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专利名称：吴茱萸及其提取物的高压液相指纹图谱的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种贵州余庆GAP吴茱萸药材及其提取物HPLC (高效液相色谱)指纹 图谱的建立方法，以及由此所得的吴茱萸药材及其提取物HPLC标准指纹图谱，属于药物分 析技术领域。
背景技术：
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss. ) Benth.、石虎 Evodiarutaecarpa (Juss. )Benth. var. off icinalis (Dode) Huang 5 ^ ^ ^ Evodiarutaecarpa(Juss. )Benth. var. bodinieri (Dode)Huang 白勺〒!^1 ]^ 女台 于《神农本草经》，主产于贵州、湖南、重庆、江西、浙江等地。吴茱萸为贵州省著名道地药材 和常用苗药，占全国总产量的30%以上，贵州余庆按GAP规范化要求，进行了大规模人工种 植，并获成功。传统的药材及其提取物评价指标具有很大的局限性。《中国药典》(2010年版一部) 吴茱萸项下仅以吴茱萸药材中总碱和柠檬苦素含量控制吴茱萸的质量，未能较全面地反映 吴茱萸及其提取物中其他成分的情况，中药指纹图谱为这一问题提供了解决方案。目前，已有吴茱萸脂溶性、水溶性指纹图谱技术(公开号CN1932506A， CN1932507A)研究，但该指纹图谱技术仅分别作了脂溶性、水溶性部分研究，且特征峰数量 较少，在已知技术中尚无全面反映贵州余庆GAP基地吴茱萸全成分及吴茱萸提取物指纹图 谱的研究技术。针对目前吴茱萸指纹图谱技术所存在的不足，本发明以HPLC梯度洗脱法对 吴茱萸药材及其提取物指纹图谱进行研究，首次选用吴茱萸较常见的两种伪品(花椒、马 桑子)完成了指纹图谱适用性检验，所建立的指纹图谱整合了吴茱萸水溶性成分和脂溶性 成分，能较全面地体现吴茱萸药材及其提取物的整体化学信息；建立的吴茱萸药材及其提 取物HPLC指纹图谱共有峰的分离度和峰形更好；此外该指纹图谱囊括了吴茱萸药材及其 提取物中水溶性部分和脂溶性部分，重复性好，可操作性强，符合指纹图谱检测要求，为吴 茱萸药材及其提取物的质量控制和真伪鉴别提供了 一种全新的方法。

发明内容
本发明的目的为吴茱萸药材及其提取物HPLC指纹图谱提供一种构建方法，以及 由此方法所得到的吴茱萸药材及其提取物指纹图谱。本发明的吴茱萸药材及其提取物HPLC指纹图谱构建方法如下1、贵州余庆吴茱萸药材HPLC指纹图谱的构建方法1. 1供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的样品粉末(过60目筛)0. Ig lg，置具塞锥形瓶中，加入 浓度为45% 90%的甲醇溶液25mL 50mL，称重，超声处理10分钟 1. 5小时，放冷，称 重，补足减失的重量，滤过，取续滤液适量，以0. 45 μ m微孔滤膜滤过，即得。1.2HPLC 分析
色谱条件为色谱柱DiamonsilCw柱 Q50mmX4. 6mm，5 μ m)；柱温20°C :35°C; 流速:0. 8mL · miiT1 1. 2mL · mirT1 ；色谱峰光谱采集范围:190nm 400nm,流动相为甲 醇-0. 02%磷酸(pH 2. 95 3. 05)，采用线性梯度洗脱方式0分钟一35分钟一40分钟 —53 分钟一56 分钟一80 分钟，甲醇31%— 50%— 53%— 72%— 95%,0. 02% 磷酸水溶液85 % — 69 % — 50 % — 47 % —观％ — 5 %，检测波长250nm士 2nm，得到吴茱萸药 材HPLC指纹图谱。按上述发明的方法，通过对21批吴茱萸药材样品构建HPLC指纹图谱并进行分析 比较，找出其共有特征峰(共22个峰)，得到吴茱萸药材的指纹图谱，22个共有峰的保留时 间(tK)分别为10. 0分钟，12. 5分钟，14. 0分钟，16. 5分钟，17. 4分钟，18. 7分钟，23. 0分 钟，24. 6分钟，26. 1分钟，28. 2分钟，30. 1分钟，36. 3分钟，47. 7分钟，50. 0分钟，51. 9分钟， 52. 6分钟，62. 3分钟，65. 4分钟，69. 4分钟，79. 5分钟，81. 1分钟，82. 6分钟。2、贵州余庆吴茱萸提取物HPLC指纹图谱的构建方法2. 1吴茱萸提取物的制备2. 1. 1吴茱萸水提取物的制备称取吴茱萸适量，用5 15倍量水回流提取1 3次，每次0. 5 3小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为1. 20 1. 35的稠 膏。后将稠膏置减压干燥箱内于0. 02Mpa 0. 15Mpa，40°C 60°C下干燥M小时 48小 时，取出研碎即得。2. 1.2吴茱萸醇提取物的制备称取吴茱萸适量，用5 15倍量60% 80%的乙 醇回流提取1 3次，每次2小时 4小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为 1. 20 1. ；35的稠膏。后将稠膏置减压干燥箱内于0. 02Mpa 0. 15Mpa，40°C 60°C下干燥 24小时 48小时，取出研碎即得。2. 2供试品溶液的制备称取干燥的粉浸膏0. Ig lg，精密称定，置50mL的具塞锥形瓶中，加入45% 90%甲醇25mL 50mL，称重，超声提取10分钟 90分钟，放冷，称重，补足减失的重量，滤 过，去续滤液适量，以0. 45 μ m微孔滤膜滤过，即得。2.3HPLC 分析色谱条件为色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m)分析柱，流动相 为乙腈-0. 甲酸水溶液，采用流动相二元梯度洗脱系统，0分钟一5分钟一38分钟一65 分钟，乙腈5%- 23%- 100%,0. 甲酸水溶液95%—95%— 77%—0%流速为 ImL .mirT1检测波长为258nm士2nm，柱温20°C 35°C，得到吴茱萸提取物HPLC指纹图谱。按上述发明的方法，通过对吴茱萸提取物样品构建HPLC指纹图谱并进行分析，找 出其特征峰(共20个峰)，得到吴茱萸提取物的指纹图谱，20个特征峰的保留时间(tK)分 别为吴茱萸醇提取物的保留时间9. 6分钟，12. 2分钟，13. 2分钟，15. 9分钟，16. 4分 钟，20. 8分钟，21.3分钟，22. 9分钟，24. 4分钟，25. 7分钟，28. 3分钟，35. 7分钟，39. 2分钟， 40. 3分钟，41. 3分钟，53. 3分钟，54. 0分钟，55. 6分钟，56. 6分钟，66. 1分钟。吴茱萸水提取物的保留时间9. 6分钟，12. 1分钟，13. 2分钟，15. 9分钟，16. 4分 钟，20. 8分钟，21.3分钟，22. 9分钟，24. 4分钟，25. 6分钟，28. 2分钟，35. 7分钟，39. 1分钟， 40. 2分钟，41. 6分钟，53. 3分钟，54. 0分钟，55. 5分钟，56. 6分钟，63. 8分钟。
3.贵州余庆吴茱萸药材及其提取物HPLC指纹图谱方法具有以下显著的优点和用 途a.所建立的指纹图谱整合了吴茱萸水溶性成分和脂溶性成分，能较全面地体现贵 州余庆吴茱萸药材及其提取物的整体化学信息；b.本方法指纹图谱较已知方法而言，色谱峰个数更多，分离度更好，质量控制精度 更高；c.与已公开技术相比，本方法的供试品溶液制备过程更加简捷、色谱条件更易于 实现，实验结果重现性更好；d.所建立的指纹图谱可用于吴茱萸药材及其提取物的真伪鉴别和质量控制。


图112批余庆不同产地吴茱萸药材指纹图谱共有模式；图2花椒、马桑子与吴茱萸指纹图谱的比较图谱(Si为吴茱萸、S2为花椒、S3为马 桑子)；图3吴茱萸醇提取物特征图谱；图4吴茱萸水提取物特征图谱。
具体实施例方式实施例一、吴茱萸药材HPLC指纹图谱的建立方法1仪器、样品、试药及试剂1. 1 仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪，DAD 检测器，Agilent Chemstation 色 谱工作站，色谱柱Diamonsil Cw 柱 Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)。1.2样品21批吴茱萸药材样品，分别来自贵州、湖南、重庆、江西、浙江等地，经鉴 定均为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss. )Benth.的果实。1.3试剂甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2. 1供试品溶液的制备取干燥至恒重的样品粉末(过60目筛)约0.2g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶 中，加50%甲醇25mL，称重，超声处理(功率250W，频率33kHz) 20分钟，放冷，称重，补足减 失的重量，滤过，取续滤液适量，以0. 45 μ m微孔滤膜滤过，即得。2.2HPLC 分析色谱柱DiamonsilCw 柱 Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)；柱温25°C;流速1. OmL 'min-1 ； 色谱峰光谱采集范围190nm 400nm，检测波长250nm。甲醇-0. 02%磷酸(pH2. 95 3. 05) 梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件
权利要求
1.一种贵州余庆GAP基地吴茱萸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于包括 以下步骤步骤一，供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的样品粉末0. Ig lg，过60目筛，置于具塞锥形瓶中，加入体积 比为45% 90%的甲醇溶液25mL 50mL，称重，超声处理10分钟 90分钟，放冷，称重， 补足减失的重量，滤过，取续滤液适量，以0. 45 μ m微孔滤膜滤过，即得；步骤二，高效液相色谱分析精密吸取步骤一的供试品溶液2 μ L 20 μ L进样，色谱条件如下色谱柱为Diamonsil C18柱，填料粒径2 μ m 8 μ m，柱长150mm 250mm，柱温20°C 35°C ；流速0. 8mL .mirT1 1.2mL· miiT1 ；色谱峰光谱采集范围190nm 400nm，流动相按体积比由甲醇-0. 01 0. 02%磷酸水溶液(pH 2. 95 3. 05)混合而成，采用线性梯度洗脱方式从0分钟一35分 钟一40分钟一53分钟一56分钟一80分钟，甲醇比例31% — 50% — 53% — 72% -95% (体积比)，0.02%磷酸水溶液比例85%—69%—50%—47%—28%—5% (体 积比)，检测波长250nm士2nm ；得到吴茱萸HPLC指纹图谱；步骤三，分析比较测定12批吴茱萸药材样品高效液相色谱指纹图谱并进行分析比较，得到由其共有特 征峰构成的吴茱萸药材指纹图谱，该指纹图谱具有的22个共有峰的保留时间tK分别为 10. 0分钟、12. 5分钟、14. 0分钟、16. 5分钟、17. 4分钟、18. 7分钟、23. 0分钟、24. 6分钟、 26. 1分钟、28. 2分钟、30. 1分钟、36. 3分钟、47. 7分钟、50. 0分钟、51. 9分钟、52. 6分钟、 62. 3分钟、65. 4分钟、69. 4分钟、79. 5分钟、81. 1分钟、82. 6分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是保留时间tK= 26. 1分钟的第9号峰为绿原 酸，tE = 65. 4分钟的第18号峰为吴茱萸碱，tE = 69. 4分钟的第19号峰为吴茱萸次碱。
3.一种贵州余庆吴茱萸提取物高效液相色谱指纹图谱的建立方法步骤一，吴茱萸提取物的制备吴茱萸水提取物的制备称取适量吴茱萸，用5 15倍量水回流提取1 3次，每次0.5小时 3小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为1. 20 1. 35的稠膏，然 后后将稠膏置减压干燥箱内于0. 02Mpa 0. 15Mpa，40°C 60°C下干燥24小时 48小时， 取出研碎即得；吴茱萸醇提取物的制备称取适量吴茱萸，用5 15倍量60% 80% (体积比)的 乙醇回流提取1 3次，每次2 4小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为1.20 1. 35的稠膏，后将稠膏置减压干燥箱内于0. 02Mpa 0. 15Mpa，40°C 60°C下干燥 24h 48h，取出研碎即得；步骤二，供试品溶液的制备供试品溶液的制备称取0. Ig Ig干燥的粉浸膏，精密称定，置于50mL的具塞锥形瓶 中，加入45% 90%甲醇(体积比)25ml 50mL，称重，超声提取10分钟 90分钟，放冷， 称重，补足减失的重量，滤过，去续滤液适量，以0. 45 μ m微孔滤膜滤过，即得；步骤三，高效液相色谱分析高效液相色谱分析精密吸取供试品溶液2μ L 20 μ L进样，色谱条件如下色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-C18分析柱，填料粒径5 μ m，柱长150mm，柱内径4. 6mm,柱温20°C 35°C，流动相为乙腈-0. 1% (体积比)甲酸水溶液(pH 2. 55 2. 65)混合而成，采用流动相 二元梯度洗脱系统0分钟一5分钟一38分钟一65分钟，乙腈23% — 100%， 0.1%甲酸(体积比)水溶液95%—95%—77%—0%，流速为ImL · mirT1，检测波长为 258nm士2nm ；得到吴茱萸提取物HPLC指纹图谱； 步骤四，分析比较测定吴茱萸提取物样品高效液相色谱指纹图谱并进行分析，得到由其特征峰构成的吴 茱萸提取物指纹图谱，该指纹图谱具有的20个特征峰的保留时间tR分别为吴茱萸醇提取物的保留时间9. 6分钟、12. 2分钟、13. 2分钟、15. 9分钟、16. 4分钟、 20. 8分钟、21. 3分钟、22. 9分钟、24. 4分钟、25. 7分钟、28. 3分钟、35. 7分钟、39. 2分钟、 40. 3分钟、41. 3分钟、53. 3分钟、54. 0分钟、55. 6分钟、56. 6分钟、66. 1分钟。吴茱萸水提取物的保留时间9. 6分钟、12. 1分钟、13. 2分钟、15. 9分钟、16. 4分钟、 20. 8分钟、21. 3分钟、22. 9分钟、24. 4分钟、25. 6分钟、28. 2分钟、35. 7分钟、39. 1分钟、 40. 2分钟、41. 6分钟、53. 3分钟、54. 0分钟、55. 5分钟、56. 6分钟、63. 8分钟。
全文摘要
本发明提供了一种贵州余庆GAP吴茱萸药材及提取物的HPLC指纹图谱质量控制方法，包括供试品溶液的制备，提取物的制备，色谱条件的确定，使用高效液相色谱仪进行测定，并首次选用吴茱萸的两种伪品(花椒、马桑子)完成指纹图谱适用性检验，得到吴茱萸药材及其提取物HPLC指纹图谱，较全面地表达了吴茱萸药材及其提取物的整体化学信息，确定其指纹特征，该指纹图谱囊括了水溶性部分和脂溶性部分，具有方法简便、重复性好、特征峰多、准确可靠的特点。所建立的HPLC指纹图谱能有效地控制吴茱萸药材及其提取物的质量及用于真伪鉴别。
文档编号G01N30/36GK102141555SQ20101060632
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者何平, 张丽丽, 张丽艳, 李健, 杨玉琴, 潘雯婷, 王晖, 罗君, 陈新华, 黄健 申请人:贵阳中医学院