专利名称：杂交瘤细胞株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗伏马毒素 FBl的单克隆抗体，并用于检测伏马毒素FBl污染情况。
背景技术：
伏马毒素(Fumonisin，FB)主要是由串珠镰刀菌产生的真菌毒素。其中FB1是 污染物的主要成分、也是导致毒性作用的主要原因。FB1广泛存在于世界范围的玉米及其 制品中，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。研究证明FB1可引起马的脑白质软化病 (equineleukoencephalomalacia, ELEM)禾口猪的月市水月中综合症(porcinepulmonary edema， PPE)。流行病学资料显示，人类膳食中FB1污染与食管癌高发有一定的关联。因此建立一 种快速、灵敏、简便的检测方法成为当务之急。目前，用于分析食品及饲料中的FB1的检测方法较多，有高效液相色谱法(HPLC)、 液相色谱一质谱联用(LC-MQ、气相色谱(GC)、毛细管电泳法(CZE)等。尽管这些方法具有 较高的灵敏度，但样品的前处理步骤较多，相对费时且费用较高，特别是不适用于大量样品 的筛选。酶联免疫检测方法(ELISA)提供了一种伏马毒素FB1的快速、灵敏、简便的检测 方法。科学家们先后建立了几种测定FB1 WELISA检测方法。1994年，Satoshi Fukuda, Ayumu Nagahara, Mamoru Kikuchi 等在 Biosci. Biotech. Biochem.发表《Preparation and Characterization ofAnti-Fomonisin Monoclonal Antibodies》(Vol. 58(4),765-767)。 2000 年，Ildiko Barna-Vetro, Erzsebet Szabo, bela Fazekas 等在 J. Agric. FoodChem. 发表〈〈Development of a Sensitive ELISA for the Determination ofFumonisin B1 in Cereals)) (Vol. 48, 2821-2825)中以单克隆抗体测定谷物中的 FBI。2003 年，Μ. Ε. SAVARD， R.C. SINHA, R. LAU, C. SEGUIN 等人在 Food and Agricultural Immunology 发表的 ((MonoclonalAntibodies for Fumonisin BljB2Bnd B3)) (Vol. 15,127-134)中以单克隆抗体 对玉米样品中FB1的检测建立了直接ELISA法。目前我国报道关于FB1的ELISA检测方法 还很少。本发明为检测FB1，提供一种新的杂交瘤细胞株，能很好地检测出玉米及其饲料制 品中伏马毒素的污染量，为保障食品的安全和畜牧业的快速健康发展提供了有力的检测工 具和手段。
发明内容
本发明的目的在于针对目前检测伏马毒素FBl存在的问题，提供一种能产生与 FBl发生抗原抗体反应的IgM亚型抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明的目的是这样实现的一种杂交瘤细胞株，其特征在于在中国典型培养 物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO :C201008，保藏时间为2010年4月15日，保藏地 址为中国武汉武汉大学。
在本发明中一种杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于a)将免疫抗原FB1-KLH与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射每只 BALB/C小鼠，每次注射体积为0. 2mL,毒素量为40 μ g，对BALB/C小鼠实施基础免疫；b)将免疫抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔两周腹腔注射进行 一次，重复3 4次，每次注射体积为0. 2mL，毒素量为40 μ g ；将免疫抗原与浓度为0. 9 % 的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，经腹腔注射，毒素量为80 μ g，对BALB/C小鼠实施 加强免疫；c)按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10 1的比例以50%的 PEG4000进行融合，用HAT培养液选择培养，融合后10 15d，取上清采用间接ELISA法筛 选分泌抗FB1的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克�。籨)重复c步骤，经过4次亚克隆和间接ELISA筛�。玫揭恢昴芪榷ǚ置诘タ寺】� 体的杂交瘤细胞株。一种上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于它与FBl发生抗原抗体 反应，属IgMK型，是由杂交瘤细胞株的培养液中获得，或用杂交瘤细胞株细胞种植到实验 动物腹腔产生腹水而获得。其中，所述的由杂交瘤细胞株的培养液中获得是指将杂交瘤细 胞细胞按IX IO6接种量接种到5mL含20%新生小牛血清的RPMI1640培养基中，在37°C含 5% CO2的细胞培养箱中培养3天，然后将细胞培养液在SOOrpm下离心lOmin，收集上清，获 得单克隆抗体；所述的用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得是指选 择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠腹腔注射杂交 瘤细胞1 X 106-2X IO6个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水，收取的 腹水与4°C、13000rpm离心30min，收集上清，获得单克隆抗体。一种上述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体 用于检测伏马毒素FBI。在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体配置在检测伏马毒素FBl免疫试 剂盒中。在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体制成用于检测伏马毒素FBl的胶 体金免疫试纸条。在杂交瘤细胞株的应用中，将所述的单克隆抗体制成用于检测伏马毒素FBl的免 疫亲和柱。在杂交瘤细胞株的应用中，通过把杂交瘤细胞产生的抗体用胰蛋白酶或其类似物 经酶处理，或经还原可获得本发明的抗体片段。通过从杂交瘤细胞中提取mRNAjEWmRNA 制备的cDNA插入到原核或真核表达载体中，再将载体导入原核或真核细胞中，然后在其中 表达所需的产物也可获得抗体片段。本发明的优点在于本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对伏马毒素FBl 的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明的优点还在于利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途 径，对实际生产有较好的应用价值。
图1抗体SDS-PAGE电泳2用间接竞争ELISA法测定抗体反应标准曲线图3免疫胶体金试纸条功能区，其中1 玻璃纤维素膜2:聚氯乙烯板3:纤维素 膜4 检测线5 对照线6 吸收垫图4为伏马毒素FBl结构式(Fumonisin Bi)
具体实施例方式杂交瘤细胞株的建立一、实验材料1.培养基RPMI1640、新生小牛血清、双抗、HAT和HT选择培养基均购自Gibco公 司；弗氏完全/不完全佐剂、降植烷购于Sigma公司。2.实验动物Balb/c小鼠，6_8周龄，雌性，按一级动物喂养。3.其他材料PEG4000、HRP-羊抗小鼠IgG购自购于Sigma公司；其他试剂均为国 产分析纯。二、免疫抗原和筛选抗原的合成A、采用戊二醛二步法合成FB1-KLH免疫抗原(伏马毒素FB1与乙酰化匙孔緘血蓝 蛋白偶联物)，具体步骤如下(1)将 25% 的戊二醛(GA)用 PH7. 4 的 PBS 稀释至 2% ；(2)将60mg KLH用上述戊二醛溶液6ml溶解，4°C连续搅拌反应24h后，在PBS缓 冲液中透析36h，除去未反应的戊二醛；(3)将Img FB1溶于ImL甲醇中，逐滴加入到上述KLH溶液中，室温搅拌反应1 浊，然后于4°C连续搅拌15 20h过夜，形成混合液；(4)向上述混合液中加入IOOOppm的硼氢化钠(NaBH4) 600 μ 1，搅拌2h，中止反应， 形成反应液1 ；(5)将上述反应液1装入透析袋，在PBS缓冲液中透析72h，分装，_20°C保存备用。B、采用戊二醛一步法合成FB1-OVA筛选抗原(伏马毒素FB1与卵清白蛋白OVA偶 联物)，具体步骤如下(1)称取7mg OVA溶解于ImL 25%乙醇中；(2)将ImgFB1溶于ImL甲醇中在磁力搅拌下于逐滴加入到上述蛋白溶液中，于4°C 缓慢加入25 % GA溶液90 μ L，密封后置于4°C连续搅拌过18 Mh，形成反应液2 ；C3)将上述反应液2装入透析袋，在PBS缓冲液中透析72h，分装，-20°C保存备用。三、杂交瘤细胞株的建立1.动物免疫(1)基础免疫将免疫抗原TO1-KLH与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔 注射每只BALB/C小鼠，每次注射体积为0. 2mL,毒素量为40 μ g。(2)加强免疫加强免疫采用免疫抗原与弗氏不完全佐剂的乳化液，每隔两周进 行一次。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含80 μ g免疫抗原的生理盐水溶液。2.杂交瘤细胞的制备
按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10 1的比例以50%的 PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10_15d，取上清采用间接ELISA法筛选 分泌抗FB1的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下用2 μ g/mL FB1-OVA包被酶标板，用免疫小鼠血 清1 100作为阳性对照，无克隆生长的培养上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加 1 10000羊抗鼠IgG-HRPlOO μ L，最后测定450nm值，凡OD45tl值大于阴性对照2倍以上 者，即可初步判定为阳性克隆。3.杂交瘤细胞株的建立重复步骤2，进行4次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛�。玫揭恢昴芪� 定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E10，并于2010年4月15日在中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO :C201008，保藏地址为中国武汉武汉大学。4.应用杂交瘤细胞株4E10所得单抗的效价测定将4E10细胞在含20%新生小牛血清的RPMI1640培养基中培养传代，每3天传代 一次，传代到16代后进行单抗效价测定。(1)细胞培养液上清效价测定将第16代细胞按IX IO6接种量接种到5mL含20% 新生小牛血清的RPMI1640培养基中，在37°C含5% CO2的细胞培养箱中培养3天，然后将 细胞培养液在SOOrpm下离心lOmin，收集上清，用间接ELISA法测定上清中单抗效价，结果 表明上清效价为1 2000-1 4000。(2)小鼠腹水效价测定选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植 烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1 X 106-2 X IO6个，待小鼠腹部明显膨大到一定 程度后，用9号针头抽取腹水。收取的腹水与4°C、13000rpm离心30min，收集上清。用间接 ELISA法测定上清中单抗效价，效价为1 IX IO4 1 1X105。5. 4E10细胞株的传代培养将4E10细胞株在含20%新生小牛血清的RPMI1640培养基中继续进行培养、传代， 培养到60代后，杂交瘤细胞株4E10仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以 达到1 2000以上。以上结果表明，所得4E10细胞株能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗伏马毒素 FBl的单克隆抗体。实施例2、应用4E10细胞株制备抗FB1的单克隆抗体一、抗体制备选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠腹 腔注射杂交瘤细胞1 χ 106-2X IO6个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取 腹水。收取的腹水于4°C，13000rpm离心30min，收集上清。收集的腹水采用饱和(NH4)2SCUX淀法进行纯化，具体步骤为取上述步骤中的 上清，加入等体积PBS缓冲液，再加入等体积醋酸缓冲液和33 μ L辛酸，磁力搅拌30min。 于4°C，3000rpm离心30min，取上清；加入等体积的饱和(NH4)2SO4溶液，4°C静置4h，再于 4°C、3000rpm离心30min，弃上清；沉淀中加入与第一次相同体积的PBS缓冲液，透析，每隔 证换液一次，透析后的蛋白溶液过0. 45 μ m孔径的微孔膜，得到抗FBl的单克隆抗体(mAb 4E10)。
二、抗体mAb 4E10鉴定及结果如下1、抗体纯度鉴定将mAb 4E10用12% SDS-PAGE电泳鉴定纯度，电泳图如图1所示，图中A为蛋白标 记物，B为细胞株4E10所生成的小鼠腹水，C为纯化后的小鼠腹水，D为纯化上清。2、抗体mAb 4E10亚类鉴定采用小鼠抗体分型试剂盒(sigma)鉴定抗体的亚型。测定结果表明mAb 4E10的 亚型为IgM。3、检测抗体mAb 4E10的轻链和重链的氨基酸序列。经氨基酸序列测序表明，抗体mAb 4E10的重链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸残基序列，轻链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列。4、交叉反应率(Cross Reactive, CR% )利用FB1标准品和类似结构的相关化合物进行交叉反应实验。交叉反应率(CR)= IC5tl (FB1)/IC5tl (其它类似物)X 100% (IC5tl是抑制率为50%的吸光度时所对应的标准品浓 度)。从下表数据可知，本发明的抗体除了与结构形似的FB2有一定的交叉反应，与其他类 型的真菌毒素交叉反应率很低，说明本抗体具有较好的特异性。表ImAb 4E10与镰刀菌属产生的其它毒素的交叉反应
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于其保藏编号为CCTCC N0:C201008。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于按如下步骤获得a)将免疫抗原FB1-KLH与弗氏完全佐剂混合并充分乳化，腹腔注射对BALB/C小鼠实施 基础免疫；b)收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用HAT培养液选择培养，融合后 10 15d，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗FB1的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采 用有限稀释法进行亚克�。籧)获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆 抗体与FBl发生抗原抗体反应，属IgM亚型的抗体，是由杂交瘤细胞株的培养液中获得，或 用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体重链的氨基酸序 列为序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸残基序列，所述的单克隆抗体轻链的氨基酸序列为序 列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于由杂交瘤细胞株的培养液中获得 是指将杂交瘤细胞细胞按ι χ IO6接种量接种到5mL含20%新生小牛血清的RPMI1640培 养基中，在37°C含5% CO2的细胞培养箱中培养3天，然后将细胞培养液在SOOrpm下离心 IOmin,收集上清，获得单克隆抗体；用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而 获得是指选择健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠 腹腔注射杂交瘤细胞IXlO6 2X IO6个，待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头 抽取腹水，收取的腹水于4°C、13000rpm离心30min，收集上清，获得单克隆抗体。
6.一种根据权利要求1所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株产生 的单克隆抗体用于检测伏马毒素FBI。
7.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体配置在 检测伏马毒素FBl免疫试剂盒中。
8.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体制成用 于纯化伏马毒素FBl的胶体金免疫试纸条。
9.根据权利要求6所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于将所述的单克隆抗体制成用 于纯化伏马毒素FBl的免疫亲和柱。
10.一种根据权利要求1所述杂交瘤细胞株的应用，其特征在于通过把杂交瘤细胞产 生的抗体用胰蛋白酶或其类似物经酶处理，或经还原可获得的抗体片段；通过从杂交瘤细 胞中提取mRNA，把从mRNA制备的CDNA插入到原核或真核表达载体中，再将载体导入原核或 真核细胞中，然后在其中表达所需的产物也获得抗体片段。
全文摘要
本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗伏马毒素FB1的单克隆抗体，并用于检测伏马毒素FB1污染情况。一种杂交瘤细胞株，其特征在于其保藏编号为CCTCC NOC201008。本发明的优点在于本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对伏马毒素FB1的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明的优点还在于利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。
文档编号G01N33/577GK102127523SQ20101055662
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者史建荣, 徐�：�, 林凡云, 祭芳, 薛秋燕 申请人:江苏省农业科学院
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