛选检验,所述检验包括: i)从所述患者获得液体样品； ii)测量所述样品中的至少四种生物标记，所述至少四种生物标记被表明检测到之前未被诊断为患肺癌的异质性患者群体的肺癌，其中所述至少四种生物标记作为一个组遍及所述异质性群体对肺癌有大于65%的特异性；和 iii)确定所述样品中至少两种自身抗体生物标记的存在，其中所测量的生物标记的存在单独或组合地对肺癌有大于65%的特异性； (b)为肺癌诊断检验选择对所述至少两种自身抗体生物标记的存在为阳性的患者。
12.一种用于提高CT检验检测肺癌的特异性的方法，包括: (a)提供一种检验以选择用于CT检验的患者，其中所述检验包括: a.从所述患者获得液体样品； b.测量所述样品中的至少四种癌症特异性生物标记，所述至少四种癌症特异性生物标记被表明检测到 之前未被诊断为患肺癌的患者群体的肺癌，其中所述生物标记对肺癌有大于65%的特异性；C.由所述至少四种所测量的生物标记确定所述样品中至少两种癌症特异性自身抗体的存在；和 d.为CT检验选择对所述至少两种自身 抗体的存在为阳性的患者；(b)对所选择的患者进行CT检验，其中对于检测由通过步骤(a)的检验选择的患者组成的组的肺癌，CT检验的特异性大于65%。
全文摘要
一种用于测定患者体内存在肺癌的诊断分析法，其部分取决于确定与肺癌相关的抗体的存在。此分析法在放射照相可检测到的癌组织的证据之前预测肺癌。
文档编号G01N33/574GK103245784SQ20131009063
公开日2013年8月14日 申请日期2006年11月10日 优先权日2005年11月10日
发明者爱德华·A·希尔施科维奇, 钟丽, 纳达·H·卡塔, 阿诺德·J·斯托姆博格 申请人:肯塔基大学研究基金会
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