专利名称：包含气泡形成机构的分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析装置、在执行分析的过程中控制液体沿着分析装置流动的方法、 使用分析装置执行分析的方法以及制造分析装置的方法。
背景技术：
廉价的一次性分析装置，例如在家庭或护理现场常规使用的类型的分析装置，倾 向于属于两种类型中的一种横向流分析装置和微流体装置。横向流分析装置，例如在EP^1194中公开的，是其中将液体样品直接或(更通常) 间接地施加到多孔基质、例如硝酸纤维素或纸质滤器上的分析装置类型。液体样品沿着多 孔基质迁移，通常调动了可释放地固定化在多孔基质上的干燥的分析试剂或组分(典型为 标记的抗体，例如标记的抗体微粒)。标记的抗体典型与样品中的目标分析物形成复合物， 然后所述标记的复合物通常被针对目标分析物的第二抗体捕获在多孔基质的检测区中。因 此，标记的结合试剂在检测区或带中的积累，表明了液体样品中分析物的存在、不存在或程 度。应该认识到，还存在横向流分析的其他变体，特别是竞争形式的分析法，其中标记的试 剂倾向于在样品中不存在分析物时被捕获在检测带中。横向流分析装置常规地用于例如确 定妊娠激素hCG的存在或不存在，并为用户提供妊娠或未妊娠的指示。检测带处标记的试剂的检测，可以通过目测或利用光电检测器来进行。目测读取 的非电子分析装置具有低成本的优势，但是与这种分析装置、特别是验孕装置和/或家庭 使用的分析装置相伴的问题，是它们提供强度可变的信号作为分析结果，其可能需要一定 程度的解释。这为分析结果的错误解释留下了空间，特别是当分析装置的用户或读取者在 思想中已有倾向性的分析结果时。这些测试通常作为阈值测试提供，其中在夹心分析法的 情况下，标记的试剂的水平低于阈值表示负结果，标记的试剂的水平高于阈值表示正结果。 因此，开发了电子数字装置，其中标记的试剂的存在或量利用光电检测器测定，并将分析的 结果显示在LCD显示器上。这样的数字装置的优点在于它们提供了不需要解释的明确结果 例如“是”或“否”。这样的装置可以是单次使用的，因此是一次性的。但是，它们的生产昂 贵，因为它们典型地需要一个或多个光电检测器、一个或多个光源例如LED、电源、电子线路 和数字显示器。此外，电子装置的处置具有环境问题。在微流体分析装置中，可以利用许多与横向流分析中使用的相同的原理。但是，不 是将液体样品施加到多孔基质上，而是将样品施加或进样到管道或通道中，液体通常利用 毛细作用沿着其前进。检测带可以提供在通道提供有例如固定化的结合试剂的内表面上。 微流体装置的特殊优点在于流路是明确界定的，并且装置可以被设计成包含微加工元件例 如分支、混合区、流动控制元件、定时门电路、过滤器等等。微流体分析装置的实例描述在 US5458852 中。用于测量分析物的、其中液体沿着流路的流动速率指示分析物的存在或程度的分 析装置是已知的。US4963498公开了用于测量流体样品中的分析物或流体样品的性质的微流体装 置，其中装置中存在的试剂影响样品的流速。装置可以包含测试毛细管和参比或对照毛细管二者。EP456699公开了用于测试液体中物质的存在的设施，包括加样端口，其与相应的 指示室上游的许多流体管道相连。根据一个实例，流体管道中存在的凝集试剂与样品相互 作用以改变其流速，例如阻止液体在分析时限内到达指示室。W02004/083859也公开了用于测试物质存在的毛细管装置。装置通过在目标分析 物(典型为人类绒毛膜促性腺素，hCG)存在下引起液体样品在测试毛细管中的凝集来工 作，所述凝集阻止了液体样品在测试毛细管中的流动，但不阻止在对照毛细管(其不含凝 集试剂)中的流动。在测试和对照毛细管的下游部分处液体样品的存在或不存在，通过电 极进行检测。还已了解到(例如从WO 2006/090144)提供了下述的微流体分析装置其中形成 的流路具有间断处，例如以流路通道的一部分具有太大而不能被前进的液体样品桥接的孔 或口的形式；并且其中孔或口可以充有相同或另外的液体(例如已经沿着第二条流路流动 的液体)，由此用作“桥”以允许液体样品前进通过间断处。这种布置可以形成“二元分析 装置”的基�。渲醒分心勘攴治鑫锏拇嬖诨虿淮嬖谟跋炝艘禾逖费刈欧治鲎爸媚谝� 条或多条不同流路前进的速率，这继而可以决定沿着特定的一条流路流动的液体是否进入 分析装置的“指示”区，由此以简单的定性术语(例如“是”或“否”)指示分析的结果，从而 消除了关于分析结果的解释的任何主观性要素，而不需要复杂精细的电子学或其他显示机 构。在W02008/025945中公开了上述布置的变体，其中在沿着“测试”流路流动的液体 与沿着参比流路流动的液体之间存在“赛跑”。存在一个汇合区，测试和参比流路在该区中 彼此接触。如果沿着参比流路流动的液体“赢得赛跑”并在沿着测试流路流动的液体之前 到达汇合区，那么液体沿着测试流路的进一步流动被阻止。发明概述在本发明的第一方面，提供了用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的 方法，所述方法包括下列步骤将怀疑含有分析物的液体样品与气体产生机构相接触，所述 气体产生机构取决于分析物的存在、不存在或量形成气体，所述气体在液体样品中产生一 个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路流动的作用；以及确定液体中流动的改变， 其中液体沿着流路流动的改变指示了液体样品中分析物的存在和/或量。流动改变的确定可以包括确定由于液体流动的改变导致的结果。这样的结果可以 是例如液体已经到达特定区域的指示。在其中测定流动改变的液体，可以是液体样品本身。或者，它可以是第二种液体， 其中液体样品与第二种液体流体连通，使得液体样品中一个或多个气泡的产生引起第二种 液体中流动的改变。第二种液体可以施加到装置上，方法可以在装置中执行或可以构成装 置的一部分。第二方面，本发明提供了确定液体样品中分析物的存在和/或量的方法，所述方 法包括下列步骤a)将怀疑含有分析物的液体样品与用第一试剂标记的结合试剂相接触，其中结合 试剂能够与分析物结合或与分析物的结合试剂结合；b)在积累区处引起标记的结合试剂的积累，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于液体样品中分析物的存在、不存在或量；以及c)将积累区处的标记的结合试剂与第二试剂相接触，使得第一和第二试剂反应形 成气体，所述气体在液体样品中产生一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路流 动的作用，其中液体沿着所述流路流动的改变指示了液体样品中分析物的存在和/或量。本发明的目的是提供相对廉价的分析装置，其在优选实施方案中能够为液体样品 中分析物的确定提供明确的或“二元的”或数字的结果，其中分析装置没有或很少有电子部 件。在实施方案中，本发明能够提供这样的分析装置，其能够提供可光学检测的二元或数字 分析结果，其中分析装置不包含需要电源的元件或电源本身。元件包括下列一种或多种光 电二极管，光电检测器，电子显示器和电子线路。优选结果可以通过肉眼目测。根据第三方面，本发明提供了用于确定施加或以其它方式导入到装置的液体样品 中分析物的存在和/或量的分析装置，所述装置包含至少一条分析流路，液体沿着其流动；气体产生机构，其取决于分析物的存在、不存在或量而产生气体，所述气体在液体 样品中产生一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路向下游区域流动的作用；以 及用于检测液体流动的任何改变的检测机构，和/或用于检测下游区域处液体的存 在或到达的指示区；其中液体沿着流路的流动的改变，指示了分析物的存在和/或量。气体产生机构可以包含第一试剂，当第一试剂与适合的第二试剂接触时引起或以 其它方式参加直接或间接产生气态产物的反应。分析装置典型地包含在两种或多种试剂之 间的反应中所需的至少一种试剂，所述反应形成气体作为直接或间接产物。优�。治鲎爸� 将包含用于发生气体产生反应所需的所有试剂。试剂可以包括例如两种或多种反应剂，或 至少一种反应剂和催化所述反应剂转变成气态产物的催化剂(例如酶)。—个或多个气泡的形成倾向于抑制液体沿着流路的流动，典型地在一个或多个气 泡所在区域或一个或多个气泡下游的区域中。沿着流路的流动可以被一个或多个气泡的形 成所终止。或者，气泡的形成可以增加液体沿着流路的流速。在第四方面，本发明提供了用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的分 析装置，所述装置包含a)样品施加区，用于向装置施加液体样品；b)至少一个分析流路，液体沿着其流动；c)用第一试剂标记的结合试剂，提供在所述流路内提供的积累区上游，所述结合 试剂能够与分析物或分析物的结合试剂结合；d)能够固定标记的结合试剂的积累区，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于 液体样品中分析物的存在、不存在或量；装置在使用中使得在任何固定在积累区处的标记 的结合试剂与第二试剂之间发生反应而产生气体，所述气体在液体样品中形成一个或多个 气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路流动的作用，其中液体流动的改变指示了液体样品 中分析物的存在或量；以及e)用于检测液体流动的任何改变的检测机构，和/或提供在积累区下游用于检测 液体的存在或到达的指示区。标记的结合试剂可以分析物依赖性方式积累在积累区处。液体中存在的分析物可以与标记的结合试剂形成分析物-结合试剂复合物，其可以随后积累在积累区处。分析物的第二结合试剂可以固定化形式提供在积累区处，以便捕获分析物-标记 的结合试剂复合物。替代或此外，分析物可以在与标记的结合试剂形成复合物之前，被固定 化的第二结合试剂捕获在积累区。还或者，第二结合试剂可以能够被固定化在积累区处的可固定形式提供。例如，积 累区可以用结合试剂例如生物素标记，分析物的第二结合试剂用积累区处结合试剂的互补 结合配偶体、例如链亲和素标记。在另一个实施方案中，分析物的第二结合试剂可以与磁性粒子结合。磁体可以提 供在积累区附近以便固定磁性标记的第二结合试剂。形成的任何第一结合试剂/分析物/ 第二结合试剂复合物都可以例如利用磁体移动到积累区中。还或者，积累区可以包含尺寸排阻滤器，其中第二结合试剂不能通过滤器。第二结 合试剂可以例如结合到直径大于滤器中孔的平均孔径的粒子上。因此，任何第一标记的结 合试剂/分析物/第二结合试剂复合物保留在滤器处，而未复合的标记的结合试剂能够通 过它。分析物的测定可以通过竞争或抑制类型的反应来进行。标记的结合试剂可以包含 标记的分析物或分析物类似物。该方法适合用于检测小的分析物，例如半抗原。例如，分析 物或分析物类似物可以固定在积累区处，其可用于捕获标记的结合试剂。或者，用于分析物 的结合试剂可以提供在积累区处，标记的分析物或分析物类似物提供在积累区上游，其与 任何存在的分析物竞争积累区处的结合试剂。代替或除了提供在积累区上游以外，标记的结合试剂可以提供在积累区处。装置还可以包含提供在积累区上游的第二试剂，使得在使用中，所有或基本上所 有标记的结合试剂在第二试剂到达积累区之前被运输到所述区。根据第五方面，本发明提供了用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的 分析装置，所述装置包含a)样品施加区，用于向装置施加液体样品；b)至少一条分析流路，液体沿着其流动；c)用第一试剂标记的结合试剂，提供在所述流路内提供的积累区上游，所述结合 试剂能够与分析物或与分析物的结合试剂结合；d)提供在所述积累区上游的第二试剂；以及e)能够固定标记的结合试剂的积累区，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于 液体样品中分析物的存在、不存在或量；装置使得在使用中，所有或基本上所有标记的结合 试剂在第二试剂到达积累区之前被运输到所述积累区，随后，第二试剂到达积累区导致在 任何固定在积累区处的标记的结合试剂与第二试剂之间发生反应而产生气体，所述气体在 液体中形成一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路流动的作用，其中液体流动 的改变指示了液体样品中分析物的存在和/或量。第二试剂可以提供在与第一试剂分开的流路中。分析装置可以包含两条流路，其 中第一试剂提供在第一条流路中，第二试剂提供在第二条流路中。第一和第二条流路可以 在积累区处或其上游的交汇处交汇。可以提供第一和第二条流路，使得标记的结合试剂到 达积累区所花费的时间少于第二试剂到达所述区域所花费的时间。实现这一点有许多不同方式。两条流路可以在其相应的长度、宽度、表面涂层或其组合上彼此不同。一条流路可以 提供有一个或多个流动限制或流动促进元件等等，使得第二试剂在所有或基本上所有标记 的结合试剂之后到达积累区。在使用中，施加到装置的液体样品将重新悬浮分别提供在第一和第二条流路中的 第一和第二试剂，并取决于存在的分析物的程度，导致标记的结合试剂积累在积累区。由于 第一和第二条流路之间的差异，所有或基本上所有标记的结合试剂将在第二试剂到达之前 到达积累区。任何没有积累在积累区处的标记的结合试剂将随着液体样品通向下游。因此 在积累区处一个或多个气泡的形成，原则上将是由第二试剂与任何积累在积累区处的第一 试剂之间的反应引起的，并因此指示了存在的分析物的存在和/或量。第一和第二条流路之间的交汇点能够使来自分离的流路的两个流体流合并在一 起成为单一流路。优选对交汇点进行设计以便不引入可能阻碍来自任一流路的流体通向交 汇点下游的气锁(air lock)。分析装置可以包含将第一和第二条流路相连的共同的样品施加区。因此，施加或 以其它方式引入到分析装置的单一液体样品将能够同时沿着第一和第二条流路流动。可以设想将第一和第二试剂相继投送到积累区的其他方式。例如，分析装置可以 包含位于流路中间某处的样品施加区，使得施加到装置的液体样品向两个方向流动，分别 离开和朝向积累区。第一和第二试剂可以提供在装置中，使得从积累区流走的液体样品调 动第二试剂，而流向积累区的液体样品调动第一试剂。分析装置可以包含液体接收槽，当它 与液体样品、典型为包含第一试剂的部分接触时，能够将所有施加到装置的液体样品向积 累区牵引。因此在使用中，所有或基本上所有第一试剂可在第二试剂到达之前到达积累区。装置可以包含用于确定液体流动的改变的机构。流动改变的确定可以通过测量液 体的流速来进行。流动改变可以根据一个或多个流速阈值来确定。分析装置可以包含检测流路中、例如积累区下游液体样品的存在的机构。例如，分 析装置可以包含一个或多个电极对以检测液体样品的存在。可以测定相应电极对之间的流 速。这可以通过例如以一个或多个相隔的间距提供多个电极对来实现，每个电极对能够确 定液体样品的存在。分析装置还可以包含简单的定时器，以便记录液体样品沿着流路行进 所花费的时间。也可以通过将分析流路、为了方便起见也可以称为“测试”流路中液体的流动与参 比流路中液体的流动进行比较，来进行流动改变的确定。分析装置可以包含一个或多个指示区，用于指示液体到达一个或多个下游区域。 指示区优选可以目测，并可以包含例如变色机构，例如与液体反应产生颜色的化学物质。变 色机构可以固定在流路中，或可以例如包含可以溶解在液体中的干燥的有色染料。变色机构可以对pH敏感。指示区典型地提供在积累区下游。指示区可以例如包 含腔室，液体可以进入其中并且液体可以通过它。腔室可以提供在流路的末端，使得流体进 入腔室并停止任何进一步流动。分析装置还可以包含参比流路，其中将液体沿着参比路径的流动与液体沿着分析 流路的流动进行比较。参比流路可以不含任何能够产生气体的试剂。分析装置可以包含两 个指示区，分别提供在测试流路的积累区的下游和朝向或位于参比流路的远端。共同的样 品施加区可以将分析和参比流路相连，使得施加到装置的液体样品能够沿着相应的流路流动。测试和参比流路可以各自包含指示区。指示区可以彼此不同，以便提供视觉不同 的结果。例如，由于提供了不同的变色机构，相应的测试和参比流路的指示区可以产生不同 的颜色。或者，两个指示区可以显示出反映例如“阳性”或“阴性”的单词或符号。可以通过减少或停止液体或其一部分的流动来改变液体的流动。或者，可以通过 增加或重新开始液体或其一部分的流动来改变液体的流动。出人意料的是，本发明人已经发现，只有当第二试剂与相对高浓度量的固定化在 积累区的标记的结合试剂接触时，才产生显著程度的气泡。通过优化标记的结合试剂和第 二试剂的量、装置的流体尺寸和标记的结合试剂与第二试剂在装置内的相对位置，可以将 第二试剂与未固定化的结合试剂之间的任何反应保持在最低程度，而不必然有损于分析的 性能。在第六方面，本发明提供了用于确定液体样品中分析物的存在和/或量的分析试 剂盒，所述试剂盒包含a)分析装置，其包含流路，流路中提供了能够固定标记的结合试剂的积累；b)用第一试剂标记的结合试剂；以及c)第二试剂，其能够与第一试剂在积累区进行反应以产生气体，所述气体在液体 中形成一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路的流动的作用，其中液体流动的 改变指示液体样品中分析物的存在或量。在第七方面，本发明提供了改变液体样品沿着流路的流动的方法，所述方法包括 下列步骤a)向流路施加样品，从而在提供在流路内的积累区处积累第一试剂；以及b)然后将固定的试剂与第二试剂相接触，使得第一和第二试剂反应而形成气体， 所述气体在液体中产生一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路的流动的作用。第七方面的方法可以进一步包含检测或确定液体样品流动的任何改变的步骤。在第八方面，本发明提供了用于检测液体样品沿着流路的流动改变的装置，包 含a)用于向装置施加液体样品的样品施加区；b)至少一条流路，液体沿着其流动；c)提供在积累区上游的第一试剂；d)能够积累第一试剂的积累区；使得装置在使用中，在积累区处积累的第一试剂 与第二试剂之间发生反应以产生气体，所述气体在液体中形成一个或多个气泡，所述气泡 起到改变液体沿着流路的流动的作用；以及e)用于检测液体样品流动的任何改变的检测机构，和/或提供在积累区下游用于 检测液体的存在或到达的指示区。第八方面的装置还可以包含提供在积累区上游的第二试剂，使得在使用中，所有 或基本上所有第一试剂在第二试剂到达积累区之前被运输到所述区域。一条或多条流路可以包含微流体通道、多孔基质(例如层析膜)或二者的组合，或 由其构成。优选的多孔基质包括硝酸纤维素和滤纸。微流体通道优选为毛细尺寸的，以便 液体样品能够通过毛细流动沿着通道前进。典型的微流体通道的内部横截面尺寸在0.1到500 μ m之间，更典型在1到100 μ m之间。微流体通道可以由例如合成塑料材料例如聚碳 酸酯、聚酯、环氧树脂或玻璃或金属形成。通道可以使用常规技术通过蚀刻、浇铸、模制等形 成。装置可以包含典型宽度为1mm、典型高度为100 μ m的微流体通道。装置可以包含 多个层，例如下基底层、包含通道结构的中间层和用于密封微流体通道的上层。目标分析物可以包括例如留类化合物、激素、肽或多肽、糖类、脂类、蛋白质、脂蛋 白、多核苷酸、酶、血型标志物、疾病标志物、诊断或预后指示物、阳离子、阴离子或分子复合 体例如病毒、细菌、酵母、真菌、孢子或真核细胞。在一个优选实施方案中，目标分析物包括 hCG。在另一个实施方案中，分析物是葡萄糖。本发明的分析装置适合检测的分析物包括小 分子，例如半抗原。半抗原可以被定义为只有当与载体偶联时才能引发免疫应答的小的抗 原决定簇。半抗原与抗体结合，但是它们自身、例如通过将半抗原注射到动物体内不能引发 抗体反应。半抗原的非限制性的实例包括基于安非他明的滥用药物，例如MDA(3，4_亚甲基 二氧基安非他明)、MDMA也称为“摇头丸”(3，4-亚甲基二氧基-N-甲基安非他明)、MDEA(3， 4-亚甲基二氧基-N-乙基安非他明)、BDB(3，4-亚甲基二氧基苯基-2-丁胺)、MBDB(3， 4-亚甲基二氧基苯基-N-甲基丁胺)和MDPA (3，4-亚甲基二氧基-N-丙基安非他明)；鸦 片制剂例如吗啡和可待因，以及它们的合成类似物，其包括海洛因、氢吗啡酮、氢可酮、氧可 酮和氧吗啡酮；麦角酸二乙基酰胺(LSD)及其代谢物；四氢大麻酚和可卡因；有毒药物例如 地西泮、尼古丁、对乙酰氨基酚、咖啡因、利培酮、苯巴比妥；激素例如黄体酮、雌二醇及其代 谢物、睾酮；杀虫剂；染料例如荧光素异硫氰酸酯、德克萨斯红等。液体样品可以是任何适合的液体，例如水、污水样品或水性提取液(例如水性食 物或饮料样品)或生物样品，例如血液、血浆、血清、尿液、脓、汗液、唾液、阴道液或泪液。优 选的样品是尿液。液体样品可以“原样(neat) ”施加到装置，或可以进行预处理步骤(例如， 包括下列的一种或多种混合，搅拌，超声，稀释，温育，变性，或与一种或多种试剂反应)。在其中形成气泡的液体可以方便地是基本上就此施加到装置上的样品液体(但 是允许作为与分析装置接触的结果使液体的组成发生任何改变，例如沉积或以其它方式提 供在分析装置的流路中的试剂或其他物质重新悬浮或溶解在样品液体中)。替代或此外， 气泡可以在某些其他液体中形成，例如单独施加到分析装置的缓冲洗涤液或补加的试剂溶 液。在任一种情况下，液体一般是水性的(即高于50% v/v H2O)。应该理解，由试剂形成的气体，在执行分析的温度和压力条件下，在液体的流动将 被阻止或减小的时间长度内，必须至少部分不溶于液体中。一般来说，分析将在室温(即约 18-250C )下进行，但是分析可以在冷室或冰箱中(在约3-6°C下)进行，或可以在温箱中 (在约25°C到约40°C的温度下)进行。分析将典型在大气压下(通常这将在海拔970毫巴 到约1030毫巴的区域内)进行。因此，形成的气体的浓度，在执行分析所花费的至少一部 分时间内，必须高于气体在相关液体中的溶解度。优选的是在液体样品中具有低的溶解度 水平的气体，例如氧气。在上述制约内，用于形成气泡的气体可以是任何适合的气体，尽管显然高毒性或 高反应性物质是不太优选的。适合的气体可以包括但不限于氧气、臭氧、二氧化碳、一氧化 碳、甲烷、乙烷、氮气、氮氧化物、氢气、氦气、惰性气体或上述任何两种或多种的任何组合。 一般来说，优选的气体包括氧气、二氧化碳、氮气和氢气。
第一试剂是能够与第二试剂反应产生气体的试剂。第一和/或第二试剂可以作为 样品液体的一部分提供到分析装置，或作为独立添加到分析装置的液体，或更优选将形成 分析装置的一体化部分，例如以干燥或冷冻干燥的形式沉积在分析装置上或其中，典型地 沉积在一条或多条流路上或其中。第一试剂可以是酶。适合用作第一试剂的酶包括氧化还原酶，例如过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。过氧 化氢酶(EC 1. 11. 1.6)催化过氧化氢降解为水和氧气。该反应是有用的，因为除了产生所 需的气体(在该情况下是氧气)之外，唯一的其他产物是水，其对分析的性能或其结果没有 显著影响。过氧化氢酶可以高纯度广泛地商购，并可以冷冻干燥。使用基于过氧化氢酶的气 体产生系统的另一个优点是只需要单一的其他试剂，例如过氧化氢。因此，为了产生气体， 只需要将过氧化氢与具有酶活性量的过氧化氢酶相接触。在第一试剂是氧化还原酶例如过氧化氢酶的情况下，第二试剂可以包含氧气的来 源。氧气来源的实例是过氧化物或过酸，例如过氧化氢、过氧化脲、碱金属过氧化物、过氧化 氢尿素、碱金属碳酸盐、碱金属过硼酸盐和碱金属过碳酸盐。氧的固体来源例如过氧化氢尿 素的优点在于，它可以干燥状态提供为分析装置的一部分。葡萄糖氧化酶(E.C. 1. 1.3.4)催化β _D_葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸_1，5-内酯， 同时形成过氧化氢。因此，该系统可用于在分析装置中原位产生过氧化氢，然后过氧化氢可 以被过氧化氢酶作用。因此，在本发明的分析装置的一个实施方案中，可以包含葡萄糖氧化 酶和过氧化氢酶二者。葡萄糖可以容易地提供为分析装置上的干燥的沉积物，其可以容易 被样品液体重新水化和溶解。少量氧气可以存在于分析装置中(溶解在样品液体中或存在 于前进的液体前面的流路中的空气中)，其应该足够与葡萄糖反应以形成过氧化氢，过氧化 氢进而被过氧化氢酶转变成氧气。其他可以使用的气体产生酶包括产生二氧化碳的酶例如脱氢酶和脱羧酶，例如丙 酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、氨基酸脱羧酶、草酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶和脲酶，后者能够 催化尿素水解成二氧化碳和氨。结合试剂可以是对目标分析物具有结合亲和性并形成结合对的试剂。结合对对于 本技术领域的专业人员来说是公知的，并包括抗体-抗原、配体/受体、互补的寡核苷酸或 多核苷酸、或其他彼此结合的分子对。结合试剂可以是针对目标分析物的抗体。结合试剂 可以是分析物或分析物类似物。方便的是，结合试剂是免疫球蛋白分子或这种分子的抗原结合部分，该术语打算 包含SCFV、Fab、Fab'、F(ab' )2、单结构域抗体、任何这些的多体等。将免疫球蛋白(或其 一部分)交联或连接到其他分子的方法是已经确立的。具体而言，对于本技术领域的专业 人员来说，将免疫球蛋白(或其一部分)连接到其他多肽例如酶上是公知的。在本发明的 某些实施方案中，分析装置/方法包含与酶、特别是催化气体形成反应的酶连接的免疫球 蛋白分子(或其抗原结合部分、或免疫球蛋白或其抗原结合部分的多体)。结合试剂可以连接到参与或催化气体形成反应的第一试剂上。理想地，结合配偶 体例如免疫球蛋白分子或其他结合配偶体(或其抗原结合部分)，被连接到酶、例如过氧化 氢酶上。或者，可以通过将第一试剂与结合配偶体结合，原位形成标记的结合试剂。液体(优选为样品液体)施加到液体施加区(例如样品施加区或端口)，导致液体 沿着分析装置中的流路流动(优选通过毛细作用)。夹带在流动液体内的(例如包含在施加到装置的液体内的，或已经存在于装置中并通过与液体接触而调动的)是第一试剂，其 在与第二试剂接触或混合时参与气体形成反应。分析装置可以包含非电子的、二元或数字分析结果产生和/或指示区，即它不需 要电源来产生和/或显示分析结果。优选分析装置不包含任何电子部件。二元或数字结果 是其中给出的结果是明确的结果。它可以是从两种可能结果例如“阳性”或“阴性”、“是”或 “否”、大于或小于阈值等中给出的单一答案。它可以是从两种以上可能结果中给出的单一 答案。可以相对于阈值提供结果。因此，对于高于特定阈值的分析物水平可以给出阳性结 果。二元或数字结果与例如从目测读取的横向流分析装置、例如ClearBlue 验孕装置目测 读取的结果不同，在后者中结果取决于测试线的颜色强度，因此需要由用户进行解释。二元或数字分析法公开在WO 2008/025945和WO 2006/090144中，在此引为参考。 二元分析进一步图示在图8中并在下面更详细描述。当被提供时，参比流路典型地不含任何气体产生试剂。分析装置可以包含测试流路和参比流路，它们在积累区下游的汇合区交汇。汇合 区也可以包含出口、管道、腔室或允许液体向前流动的其他部分。汇合区可以只允许测试流路中的液体或参比流路中的液体向前通过。汇合区可以 包含流体阀门或阻流器(choke)，使得沿着参比流路流动的液体在到达汇合区后，具有阻止 沿着测试流路的液体流动的效应，反之亦然。因此在汇合区下游检测到液体(detection of liquid or downstream of the junction zone)，指示了来自参比流路或测试流路的液体。测试或参比流路可以交汇在汇合区，汇合区允许包含在储液器内的液体向前流动 到两个指示区的一个中，所述两个指示区中的一个与参比流路可操作地相连，另一个与测 试流路可操作地相连。储液器液体将根据首先到达汇合处的是来自测试流路还是参比流路 的液体，流入这些指示区中的一个。当需要通过另一条流动通道阻止一个流动通道的流动或为储液器通道提供进一 步向前流动时，汇合区是有用的。但是，在某些情况下，测试通道中的流动可以在测试时间 内完全停止，或流动停止的程度可以使得测试通道中的液体不能到达汇合处，因此汇合区 可能不是必需的。但是，在许多实施方案中汇合区是优选的。在某些实施方案中，使分析装置偏置以避免来自参比和测试流路的液体同时到达 汇合区，可能是优选的。这可以通过为参比和测试流路提供不同的宽度、不同的长度等来实 现。可以使分析装置偏置，使得在测试流路中不存在气体的产生，来自测试流路的液体到达 汇合区早于来自参比流路的液体的到达，或反之亦然。装置可以适用于相对于阈值来提供 阳性或阴性结果。因此，对于夹心类型的分析来说，在存在低于某个阈值的分析物、因此存 在一些气体产生的情况下，来自测试流路的液体可以在来自参比流路的液体到达之前到达 汇合区，反之亦然。
一个或多个指示区可以提供在汇合区的上游或下游。根据实施方案，分析装置可以包含提供在汇合区下游的指示区，其能够指示来自 测试或参比流路的液体中哪一个先到达汇合区。有许多方式可以实现在该指示区中产生颜 色改变。例如，可以将有色染料提供在测试或参比流路中，或在相应的测试和参比流路中 可以提供不同颜色的染料，使得指示区中特定颜色染料的出现揭示了通过哪一条路径(测试或参比流路)的液体首先到达指示区。或者，指示区可以包含第一反应物，并且第二反应 物可以提供在一条流路中，使得第一和第二反应物反应以产生颜色改变。可以在测试和参 比流路中提供不同的反应物，它们能够与指示区中的反应物反应以提供不同的颜色改变， 使得所生成的颜色根据发生的液体向前流动是来自测试流路还是参比流路而不同。在另一 个实例中，可以在指示区中提供两种不同的酶(例如辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶)，用 于一种酶的相应底物可以提供在一条流路中，其在存在相关的酶催化剂的情况下反应，产 生了有色产物。产物的颜色揭示了哪种底物被导入指示区中(因此通过哪条流路的液体首 先到达那里)。一般而言，指示区(如果位于汇合区的下游)可以包含两种不同的信号产生 机构的组分，所述组分产生检测上不同的信号，其中每种信号产生机构的一种或多种其他 组分可调动地放置在上游，一种信号产生机构的其他组分放置在测试流路中，另一种信号 产生机构的其他组分位于参比流路中，所述其他组分需要与指示区中的另外组分接触以产 生信号。两种信号产生系统中的哪一种被激活，取决于哪种其他组分首先到达指示区，这进 而取决于沿着测试和参比流路的液体的相对流速。在实施方案中，指示区包含pH敏感性指示剂，测试和参比流路各自包含不同的PH 影响剂，例如一种包含相对酸性PH的缓冲液，另一种包含相对碱性pH的缓冲液。因此，液 体通过哪条流路首先到达指示区将决定指示区中的PH，并因此决定指示剂的颜色。提供在 指示区中的指示剂可以固定化的形式提供在例如通道的表面上或指示区中的多孔基质例 如纸之上或其中。这种通用类型的具有下游指示区的实施方案，其优点在于可能不需要大量改变液 体沿着测试流路的流动以使得沿着参比流路流动的液体首先达到指示区，或反之亦然，小 至1或2秒的时间差异可能就已足够。在其他实施方案中，在每个参比和测试流路中，在汇合区上游提供了指示区。在实 施方案中，液体沿着参比流路流动到特定点，起到在液体到达测试流路上的指示区之前阻 断沿着测试流路的液体流动的作用，使得特定分析结果显示在指示区中。在某些实施方案 中，在指示区上游提供指示物例如染料可能是有利的，以便如果/当液体到达测试和/或参 比流路的指示区时可以看见可见的改变。按照实施方案，分析装置包含提供在汇合区上游的测试和参比流路二者中的指示 区。在存在分析物的情况下，其对于夹心类型的分析来说将导致一个或多个气泡的产生， 沿着测试流路的流动减慢或停止，使来自参比流路的液体首先到达其指示区并指示分析物 的存在。在不存在分析物的情况下，可以将测试和参比流路配置成使得来自测试流路的液 体样品在来自参比流路的液体之前到达汇合区。一旦来自测试流路的液体到达汇合区，它 阻断了参比流路中的流动，使得参比路径中的液体至少在测试时间内决不能到达参比指示 区。在某些实施方案中，指示区包含微流体通道例如毛细管，其可以被用户看见(例 如通过原本不透明的外壳上的窗口或孔)。在一个实施方案中，指示区包含两个通道或毛细 管，一个形成了测试流路的一部分，另一个形成参比流路的一部分。在一个实施方案中，指 示区中的微流体通道或毛细管在执行分析的过程中被有色液体填充。液体的颜色本身可以 指示分析结果。或者，有色液体可以简单地起到改变通道或毛细管的可视性的作用。例如， 透明的塑料或玻璃毛细管针对透明或白色的背景可能不容易显现。在这样的通道或毛细管中导入有色液体将增加对比度并使通道或毛细管容易看到。或者，如果通道或毛细管最初 与其背景具有高对比度(例如白色毛细管对红色背景)，那么将与背景具有相同颜色的有 色液体导入通道或毛细管将减少对比度，并使毛细管或通道难以观察。这些都代表了传达 或显示与分析结果相关的可视信号的不同方法。在某些实施方案中，指示区可以包含一个或多个通道或毛细管，它们形成一个或 多个单词或符号(例如“妊娠(PREGNANT)”或加号或减号)。在一个具体实施方案中，其 中本发明的分析装置被提供作为验孕装置，一条流路包含其中通道或毛细管形成单词“不 (NOT)，，的指示区，另一条流路包含其中通道或毛细管形成单词“妊娠(PREGNANT)，，的指 示区。典型地，单词“不(NOT)”形成在测试流路中，单词“妊娠(PREGNANT)”形成在参比 流路中。如果不含任何hCG(即对象没有妊娠)的样品被施加到装置，液体沿着测试和参 比流路均自由流动。有色标记物例如染料沿着两条流路运输，使单词“不(NOT)”和“妊 娠(PREGNANT)”作为讯息出现在显示器上。如果将含有hCG的样品施加到装置，存在于测 试流路中的凝集试剂(凝集？不是气体？)(例如用抗hCG抗体包被的乳胶粒子)使流 速大大降低，使得参比流路中的液体在测试流路中的液体能够到达指示区之前到达汇合 处。这有效阻断了测试流路，因此单词“不(NOT)”不变得可见，改为显示器给出讯息“妊娠 (PREGNANT)”。分析装置中的流路可以是基本上线性的。或者，为了提供紧凑构造，流路可以作为 蜿蜒或其他回旋的路径。流路可以包含气泡持留机构，例如颈或一个或多个变窄的部分，其 便于截留气泡并从而辅助在流路中形成阻断，以减小或停止流动。流路可以包含气泡截留 或持留机构。例如，流路可以包含在其底部具有两个或多个交叠的指状物或突起的通道。这 样的实施方案可以由“锯齿状”部分方便地形成，在所述部分中多个互相交叉的指状物从通 道的相对侧面伸出到流路中，这种布置已被显示能够高度有效地截留气泡。流路可以包含 一个或多个突起或元件，用于加强气泡的形成。例如，突起可以是锯齿状的元件。流路可以 包含化学或物理的成核位点(nucleation site)，用于加强气泡的产生。用于加强由气泡引 起的流动减缓或停止的其他方式，是提供一个或多个使流路在其宽度或高度上狭窄的限流 元件、疏水区域、以及用于增加流动通道表面积的蚀刻过的表面。例如，表面可以蚀刻成网 格图案或包含系列的平行蚀刻线。多孔结构可用于减慢流动。例如，流路可以包含微流体通道和含有多孔材料例如 玻璃纤维或其它多孔惰性材料的腔室。在产生气泡的区域中，流路可以有利地与直接环境基本密封，以防止气泡从流体 样品逸出到周围环境中。因此，气泡可以在至少测试期间持留在装置内，使得它们能够改变 液体或其部分的流速。流路(或其一个或多个区段)可以是例如由基本上不透气的材料构 成的壁所包围的微流体通道。典型情况下，除了液体样品施加区和装置内可能存在的任何 排气口之外，装置与直接环境完全密封。分析装置可以包含其他试剂例如糖和/或蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)，其用于 稳定分析装置中存在的一种或多种试剂或影响它们的重悬浮或溶解作用。另一方面，本发明提供了执行分析的方法，所述方法包括将液体样品施加到根据 本发明的方面的分析装置中的步骤。另一方面，本发明提供了制造分析装置的方法，所述方法包括在分析装置中或其上沉积至少一种试剂的步骤，所述试剂在分析执行过程中参与或催化了气体产生反应。根据一个实施方案，分析装置可以包含提供在积累区紧上游和/或紧下游的固定 化的抑制剂，用于抑制任何未结合的第一试剂与第二试剂之间的反应。这样，只有因为第二 试剂与积累区处的第一试剂反应，才会产生气体。适合的抑制剂是叠氮化物，其抑制过氧化氢酶与过氧化物之间反应形成氧气。例 如，在夹心分析法中，当使用不存在分析物的液体样品时，许多标记的试剂没有结合在积累 区处，因此行进到积累区的下游。迎来的底物(在过氧化氢酶的情况下是过氧化物)与积 累区下游存在的标记的试剂反应并产生气泡。以这种方式形成的气泡是起反作用的，因为 它们在样品内不存在分析物时降低或停止测试通道中的流动。在积累区的下游包含酶的抑 制剂减少了积累区下游气泡的形成。通过将积累位点的下游通道中的PH改变到非常酸或 碱性，使得酶活性被废止或显著降低，可以实现同样的效果。分析装置还可以包含对照分析，其能够指示分析已经正确地执行。对照分析可用 于确定例如分析装置本身是否正确发挥作用或用户是否以正确方式使用装置。许多因素单 独或组合地可能造成装置给出错误结果。例如，一条或多条流路中可能存在缺陷例如阻塞， 测试装置中提供的一种或多种试剂的变质或缺失，等等。因此，对照分析的目的是指示测试 结果有效。对照分析可以与测试和参比流路类似，可以包含例如对照测试流路和/或对照参 比流路，其中可以将对照参比流路中的流动与对照测试流路中的流动相比较。对照测试流 路可以包含例如一种或多种试剂，其不取决于流体样品中存在的分析物的量产生预定量的 气体以提供一个或多个气泡。一种或多种气体产生试剂可以与测试流路中使用的相同。对 照参比流路典型地将不包含任何气体产生试剂。测试对照和参比流路可以在下游汇合区处 交汇。对照分析可以包含提供在汇合区上游或下游的一个或多个指示区。在实施方案中，指示区分别提供在汇合区上游的对照测试和对照参比流路中。在 使用中，对照测试流路中的流动将减慢或停止，允许对照参比通道中的流动首先到达汇合 处，从而阻止了对照测试通道中的流动。由此，对照参比通道中的指示剂将指示用户测试正 确发挥作用。相反，如果由于装置故障并且没有在对照测试通道中产生气泡而使对照测试 通道中的流动没有减慢或停止，则对照参比通道中的流动首先到达汇合处，因此借助汇合 处上游对照参比通道中存在的指示剂指示装置故障。共用的样品施加区可以将测试和参比 流路相连，以及如果存在对照测试和对照参比流路的话，将它们相连。分析装置可以包含流体样品储液器，可以向其中施加样品。因此施加到装置的液 体样品可以连续供应到一条或多条流路。为了避免疑问，在这里明确陈述，在本文中描述为“典型”、“优选”、“方便”、“理想”、 “有利”等的本发明的任何特点，可以单独地或与任何一个或多个如此描述的其他特点组合 出现在本发明中，除非上下文有其它表示。同样地，除非上下文明确有其它表示，否则相对 于本发明的一方面描述的特点，一般将适用于本发明的其他方面。现在，将利用说明性的实施例并参考附图对本发明进行进一步描述，在这些图 中
图1示意显示了通过将过氧化物与固定的过氧化氢酶的接触产生气泡；图2显示了按照下面的实施例1制备的分析装置的流速对分析物浓度的图3显示按照下面实施例2制备的装置；图4显示了按照实施例3制备的都具有蜿蜒路径的参比和测试通道；图5示意显示了按照实施例3制备的分析装置的一部分；图6显示了按照实施例3制备的分析装置的流速对分析物浓度的图；图7显示了按照本发明的实施方案的另一种分析装置；图8-11是本发明的其他可能实施方案的示意图；图12是平均停止距离(“环数”)对结合物相对量的图；图13显示了本发明的实施方案的另一种装置；图14和15分别显示了按照本发明的实施方案的装置的亚层和完整装置。图16显示了施加到如图15所示和实施例6所述的装置的含有各种浓度hCG的缓 冲样品的平均停止时间的图。下面更详细地描述附图。图1显示了在用于检测hCG的过程中装置的一部分。hCG-结合试剂复合物标记的 过氧化氢酶在与过氧化氢试剂接触之前被固定在积累区处。在与过氧化氢接触后，过氧化 氢酶催化氧气的形成。图2显示了按照实施例1制备的各种分析装置的流速对分析物浓度的图。当液体 样品中hCG的量改变时，观察到了沿着分析装置的液体样品流速的显著改变。图3显示了按照实施例2制备的装置，包含微流体测试通道㈧和参比通道⑶。 对于每个分析来说，装置包含施加端口(32)、通道(31)和接收槽(3 。沿着测试分析通道 的长度提供有过氧化氢酶标记的结合试剂。将过氧化氢水溶液和可视染料添加到装置，然 后过氧化氢与测试通道中的标记的结合试剂反应，产生了气泡。这导致液体样品沿着流路 流动的降低。参比通道不包含任何标记的过氧化氢酶，没有观察到液体样品沿着参比通道 流动的降低。因此，染料几乎完全填充参比通道中的接收槽33，同时染料仅仅填充测试通道 中的接收槽的一小部分。图5显示了根据实施方案的分析装置的一部分，包含气泡截留突起。图7显示了根据本发明的分析装置的实施方案，包含微流体门X(迭边进模口 (kiss gate))，其能够使来自通道A和B的两个流体流合为一体而不引入气锁。图8-10是本发明的分析装置的各种实施方案的示意图。在图8中，描绘了能够产 生数字或二元分析结果(“是”或“否”答案)的分析装置，其不使用任何电子元件并且没 有电或其他动力供应。装置包含具有确定体积的腔室或储液器20。腔室20具有入口 22， 可以通过它导入待分析的液体测试样品。两条测试流路2 和24b在与入口 22等距离的 点处从腔室20分支出去，使得导入到腔室20中的液体将随后同时地开始进入两条测试流 路 24a,bo在装置中提供了两条指示液体流路一条从腔室20通向下游指示区^a ；—条从 腔室20通向指示区^b。但是，相应的障碍^a、b阻止了腔室20中的液体通过毛细作用 前进进入任一下游指示区^a、b中。在该实例中，障碍由相应测试流路Ma、b的孔形成的 断点产生，其与相应的指示液体流路形成T型汇合。在该说明性实例中，同样的液体样品既用作测试液体(沿着测试毛细管Ma、b流 动)，也用作指示液体(从腔室20最终流动到指示区26a或26b之一)。液体样品可以是例如血液、尿液或其他体液。在测试流路Ma、b之一内可以沉积有气体产生试剂，其在例如 目标分析物存在下产生气体。气体形成气泡，阻断了液体沿着流路的进一步前进。这在图 8中通过流路24b是蜿蜒曲折的来呈现。保留在腔室20中的样品液体起到指示液体的作用。它基本上填充了腔室，但是不 能前进通过由测试流路Ma、b的孔构成的毛细管断点所提供的障碍观3、13。正如上面解释 的，因为在流路24b中形成的气泡，测试液体在其到达测试流路24b的末端之前到达测试流 路Ma的末端。测试液体到达流路Ma的末端废止了断点，从而有效移除了障碍^a，允许 指示液体从腔室前进到下游指示区26a中(它与指示区26b分开并且无联系)。指示流体 进入指示区导致了视觉信号的形成或出现。这可以通过许多方式实现，典型地通过颜 色改变。指示区^a的体积足以基本上容纳所有来自腔室20的液体。当液体开始移动到指示区^a中时，腔室20中的液体被抽离与障碍^b的接触， 有效地增加了断点的尺寸。因此，如果/当测试液体最终到达测试流路24b的末端时，它将没有作用，腔室20 中的指示液体将仍然不能进入下游指示区26b。图9和10示意说明了这种概念的变体，其再一次提供了“赛跑”分析，以给出数字或二元分析结果读数。显示在图9中的装置具有样品施加区2，其与测试流路4和参比流路6流体连通， 这两者都包含毛细通道。过滤器8可以任选提供在一条或这两条流路中。流路在汇合区10 下游交汇，产生共同通道12。指示区14可以提供在汇合区10的下游。通过样品施加区2中的样品施加端口施加到装置的液体样品，能够分别沿着测试 和参比流路4、6流动并流向汇合区10。在共同通道12和指示区14中提供了一个或多个排 气口，允许空气被液体沿着毛细管的前进排出装置。但是，一旦一种流体的前沿到达汇合区 10，它从排气口阻断了另一条流路，阻止了沿着另一条流路的液体的进一步前进。因此，装 置只允许流体前沿首先到达汇合区10的流体沿着流路流动到达指示区14中。指示区可以 提供在流体通道中，使观察者能够确定哪个相应通道中的流体首先到达。例如，可以在每个 通道中提供不同颜色的染料，使得流体样品能够与染料相互作用以产生具有特定颜色的液 体。因此，指示区中特定颜色染料的出现，将使用户能够确定哪种流体首先到达流体门。可以通过以分析物特异性的方式在一条流路中导致气泡形成，例如通过提供固定 在流路中、对目标分析物的存在做出响应而产生气体的气体产生机构，来影响液体沿着流 路4、6前进的相对速率。图10中示出了另一个实施方案。与以前的实施方案相同，分析装置在共同样品施加区2中包含样品施加端口，液 体样品可以从其流入形成了测试流路4的一部分的毛细管和形成了参比流路6的一部分的 分开的毛细管。每个流路可选择地提供有唯一的、单独的样品施加区。本技术领域的专业 人员将会认识到，在提出的实例中描述的分析装置可以提供其他测试流路，以测试其他目 标分析物的存在。如果需要，所述或每个其他测试流路可以提供有相应的参比流路。在图2中描述的实施方案中，每个流路在汇合区10的上游包含过滤元件8和指示 区14。
过滤元件8包含一种或多种气体产生试剂。在存在目标分析物(在这种情况下是 hCG)的情况下，试剂产生气体，所述气体形成气泡，阻断了流路4。每条流路还提供了有色染料，其通过与液体样品的接触所调动并随着液体样品迁 移。每条流路的指示区14包含毛细管通道，其在测试流路4中形成单词“不(NOT)”， 在参比流路中形成单词“妊娠(PREGNANT)”。这些毛细管由透明的合成塑料材料形成，并映 衬着低对比度的背景(例如白色或透明的合成塑料材料)。因此，在执行分析之前，毛细管 不是非常显眼的。但是，一旦分析开始，位于指示区上游的流路中的染料被前进的液体样品调动。如 果样品不包含hCG，液体沿着这两条流路自由流动。进而，含有染料的液体填充这两个毛细 管，显示了分析结果“未妊娠(NOT PREGNANT”)。可以在沿着参比流路的几个点处提供排气 口，以鼓励液体沿着其流动。具体来说，可以提供这些排气口以帮助液体填充参比流路的指 示区。优选在测试流路中不存在这样的排气口，来自测试流路毛细管4的空气只能经过汇 合区10下游共用通道12中的一个或多个排气口排出，使得如果沿着参比流路6流动的液 体在沿着测试流路4流动的液体前沿之前到达汇合区10的话，则空气将不再能够从测试流 路毛细管中排出，液体沿着通道的进一步前进被阻止。调整液体沿着测试和参比流路的流速和/或相应流路的长度，使得在不存在hCG 的情况下，液体沿着两条流路4、6流动并填充相应的指示区。典型地，在样品中不存在hCG 的情况下，沿着参比流路流动的液体将与沿着测试流路流动的液体同时到达汇合区10，或 仅仅领先后者1或2秒。然而，如果所施加的样品包含hCG，在测试流路4中将发生气体产生和气泡形成， 这显著迟滞了液体沿着测试流路毛细管朝向指示区的前进。这允许沿着参比流路流动的液 体“赢得赛跑”，容易地到达汇合区。沿着参比流路流动的液体在沿着测试流路4流动的液 体到达指示区之前到达汇合区10。在这种情况下，单词“不(NOT)”不会变得被染料填充并 保持不明显，同时单词“妊娠(PREGNANT) ”变得高度可见，因此显示了分析结果。图13显示了装置1，其包含参比流路4和测试流路5，带有分别与参比和测试流路 相连的样品施加区2和3。还显示了气泡截留区6以及测试和参比指示区8和7。汇合区 标作10，积累区显示为9。使用图13的装置进行的分析描述在实施例5中。如图中所示的 参比通道基本上大部分线性的，在其远端具有蜿蜒的形状，然而测试通道的形状大部分是 蜿蜒的。在这种情况下这两种通道都使用了回旋的形状，以便使装置更加紧凑。图14和15分别显示了装置的亚层A、B和C以及完整的装置30。装置30包含两 个同样形状和尺度的测试通道32，各自包含蚀刻的气泡阱31和样品施加区34。实施例1 包含硝酸纤维素多孔载体的用于hCG的限流免疫分析法分析装置如下制备试剂的制备将抗α -hCG抗体和过氧化氢酶共固定化在蓝色聚苯乙烯乳胶粒子上。材料#Duke kientific的蓝色聚苯乙烯乳胶粒子，直径400nm，10%固形物(w/v)，批 号 CB 1860
· BDH Analar 的 95% 乙醇加上 0. 5% 乙酸钠(Sigma)· htergen的牛血清白蛋白(BSA)Cohn 5YT 19202，在去离子水中制备成200mg/ ml 抗 α-hCG 抗体，内部克隆 3299，批号 PL 1257，在 PBSA 中 3. %ig/ml· Sigma的来自人类红细胞的过氧化氢酶，SDS-PAGE C3556纯度90 %，批号 116K1463, 52200 单位/mg 蛋白，提供在 pH 8. 0 的 50mM Tris 中· IOmM 硼酸缓冲液，pH 8. 5Tffe1.将乳胶粒子在IOmM硼酸缓冲液中稀释到0.5%固形物(w/v)(在1. 7ml Eppendorf管中制备Iml稀释的乳胶)。2.将 Eppendorf 管在 Heraeus Biofuge 17RS 离心机上在 15 °C 下以 17，500rpm(25, 848rcf)离心 5 分钟。3.除去上清液并将沉淀重新悬浮在Iml IOmM硼酸缓冲液中。4.将IOOyg过氧化氢酶放置在新的1.7ml Eppendorf管中，并加入100 μ g抗hCG 抗体。5.将来自步骤3的清洗过的乳胶加入到步骤4的Eppendorf管中，通过微量移液 器反复吹吸(吹吸 6个循环)混勻。6.立即加入200 μ 1乙醇-乙酸酯，并在混合器上充分混合 5秒。7.将Eppendorf管在直立圆筒混合器上( 60rpm)，在环境温度下放置60分钟。8.加入50 μ 1 200mg/ml BSA,并在直立圆筒混合器上( 60rpm)继续混合30分钟。9.重复步骤2，除去并丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在Iml IOmM硼酸缓冲液中。 加入 50 μ 1 200mg/ml BSA 并混勻。10.重复步骤2，除去并丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在Iml IOmM硼酸缓冲液中。 加入 50 μ 1 200mg/ml BSA 并混勻。11.重复步骤2，除去并丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在Iml IOmM硼酸缓冲液中。 加入50 μ 1 200mg/ml BSA,混勻并在4°C储存过夜。12.重复步骤2，除去并丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在Iml IOmM硼酸缓冲液中。 加入 50 μ 1 200mg/ml BSA 并混勻。带有抗β -hCG mm^im^mmmmmm^材料Mylar载体上的8 μ m硝酸纤维素膜抗β-hCG单克隆抗体，内部克隆3468，3mg/mlSigma的(w/v)聚乙烯醇(PVA)，10, OOOmwt，加上在去离子水中的3% (w/v) 蔗糖(Sigma S8501)(阻断缓冲液)1.使用计量泵和注射器将:3mg/ml的抗β _hCG抗体沉积在硝酸纤维素膜上，产 生 Imm宽和 300mm长的区带(以 0. 1 μ 1/mm沉积)。2.将硝酸纤维素膜在50°C下在温热空气中干燥 10分钟。向膜的一端施加阻断缓冲液，并使它平行于测试线的长度运行以润湿膜，直到它使膜饱和。3.将硝酸纤维素膜在75°C下在温热空气中干燥 10分钟。4.将膜切成 6mm宽和40mm长的条，使得抗β -hCG抗体的测试区带横过其宽度 (6mm)并使测试线距离条的底部 10mm。执行hCG的流动限制免疫分析的方案1.将硝酸纤维素膜条排列在垂直支持物上，使测试条的近端接触试验台的底部 (测试线位于离底部 10mm)。将作为吸收槽的凝胶印迹纸(gel blotting paper)施加到 测试条的远端。2.制备10 μ 1包被在抗α -hCG抗体中的乳胶加上50 μ 1含有OmIU/mlhCG的缓冲 的标准品(PBSA)的混合物。将该混合物施加到测试条的底部，并允许它层析通过，直到底 部变干。向条的底部施加50 μ 1硼酸缓冲液并允许它层析通过，直到底部变干。
3.将测试条在环境温度下干燥 3小时。4.将粘合性层压薄膜(ARCare 7759co#D9012)施加到硝酸纤维素膜表面，从膜的 近端朝向远端前进 2mm，使得它覆盖条的整个宽度。5.将测试条夹在两个显微镜载玻片之间，并用鳄鱼夹将它们夹持在一起。使测试 条垂直站立，其近端与试验台接触。6.向测试条的底部施加 50 μ 1 5% H2O2 (ν/ν)(从 Sigma H-1009 批号 021K3250 的 30% H2O2储用液用去离子水稀释并加入5mg/ml BSA)并使其层析。观察溶剂前沿的移动， 并记录溶剂前沿从施加H2A的位点行进32mm距离所花费的时间。7.重复上述步骤，产生使用OmIU/ml hCG运行的测试条的另外3个复制样。8.重复上述步骤，产生使用10、25和50mIU/ml hCG缓冲标准品运行的4个测试^^ ο将样品中存在的hCG分析物的量对液体样品溶剂前沿沿着多孔基质行进所花费 的时间进行作图。该图显示在图1中。从图1中可以看出，液体样品中hCG分析物的存在导致了液 体样品流速的降低。实施例2 以分析物依赖性方式使用氧气泡阻止流动的毛细管分析方法毛细管的构建底部聚苯乙烯显微镜载片中间 10 μ m 的双面白色 PSA 胶带(Adhesive Research ARCare7840)顶部175 μ m聚酯薄膜(抗静电处理过)沿着显微镜载片的长度方向在白色PSA胶带中做出2xlmm毛细管(参见下文)容积收集腔室底部和顶部175 μ m聚酯薄膜(抗静电处理过)中间 10 μ m 的双面白色 PSA 胶带(Adhesive Research ARCare7840)6mm腔室在每端逐渐变细到1mm，可以在方案的最后一步中被粘在毛细管载片上 (参见下文)分析形式两种通道的通用方案
1.将批号PL1322的15 μ 1 3468以2. 03mg/ml沿着通道的长度施加，并放置10分钟。2.施加20 μ 1在PBS中的5mg/ml β -酪蛋白。放置10分钟。3.进一步施加5mg/ml的β -酪蛋白，10x5 μ 1/通道。4.上样5x5 μ 1制备在5mg/ml β -酪蛋白中的涨mIU/ml hCG标准品或0标准 品。放置5分钟。5.与 3 相同。6.上样5x5 μ 1的0. 05% (BRIO 1007) 3299-过氧化氢酶乳胶粒子(400nm)。放置 20分钟。7.用20x5 μ 1 PBS洗涤，然后2x5 μ 1红色染料/通道。8.连上收集腔室并开始视频。9.加入5μ 1含过氧化氢与1/6蓝色染料的PBS。放置10分钟，然后接着加入 许多批5μ1的过氧化氢。实施例3 以分析物依赖性方式使用氧气泡阻止流动的毛细管分析方法构建了微流体类型的毛细管分析法，其中第一结合试剂-分析物-标记的结合试 剂复合物通过磁体固定或捕集在反应区中。根据本实施例，第一结合试剂用磁性粒子标记。毛细管构建底部和顶部175 μ m聚酯薄膜(抗静电处理过)HiFi PMX 715中间 10 μ m 的双面白色 PSA 胶带(Adhesive Research ARCare7840)沿着装置的长度以蛇形图案在白色PSA胶带中制造hlmm毛细管。在样品施加端 切出大的圆圈，在图案前的直通道中是一系列“鲨鱼”齿。在装置下面齿的紧前方以聚焦磁 场的方式排列有U型钉(staple)和磁体，以允许截留1 μ m的磁性珠。方案1.准备测试和对照样品试剂hCG标准品，不含叠氮化物。在lmg/ml BSA+0. 05% ProClin3003468磁性珠 (Dynabeads-MyOne甲苯磺酰基活化过的)中3四9_过氧化氢酶结合物(戊二醛DT Cl 29/11/07)对照5 μ 1磁性珠，5 μ 1 Cl结合物和10 μ 1 OhCG测试5μ 1 磁性珠，5 μ 1 Cl 结合物禾口 10 μ 1 500mIU/mlhCG2.力口入2 μ 1染料溶液(1/4蓝色食品染料)3.向T或C通道加入2μ 1粒子/结合物/hCG混合物4.向每个通道加入60 μ 1 过氧化氢5.沿着毛细管监测染料前沿(视频)制备了许多这样的装置，并使用许多包含各种hCG分析物浓度的液体样品进行测 试，测量了液体流体前沿沿着通道流动的距离(停止距离)，单位为mm。停止距离对hCG浓 度的图显示在图6中。图7中显示的分析装置可用于允许储液器A中的第一流体和储液器B中的第二流 体沿着它们相应的通道流动，并在汇合处或门(X)处相遇。此外，结构使得来自第一储液器 (A)的液体沿着流路流动，在来自第二储液器(B)的液体到达固定区之前达到固定区(Y)。储液器B (或其下游的流路)可以包含第二试剂，储液器A(或其下游的流路)可以包含标 记的第一试剂。还提供了参比通道C。图7示意显示了用于构造微流体门(迭边进�？�)的三个层，所述门能够使两个 流体流合在一起而不引入气锁。底层和顶层(7说73) 175 μ m聚酯薄膜(抗静电处理过)HiFi PMX715中间层(72) IOOym 的双面白色 PSA 胶带(Adhesive Research ARCare 7840)底层(71)在聚酯薄膜的亲水侧上，在两个流体流相遇的位置处具有刻在其中的 沟槽。中间层被用于构造宽度 Imm的通道，包括具有两种进料的测试通道A和B，以 及参比通道C。顶层(7 疏水表面朝下黏附在PSA中间层上，具有在其中切出的口，以允许 样品被同时施加到流体通道A、B和C。顶层73也在通道A的末端具有用作排气口的孔。将免疫分析试剂干燥在储液器A中，并将过氧化氢产生试剂(例如过氧化氢脲) 干燥在储液器B中。当样品被同时施加到所有三个储液器时，在三个流路中发生了流动。免疫分析试剂(在例如用于hCG的分析中是例如抗体包被的磁珠和过氧化氢 酶-抗体结合物)被样品重新水化并通过通道A前行。在到达与通道B的交汇处时，亲水 性底层中的刻线阻止了液体越过进入通道B，所以流动继续前行到达通道末端。在存在分析 物的情况下，形成的免疫复合物被捕集在迭边进�？谙掠蔚耐ǖ赖木獬葑床糠�(测试或截 留区Y)处。过氧化氢产生试剂在腔室B中重新水化并通过较长的通道B前行到达与通道A的 交汇处(迭边进�？�)。当通道B中的流体到达迭边进�？谑保ǖ繟中流体的存在允许现 在产生的过氧化氢越过进入通道A。投送到储液器A和B的样品体积使得当通道B中的流 体到达迭边进模口时储液器A已变得耗�。馐沟昧鞫�100%的A流动转换到100%的B 流动。当过氧化氢经过Y处的免疫复合物时，产生氧气形成气泡，减慢或阻止了流动。可以在储液器中引入能够帮助试剂的均勻干燥和重新水化后缓慢释放的结构。这 些结构的形状、高度、表面性质和密度影响了干燥和重新水化过程。在储液器中紧靠进入通 道的入口前方添加导柱(整个高度，100 μ m PSA胶带的直径 Imm的圆圈)，可用于使重新 水化的复合物像经过漏斗一样下到通道的中心，而不是下到侧面上，在侧面上流动将会受 到通道壁的影响。这允许来自储液器的试剂更完全和更快速地排空。实施例4干燥的结合试剂这包含直径1微米的带有吸附的抗β-hCG抗体(克隆3468)的磁性乳胶_3468磁 性珠、由人类红细胞过氧化氢酶连接抗α-hCG抗体(克隆3299)而制造的结合物，此外还 包含BSA、蔗糖、pH 7. 4的含有0. 05% ProClin 300的磷酸缓冲盐水，按照表1进行混合。
权利要求
1.一种用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的方法，所述方法包括下列步骤将怀疑含有分析物的液体样品与气体产生机构相接触，所述气体产生机构取决于分析 物的存在、不存在或量形成气体，所述气体在液体样品中产生一个或多个气泡，所述气泡起 到改变液体沿着流路的流动的作用；以及确定液体中流动的改变，其中液体沿着流路的流 动改变指示液体样品中分析物的存在和/或量。
2.权利要求1的方法，其中气体产生机构包含第一和第二试剂。
3.权利要求2的方法，其中试剂之一用针对分析物或针对分析物结合试剂的结合试剂 进行标记。
4.一种用于确定液体样品中分析物的存在和/或量的方法，所述方法包括下列步骤a)将怀疑含有分析物的液体样品与用第一试剂标记的结合试剂相接触，其中结合试剂 能够与分析物结合或与分析物结合试剂结合；b)在积累区处引起标记的结合试剂的积累，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于 液体样品中分析物的存在、不存在或量；以及c)将积累区处的标记的结合试剂与第二试剂相接触，使得第一和第二试剂反应形成气 体，所述气体在液体样品中产生一个或多个气泡，这起到改变液体沿着流路的流动的作用， 其中液体沿着所述流路的流动改变指示液体样品中分析物的存在和/或量。
5.前述权利要求任一项的方法，其中液体流动改变通过检测在积累区下游的指示区处 液体的存在或到达来确定。
6.前述权利要求任一项的方法，其中液体的流动被减少或停止。
7.权利要求2-6任一项的方法，其中第一试剂是催化剂。
8.权利要求7的方法，其中催化剂是酶。
9.权利要求8的方法，其中酶是过氧化氢酶。
10.权利要求8或9的方法，其中第二试剂是过酸或过氧化合物。
11.前述权利要求任一项的方法，其中气体是氧气。
12.前述权利要求任一项的方法，其中液体样品包括生物样品。
13.权利要求12的方法，其中生物样品包括尿液。
14.前述权利要求任一项的方法，其中分析物选自半抗原、hCG或LH中的任一种。
15.前述权利要求任一项的方法，其中将流动与液体在参比流路中的流动进行比较。
16.用于执行前述权利要求任一项的方法的分析装置。
17.一种用于确定施加或以其它方式导入到装置的液体样品中目标分析物的存在和/ 或量的分析装置，所述装置包含至少一条分析流路，液体沿着其流动；气体产生机构，其取决于分析物的存在、不存在或量而产生气体，所述气体在液体样品 中产生一个或多个气泡，这起到改变液体沿着流路向下游区域流动的作用；以及用于检测液体流动的任何改变的检测机构，和/或用于检测下游区域处液体的存在或 到达的指示机构；其中液体沿着流路的流动改变指示分析物的存在和/或量。
18.权利要求17的分析装置，其中气体产生机构包含第一和第二试剂。
19.权利要求18的分析装置，其中试剂之一用针对分析物或针对分析物结合试剂的结合试剂进行标记。
20.权利要求17-19任一项的分析装置，其中气体产生机构产生氧气。
21.权利要求17-20任一项的分析装置，其还包含用于检测液体流动的任何改变的检 测机构和/或提供在积累区下游用于检测液体的存在或到达的指示区。
22.一种用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的分析装置，所述装置包含a)样品施加区，用于向装置施加液体样品；b)至少一条分析流路，液体沿着其流动；c)用第一试剂标记的并且提供在所述流路内提供的积累区上游的结合试剂，所述结合 试剂能够与分析物结合或与分析物结合试剂结合；d)能够固定标记的结合试剂的积累区，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于液体 样品中分析物的存在、不存在或量；所述装置使得在使用中，在任何固定在积累区处的标记 的结合试剂与第二试剂之间发生反应而产生气体，所述气体在液体样品中形成一个或多个 气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路流动的作用，其中液体流动的改变指示液体样品中 分析物的存在或量；以及e)用于检测液体流动的任何改变的检测机构，和/或提供在积累区下游用于检测液体 的存在或到达的指示机构。
23.权利要求22的分析装置，其中第二试剂提供在积累区上游，使得在使用中，所有或 基本上所有标记的结合试剂在第二试剂到达积累区之前被运输到所述积累区。
24.一种用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的分析装置，所述装置包含a)样品施加区，用于向装置施加液体样品；b)至少一条分析流路，液体沿着其流动；c)用第一试剂标记的并且提供在所述流路内提供的积累区上游的结合试剂，所述结合 试剂能够与分析物结合或与分析物结合试剂结合；d)提供在所述积累区上游的第二试剂；以及e)能够固定标记的结合试剂的积累区，其中标记的试剂在积累区处的积累取决于液体 样品中分析物的存在、不存在或量；所述装置使得在使用中，所有或基本上所有标记的结合 试剂在第二试剂到达积累区之前被运输到所述积累区，在第二试剂到达积累区处后，在在 积累区处任何固定的标记的结合试剂与第二试剂之间发生反应而产生气体，所述气体在液 体中形成一个或多个气泡，所述气泡形成或以其它方式被导致存在于流路中的液体中，所 述气泡起到改变液体沿着流路流动的作用，其中液体流动的改变指示液体样品中分析物的 存在或量。
25.权利要求22-M任一项的分析装置，其中第一试剂提供在第一条流路中和第二试 剂提供在第二条流路中，并且其中第一和第二条流路在积累区的区域中或积累区的上游交汇。
26.权利要求25任一项的分析装置，其包含提供在这两条流路上游的共同的样品施加区。
27.权利要求2216任一项的分析装置，其中第一试剂是酶。
28.权利要求27的分析装置，其中酶是过氧化氢酶。
29.权利要求M-观任一项的分析装置，其还包含用于检测液体流动的任何改变的检测机构和/或提供在积累区下游用于检测液体的存在或到达的指示区。
30.权利要求22- 任一项的分析装置，其中第二试剂选自过酸或过氧化合物。
31.权利要求22-30任一项的分析装置，其还包含参比流路。
32.权利要求31的分析装置，其中参比流路与分析流路在积累区下游的汇合区处交汇。
33.权利要求32的分析装置，其中指示区提供在汇合区下游。
34.权利要求32的分析装置，其中指示区在每个参比和分析流路中分别提供在汇合区 上游。
35.权利要求22-34任一项的分析装置，其还包含对照分析。
36.权利要求35的分析装置，其中对照分析包含对照分析流路和/或对照参比流路。
37.权利要求36的分析装置，其中对照测试流路与对照参比流路在下游汇合区处交汇。
38.权利要求17-37任一项的分析装置，其包含非电子的二元或数字分析结果指示机构。
39.权利要求17-38任一项的分析装置，其中所述装置不包含任何需要电源的元件和/ 或电源。
全文摘要
本发明公开了一种用于确定液体样品中目标分析物的存在和/或量的方法，所述方法包括下列步骤将怀疑含有分析物的液体样品与气体产生机构(例如过氧化氢酶和过酸或过氧化合物)相接触，所述气体产生机构取决于分析物的存在、不存在或量形成气体，所述气体在液体样品中产生一个或多个气泡，所述气泡起到改变液体沿着流路的流动的作用；以及确定液体中流动的改变，其中液体沿着流路的流动的改变指示了液体样品中分析物的存在和/或量。
文档编号G01N33/58GK102057274SQ200980122030
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月12日
发明者巴比尔·拉伊, 戴维·托利 申请人:Spd瑞士精确诊断有限公司, 阿莱瑞士股份有限公司
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