专利名称：用于读取微阵列的电气可重用设备的制作方法
技术领域：
本发明的主要目的是一种用于电读取微阵列的设备，其可以被清洁并且可以被重 用不止一次。
背景技术：
自从八十年代末出现生物芯片或微阵列以来，它们已使得定量解释许多重要生物 现象成为可能。微阵列是一组允许同时进行许多测试的平板上的(从几nm至几mm的)小 型样点或测试点，从而与系列分析系统相比大大提高了分析速度和分析能力。这些元件被设计成分析复杂生物样品的蛋白质含量、蛋白质-蛋白质交互作用、 蛋白质-DNA交互作用、蛋白质-配基交互作用、DNA突变的存在，基因表达谱等等。使用抗 体作为识别元件的微阵列基于不同类型的测试-夹层型，当由支撑物上固定的抗体捕获被分析物并且借助于第二标记抗体对其 进行量化时。-竞争型，当将被分析物的复制品固定在支撑表面样点上并基于在被分析样品参 与的情况下接合至所述样点的标记抗体间接对所述被分析物进行量化时。-反相型，当将样品直接吸引在支撑物的表面上并且用标记抗体识别被分析物时。在所有上述情况中，都通过检测与抗体接合的标记来进行量化。在DNA芯片的情 况下，该标记与正在被分析的DNA或RNA片段接合。这些标记可以是光学的(荧光分子、量 子点、产物沉淀的酶)、放射性的(放射性同位素)或者电化学的(产物是电活性的或者是 电活性的纳米粒子的酶)。与应用较广的荧光标记相比，这种新型标记的优点在于，允许使 用纯电气的因而更紧凑、健壮且更便宜的读取仪器。市场上存在使用这种类型读取的产品， 例如，COMBIMATRIX Electrasense 读取器(W0 2008051196)。Nanoident iTechnologiesa 司也出售电读取微阵列的紧凑型系统，其基于印刷在进行测试的同一支撑物上的有机光电 二极管“矩阵”(W02006(^6796)。然而，为了将微阵列的应用扩展到需要它的地方(医院或私人保健中心的病床 前)，该装置必须在成本、健壮性、简单和尺寸方面有所改善。这种分析装置基本上由两个有 区别的部分组成进行测试所在的微阵列和用以读取所述测试的结果的设备。在某些情况 下，为了自动进行测试，在该系统中还使用了其它配件，例如，用于在具有液体活性成份的 微阵列(点样仪)或元件的样点或测量点上沉积识别成份或样品的机械臂。电气读取设备更健壮、简单且更小。然而，它们具有需要在支撑物本体上形成器件 矩阵(电极或光电二极管)的缺点，这需要每当进行测试时使用新的支撑物且废弃用过的 支撑物。另外，该支撑物是复杂昂贵的元件，因为它必须包括电气换能器等等，而非在光学 系统中通常使用的简单地由玻璃或塑料的功能化片组成的支撑物。
发明内容
本发明描述电气可重用微阵列读取设备，其基于当酶标记所标记的表面与化学基质接触时的酶促反应的产物累积的电化学测量(电流测量、电势测量或阻抗测量)。本设备 的新颖性在于这样的事实，即负责执行测量的换能器位于与微阵列支撑物不同的基板上， 使得读取设备可以重复用以想进行多少分析就进行多少分析。另外，该读取设备可以用公 知光学系统所使用的低成本支撑物进行工作。对使用该读取设备的唯一要求在于，所用的 酶标记在与其相应的化学基质起反应时生成可以被换能器检测到的产物，也就是，会使发 生反应的介质的电气或化学性质改变的产物。因此，本发明的换能器将介质的电气量值或 化学量值转换成电气量值。在阻抗测量式换能器的情况下，化学基质必须是具有与这些产物的净电荷总数不 同的净电荷的化学种(chemical species)，使得在当酶促反应发生时带电种的浓度发生改 变从而介质的电导率发生改变。这个的实例是尿素酶，其在与尿素(中性种)起反应时产 生氨和二氧化碳。氨很快被质子化，从而使氨离子产生(带正电)，而二氧化碳被部分转换 成碳酸氢盐(带负电)。在安培测量式换能器的情况下，酶促反应必须产生电活性种。这个的实例是碱性 磷酸酶，其在对-氨基苯基磷酸盐(p-aminophenyl phosphate)参与的情况下产生对-氨 基苯酚(p-aminophenol)。对-氨基苯酚在低于200mV的电势被氧化，从而使对-醌亚胺 (p-quinoneimine)产生。该酶/基质系统允许使用氧化还原循环，因为对-醌亚胺反过来 可以被降低到_200mV的电势以下，从而再一次使对-氨基苯酚产生。在电势测量式换能器的情况下，酶促反应必须产生可以由该换能器检测的离子。 最简单的情况将是产生PH变化的酶。在本文献中，我们将涉及这样的事实，即微阵列通过平坦支撑形成，其中我们将称 为“测试表面”的表面之一具有带酶标记的样点矩阵。该平坦支撑可以是通常与其它类型 的读取装置(例如，光学装置)一起使用的支撑中的任一种，并且可以除了别的以外由诸如 玻璃或塑料之类的材料制造而成。因此，根据本发明的第一方面，包括下列元件的电气可重用微阵列读取设备被描 述如下1)基板，包括用于将所述微阵列的测试表面布置为平行于所述基板的读取表面的 支撑装置。所述基板的支撑装置必须使得所述微阵列测试表面被布置为平行于所述基板的 读取表面。另外，这两个表面之间的距离必须达到这样的程度以致允许水介质液滴同时接 触这两者，从而使得存在于水介质中的化学基质与微阵列样点的酶标记接触，从而产生形 成影响水介质的电气或化学性质的产物的化学反应。2)换能器矩阵，布置在所述基板的读取表面上，其将电气或化学量值的变化转换 成电气量值的变化。所述换能器被固定到所述基板的读取表面，从而形成矩阵，使得当所述微阵列被 布置在所述支撑装置上方时每个换能器被布置为与样点反向。为了执行所述读�。嘤Щ实乃橹室旱伪匦胧┘釉诿扛龌荒芷饔氡� 布置为与其反向的相应样点之间。水介质液滴可以以任何方式来形成，假设它们具有相同 的尺寸并且彼此不接触。例如，虽然在本发明的优选实施例中，本发明的微阵列读取设备包 括用于施加水介质液滴的装置，但可使用微量吸移管或点样仪型装置。
优选地，用于施加水介质液滴的装置集成在微阵列读取设备本体中并且包括水 介质水箱，被联结至所述基板的与所述读取表面相反的表面；以及在所述设备本体的基板 中制作的微管道矩阵。每个微管道将水介质水箱连接至每个换能器所在的地方，使得通过 更改水箱上的压力实现水介质的受控式注射，从而在每个换能器上方形成均勻体积的液 滴。另外，水介质水箱包括水介质的输入端和输出端，使得可以用其注射不同的液体。在另一优选实施例中，用于施加水介质液滴的装置是施加器，其包括水介质水箱 和在水箱的箱壁之一中制作的微管道矩阵。如在前一段所描述的用于施加水介质液滴的装 置的情况一样，通过在所述基板的读取表面上正确地布置施加器并且更改水箱上的压力， 将液体注入到每个换能器的上方，直到形成想要体积的液滴。这可以通过利用类似于喷墨 打印机所用的机构直接形成单个液滴或沉积从微管道喷嘴排出的许多微液滴来完成，其在 接合在换能器上方时形成液滴。由于是未集成在基板中的施加器，它必须被放置成使得每 个微管道被布置为与换能器相对立。为此，可以使用用于布置微阵列的相同支撑装置。3)读取装置，连接至换能器，其解释换能器的电信号。一旦这些液滴与酶标记的微阵列样点接触，酶促反应就会发生。在那些具有较高 浓度酶标记的样点中，换能器将会测量到产物浓度有较大的变化。这些液滴被彼此分离，因 此这些产物在其体积上积累而在该矩阵的不同点之间没有干扰。因此，换能器矩阵被连接 到能够获取并处理由所述换能器中的每个换能器生成的信号的电子测量电路。在某个时间 之后或在这些液滴接触这些样点的同时可以执行该测量。第二种情况允许我们测量酶促反 应动态，从而提供更多的分析信息。例如，它可以允许更宽的动态范围，因为可以在达到饱 和值之前检测产物浓度的演变。根据本发明的第二方面，描述用于利用先前描述的读取设备读取微阵列的电气工 艺，其包括下列操作a)使微阵列样点与水介质液滴接触，从而在每个液滴中产生化学反应，其使形成 该液滴的水介质的电气或化学性质改变。可以以两种不同的方式进行该操作。根据特定的实施例，首先可以在换能器上方 生成水介质液滴，接下来借助于支撑装置将微阵列布置为平行于基板的读取表面并且处于 某个距离，使得每个样点被布置为与换能器的表面相对立并且水介质液滴接触这两者。在另一特定实施例中，可以首先将微阵列布置在支撑装置上，而后将水介质注射 在换能器上方，直到为每个换能器形成尺寸足够大的液滴，以同时接该触换能器和被布置 为与其相对立的样点。b)响应于形成所述液滴的水介质的电气或化学性质的改变，利用读取装置读取由 所述换能器中的每个换能器生成的电信号。一旦水介质液滴与酶标记样点接触，包含在水介质中的化学基质与所述样点的酶 标记之间开始起化学反应，并且作为反应的结果，产生了使形成该液滴的水介质的电气或 化学性质改变的产物。接下来的读取操作可以要么在该矩阵的所有换能器上方同时执行， 要么按行、列或单独地顺序执行。c)清洁该设备的读取表面并且重复使用它以进行新的测试。重要的是，一旦已执行了该读取并且在执行新的读取之前，清洁这些换能器和该 设备的基板的读取表面，以便去除酶促反应的产物或可能已经与微阵列分离的酶的所有痕迹。在这一点上，清洁溶液必须能够溶解酶促反应的产物并且使酶变性，以便它们完全丧失 其活性。可以通过在去离子水中进行漂洗来完成清洁。可以采用传统方式或根据本发明的特定实施例进行清洁，抽吸生成的水介质液滴 并且随后利用用于施加水介质液滴的装置注射清洁溶液。为了进行该工艺的这个操作，用 于施加水介质液滴的装置必须能够在与微管道连接的水箱上生成负压并且用该水箱的水 介质代替合适的清洁溶液。
为了补充本说明书并且为了有助于更好理解本发明的特点，根据其实用实施方式 的优选实例，已经包括了作为所述说明书的组成部分的一组附图，其中已经以示例性的且 非限制的方式描绘了下列内容。图1示出具有平坦支撑物的微阵列的示意图，图示说明了其不同的构成部件。图2示出根据本发明的用于读取微阵列的电气设备的示意图。图3和图4示出用于施加水介质液滴的装置的两个特定实施例。图5和图6示出根据本发明的特定实施例的用于电读取微阵列的工艺的第一操作。图7示出根据本发明的读取装置的特定实施例。
具体实施例方式图1示出由平坦支撑(9)形成的微阵列(6)，测量点或样点(8)矩阵被布置在微阵 列(6)的测试平面(7)上并且由酶标记进行标记。图2示出根据本发明的用于读取微阵列的设备(1)的示意图。我们可以看到，它 由基板( 形成，在基板O)的读取平面(4)上存在对水介质的电气或化学性质的变化做 出反应的换能器(5)矩阵。该实例的用于读取微阵列的电气可重用设备(1)还在基板( 的侧面上包括支撑 装置(3)，其用来支撑微阵列(6)，使得该矩阵的每个样点(8)被布置为与换能器( 相对 立。在该实例中，支撑装置C3)基本上包括一边缘，其用作在读取工艺期间对微阵列(6)的 支撑。虽然在该图中看不到，但已在图7中描绘的读取装置(10)被布置在与读取平面(4) 相反的表面上。基板( 和换能器( 矩阵由直径为IOOmm的派热克斯型玻璃晶片制造而成。该 工艺开始于沉积钛、镍和金的金属三层(在派热克斯上沉积20nm厚的钛层、在钛上沉积 50nm厚的镍层并且在镍上沉积成50nm厚的金层)。通过阴极溅射方式沉积这三种金属。接 下来，使用包含用于限定叉指式(interdigitated)电极对矩阵的图案的模板进行标准光 刻工艺。每对叉指式电极包含相互之间的间隔为20 μ m的十四个20 μ m宽的指状物(每个 电极七个)，其中叉指式区域长500 μ m。相同的模板用于限定从每个电极延伸到芯片的边 缘的连接轨道，其中限定了用于借助于丝焊(wire welding)将其连接至印刷电路的区域。 换能器形成相互之间的间距为6mm的4X9个元件的矩形矩阵。两个诸如所述的矩阵之类 的换能器( 矩阵装配在IOOmm晶片中。利用不同的腐蚀方案进行在光刻之后的金属腐 蚀。在金的情况下，使用5700ml的H20、435g的KI和250g的I2的混合物。在镍的情况下，使用70% HNO3 H2O的1 4混合物。在钛的情况下，使用49% HF H2O 1. 2-丙二醇 的1 10 33混合物。一旦已限定了晶片上的电极，通过动力锯锯穿该晶片以分离两个换能器(5)矩 阵。将这些矩阵接合至印刷电路，其中已限定了借助于丝焊进行连接的必要区域并且存在 用于将这些电极电连接至仪器的连接器。在对这些电极进行丝焊之后，借助于可热固化聚 合物(Epotek H77)来保护这些丝线。支撑装置(3)由模化的聚二甲基硅氧烷制造而成并 且借助于氧等离子体活化作用焊接至换能器矩阵。对于它们来说，图3和图4分别示出用于施加水介质的装置的两个优选实施例。在 图3中，它们被集成到基板(2’)，使得形成在与读取表面(4)相反的表面上的水介质(11’) 水箱通过横跨基板(2’ )的微管道(12’ )矩阵将水介质注射到放置每个换能器(5’ )的地 方。在该实例中，换能器(5’ )具有布置每个微管道的喷嘴的中央开口。在图4中，用于施加水介质的装置由施加器组成，该施加器由水介质水箱(11’)形 成，在水介质水箱(11’ )的箱壁之一上有微管道(12’)，通过微管道(12’ )在换能器(5’ ) 上方注射水介质。为了将每个微管道布置为与换能器(5’)相对立，支撑装置(3”)还包括 第二边缘，在该第二缘上布置该水介质施加器。图5和图6示出本发明的工艺的优选实施例的若干操作。特别地，图5示出微阵 列(6)和读取装置(1)，其中之前已进行了在每个换能器( 上方注射水介质液滴的操作。 在图6中所描绘的时刻，微阵列(6)已经被准备为布置在支撑装置C3)上，其中每个水介质 液滴已经接触样点(8)，因此酶标记与基质之间化学反应已经开始。最后，图7示出酶标记与化学基质之间的化学反应的产物造成该液滴的水介质的 阻抗改变的情况下的测量仪器。该仪器包括交流电压的激励源(1 和交流电流测量电路 (16)，它们结合起来能够测量在叉指式电极(17)的两端上看到的阻抗。在该图中，我们可 以看到所述源(15)和测量电路(16)与电极(17)的连接。正如所看到的，阻抗测量式换能 器允许行到列型连接。这使得制造具有许多元件的矩阵可行。例如，由IOM个元件组成的 矩阵将仅仅需要32个交流激励源(15)和32个电流测量电路(16)。实际上，通过合适的多 路复用，单个激励源(1 和单个电流测量电路(16)是足够的。在矩阵元件非常多的情况 下，还将需要大量的丝焊。为了解决这个问题，我们可以如图7中所示使用基于金属双层的 制造技术并且在晶片层面通过行和列连接电极(17)。以这种方式，需要用来封装nXm换能 器矩阵的丝焊数仅为n+m。在这里所描述的实例中，激励源是由National Instruments公 司制造的NI USB-6259卡的模拟输出。在该实例中，已使用具有IOOk Ω的精确反馈电阻的 AD8674运算放大器实现电流测量电路(16)。该运行放大器输出电压值已经由上面提及的 卡的模拟输入来记录。在读取时间期间，LabView程序控制采集过程、处理所获取的信号并 且获得的换能器(5)的阻抗值。根据下列顺序实现采集过程首先，通过施加幅值为50mV 且频率为2kHz的交流电压激励一行换能器(5) 25ms。其余激励源(1 保持在0V。在这个 时间期间，使用与换能器( 列中的每个换能器( 连接的模拟输入来获取信号。接下来， 我们将以同样的方式进行下一行等等，直到已读取所有换能器行。下面我们描述使用用于读取微阵列(6)的电气可重用设备⑴的实例，其中电气 可重用设备(1)基于用于测量使用尿素酶作为酶标记的微阵列(6)中的结果的阻抗测量式 换能器(5)。
在尿素(中性)参与的情况下，尿素酶产生氨和二氧化碳。氨很快被质子化，从而 使氨离子产生(带正电)，而二氧化碳实际上被转换成碳酸氢盐(带负电)。因此，酶促反 应增加了原缓冲液的导电性。原缓冲液由0. IM尿素和0. 25M的甘氨酸水溶液形成，具有 大约16μ S/cm的电导率。在该实例中，利用微量吸移管手动将体积为1 μ 1的缓冲液液滴 沉积在换能器(5)的上方。在制备微阵列时，用兔子免疫球蛋白G作为待检测的标准被分 析物并且应用反相型测试。它由配制所述标准被分析物的原液的连续稀释液组成。所配制 的稀释液中每种稀释液的体积为1μ 1的微液滴被沉积在微阵列(6)的支撑(9)(先前硅烷 化后的玻璃载玻片)上。在固定被分析物后，用山羊抗体和尿素酶标记的兔子免疫球蛋白 G的溶液培养微阵列(6) —小时，在这段时间，在被分析物与标记抗体之间出现特定的交互 作用。在用去离子水清洁微阵列(6)并且在氮气流中进行干燥之后，利用阻抗测量式换能 器(5)矩阵对它进行读取。
权利要求
1.一种用于读取微阵列(6)的电气可重用设备(1、1’、1”)，其中所述微阵列(6)包括 平坦支撑(9)，在所述微阵列(6)的测试表面上存在带有酶标记的样点(8)矩阵，其特征在 于，所述电气可重用设备包括基板0、2’、2”)，其包括用于将所述微阵列(6)的测试表面(7)放置为平行于所述基 板(2、2，、2”)的读取表面(4)的支撑装置(3、3，、3”)；布置在所述基板(2、2’、2”)的读取表面(4)上的换能器(5、5’、5”)矩阵，所述换能器 (5、5’、5”)将电气或化学量值的变化转换成电气量值的变化；以及连接至所述换能器(5、5’、5”)的读取装置(10)，所述读取装置(10)解释所述换能器 (5、5’、5”)的电信号。
2.根据权利要求1所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1、1’、1”)，其特征在于，所述 基板0、2’、2”)和所述换能器(5、5’、5”)矩阵由派热克斯型玻璃晶片制造而成。
3.根据权利要求1至2中的任一项所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1、1’、1”)， 其特征在于，所述换能器(5、5’、5”)从下面列表中选择阻抗测量式换能器、电流测量式换 能器和电势测量式换能器。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1、1’、1”)， 其特征在于，所述读取装置(10)包括适用于获取并处理由所述换能器(5、5’、5”)生成的 电信号的电子电路。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1、1’、1”)， 其特征在于，所述设备(1、1’、1”)进一步包括用于施加水介质液滴的装置，以在每个换能 器(5、5’、5”)上方形成水介质液滴。
6.根据权利要求5所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1”)，其特征在于，所述用于 施加水介质液滴的装置是施加器，所述施加器包括水介质水箱(11”)和在所述水介质水 箱(11”)的箱壁之一中制作的微管道(12”)矩阵。
7.根据权利要求5所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1”)，其特征在于，所述用于 施加水介质液滴的装置包括水介质水箱(11’)，被布置为与所述基板(2’ )的与所述读取 装置(4)相反的表面邻接；以及在所述基板(2’ )中制作的微管道(12’ )矩阵。
8.根据权利要求7所述的用于电读取微阵列(6)的设备(1”)，其特征在于，所述微管 道(12’ )包括排列在所述换能器(5’ )的中央开口中的喷嘴。
9.一种用于读取微阵列(6)的工艺，其中所述微阵列(6)包括平坦支撑(9)，在所述 平坦支撑(9)的测试表面(7)上存在带有酶标记的样点(8)矩阵，并且其中读取设备(1、 1，、1”)包括基板(2、2’、2”)，在所述基板(2、2，、2”)的读取表面(4)上布置有换能器(5、 5’、5”)矩阵，所述换能器(5、5’、5”)将电气或化学性质的改变转换成电气性质的改变，其 特征在于，该工艺包括下列操作将所述基板0、2’、2”)的读取表面⑷放置为平行于所述微阵列(6)的测试表面(8)， 使得每个样点(8)被布置为与所述换能器(5、5’、5”)相对立并使水介质液滴与两者接触；响应于形成所述液滴的水介质的电气或化学性质的改变，利用所述读取装置(10)读 取由所述换能器(5、5’、5”)中的每一个生成的电信号；并且清洁所述设备(1)的读取表面以重复使用所述设备(1)进行新的读取。
10.根据权利要求9所述的用于读取微阵列(6)的工艺，其特征在于，在使所述微阵列(6)的样点(8)接触所述换能器(5、5’、5”)之前添加所述水介质液滴。
11.根据权利要求9所述的用于读取微阵列(6)的工艺，其特征在于，在使所述微阵列 (6)的样点(8)接触所述换能器(5、5’、5”)之后添加所述水介质液滴。
12.根据权利要求9至11中的任一项所述的用于读取微阵列(6)的工艺，其特征在于， 在每个水介质液滴保持接触所述样点(8)和换能器(5、5’、5”)的时间期间执行所述读取操 作。
13.根据权利要求9至11中的任一项所述的用于读取微阵列(6)的工艺，其特征在于， 在所述水介质液滴已接触所述样点之后的预定时段，仅执行所述读取操作一次。
14.根据权利要求9至13中的任一项所述的用于读取微阵列(6)的工艺，其特征在于， 通过施加水介质液滴的方式注射清洁溶液来执行所述读取设备(1、1’、1”)的清洁操作。
全文摘要
本发明涉及用于电读取微阵列的设备，其可以被清洁并被使用不止一次。用于读取微阵列(6)的设备(1、1’、1”)的设备包括下列元件基板(2、2’、2”)，包括用于将所述微阵列(6)的测试表面(7)放置为平行于所述基板(2、2’、2”)的读取表面(4)的支撑装置；换能器(5、5’、5”)矩阵，布置在所述基板(2、2’、2”)的读取表面(4)上，将电气或化学值的变化转换成电气值的变化；以及读取装置(10)，其连接至所述换能器(5、5’、5”)并且解释来自所述换能器(5、5’、5”)的电信号。
文档编号G01N27/00GK102089648SQ200980126980
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月8日 优先权日2008年7月11日
发明者塞萨尔·费尔南德斯·桑切斯, 安东尼奥·巴尔蒂·科尔, 戴安娜·里塞特·波利拉·阿奎拉尔, 罗伯托·德·拉·里卡·奎萨达 申请人:西班牙高等科研理事会
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