专利名称：一种用于男性不育症检测方法的检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明关于一种用于男性不育症检测方法的检测试剂，尤其是一种将2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷用于男性不育症，特别是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法中。
背景技术：
男性生殖健康的状况直接关系到子孙后代的幸福与人类的生存和文明的延续，因而这已引起全社会的高度重视。目前，主要是通过常规精液检查获得如精液量、精子密度、活动力、活动度、存活率等临床数据，来作为判断是否患有男性不育症的依据。
现有的方法大致可分为目测估计、仪器测定和图象辅助分析三大类。其中目测估计法主要是通过光学显微镜来观测精子活动情况判断精子的活动能力，其所得的检测结果准确与否很大程度上取决于个人技术、认真程度、判断能力和个人的工作经验等因素，因此并不可靠。仪器测定法主要包括精子穿透实验(即精子爬高实验)和精子速度实验两种。其中精子穿透实验是模拟精子活动的环境，测量玻璃毛细管内精子穿透高度、或测量精子实际穿透样品卵细胞的情况来衡量精子运动能力，如美国专利第6,465,197号所揭示的检测方法。
以上检测方法所给出的都是精子群体总的趋向的统计数据，不能定量地提供单个精子活动能力的有关参数。而实际临床检测发现往往有相当部分的精子貌似正常而其活动能力却十分低下，也有精子数量偏低但仍具有生育能力的病例。因此，人们已经意识到定量检测单个精子活动能力大小的重要性，中国专利申请第99108824.7号采用光镊技术来进行定量检测单个精子的活力，利用光镊捕获精液中的一个精子，将其束缚在液体中，然后降低激光输入功率，改变光镊对精子的作用力，直到精子凭自己的活动能力从光镊中逃脱，此时逃逸显示器上所显示的数据，即为该精子的逃逸力；通过测定多个精子的逃逸力然后示其平均力，可得到多个精子的平均活动能力，即精子的活力。
人们还发现精子细胞中含有的某些成分，如HspA2 chaperone蛋白、22KD蛋白、SP-22等，与男性生殖能力有很大关系，美国专利第6,197,940号和第6,541,206号等，即旨在检测将精液中这些成分暴露在有毒或受污染环境下时，其相应的生殖能力的下降情况。其所采用的方法是将特定抗体施加到前述精液中的蛋白质上，则实验精子对该抗体的认同程度可反映该实验精子的生殖能力。
另外，精液中的中性α-葡萄糖苷酶可选择性参与催化糖原α-1，4-葡萄糖苷键的水解，供给精子代谢与运动的能量，对精子的成熟、获能和受精具有重要的意义。α-葡萄糖苷酶的活力受性激素水平的影响，此酶由附睾分泌，是附睾的特异性酶和标记酶，可作为附睾的功能性指标。精浆中α-葡萄糖苷酶活性与精子活力呈正相关性，临床上将酶活力检测用于附睾原因不育症的诊断，以及输精管道阻塞性病变与睾丸生精障碍所致无精症的鉴别。
目前的α-葡萄糖苷酶试剂盒采用对硝基-苯基-α-D-葡萄糖苷作为酶反应底物，测定的色原是对硝基苯酚，其pKa值为7.15，摩尔吸光系数随着pH值的升高而增大，需以碱性条件呈色。而中性α-葡萄糖苷酶最适反应条件是pH＜7.00，因此，利用对硝基-苯基-α-D-葡萄糖苷作底物，必须采用终点法终止反应并呈色，检测方法烦琐，不能适应仪器自动化批量分析；为提高灵敏度、准确度，还必须增大反应时间并设定空白对照，试剂用量大，测定时间长，且底物主要依赖进口，在性能、价格上限制了其推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服上述现有技术的不足，提供一种将α-葡萄糖苷酶试剂用于男性不育症，尤其是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法及其检测试剂的制备方法。
本发明的技术要点是提供一种男性不育症的检测方法，包括以下步骤步骤一制备含2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的酶活力检测试剂液；步骤二制备精浆样品；步骤三取适量步骤一制得的酶活力检测试剂液与步骤二制备的精浆混合，在适当的条件下进行反应，测定α-葡萄糖苷酶的活性。
步骤一包括取适量2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷试剂粉剂溶于水，该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.49-0.88g，还原型谷胱甘肽为1.0-3.0mg。所述缓冲液固体可采用柠檬酸-柠檬酸氢盐、磷酸二氢盐-磷酸氢盐、酒石酸-酒石酸氢盐等。步骤一还包括将所述试剂粉剂溶于水，定容100.0ml，其中2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的浓度为20.7mmol/L。
步骤二包括将精浆样品，在37℃温度下放置30min，在2000转/min的转速下离心12min，得到所需精浆。
步骤三包括取检测试剂液1.5ml，精浆50ul，在37℃温度下进行反应；并用自动生化分析仪根据检测试剂液的吸光度的变化来测定α-葡萄糖苷酶的活性，反应检测波长为2-氯-硝基苯酚的最大吸收波长402nm。步骤三还包括以标准α-葡萄糖苷酶进行校正，酶单位(IU/L)为每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶的量，其正常参考范围为41.1±20.3IU/L。
本发明还提供一种用于上述男性不育症的检测方法的检测试剂的制备方法，包括以下步骤步骤一制备五乙酰氧基葡萄糖苷；步骤二采用步骤一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷；步骤三采用步骤二得到的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷。
步骤一包括取适量的葡萄糖与过量的乙酸酐、无乙酸钠混合并加热至90-100℃，搅拌反应30-60min，反应液充分搅拌并滴加碱液调节至pH值呈中性，除去乙酸，滤出五乙酰氧基葡萄糖苷固体。步骤一也可以是取适量的葡萄糖与过量的乙酰氯、硫酸混合并加热至80-90℃，搅拌反应30-60min，反应液充分搅拌并滴加碱液调节至pH值呈中性，除去酰氯和酸，滤出五乙酰氧基葡萄糖苷固体。
步骤二包括取五乙酰氧基葡萄糖苷、2-氯-4-硝基苯酚、经灼烧的氯化锌混合，油浴加热溶解，高温条件下充分搅拌。步骤二还包括将反应物以氯仿提取，用碱液洗去过量的2-氯-4-硝基苯酚，用无水硫酸钠干燥，浓缩至干，再用无水乙醇结晶得到颗粒状的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体。
步骤三包括将2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体溶于甲醇，滴加甲醇钠甲醇溶液，搅拌，以TCL监测反应，至乙酰氧基完全水解，减压浓缩至干。TCL监测反应采用的展开剂为3∶7的乙酸乙酯∶正己烷，完全水解后Rf＝0，再用甲醇重结晶。步骤三还包括以TCL检测产物的构型和纯度，所用的展开剂为4∶1的乙酸乙酯∶甲醇。α-糖苷较β-糖苷，其Rf值略高，产物TCL应为单点，下面无杂质。
本发明检测试剂的制备方法进一步包括步骤四取适量缓冲液固体、2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷和还原型谷胱甘肽混合制成粉剂保存。所述缓冲液固体可采用柠檬酸-柠檬酸氢盐、磷酸二氢盐-磷酸氢盐、酒石酸-酒石酸氢盐等。测定时，将粉剂配制成100.0ml溶液，成份为以50人份，浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.49-0.88g，还原型谷胱甘肽为1.0-3.0mg。
本发明在底物糖苷的合成反应中，葡萄糖分子中的羟基经乙酰化保护后，再采用常规试剂氯化锌催化成苷，可使糖部分脂溶性增加而加快成苷反应的速率，并减少低聚糖副产物的生成，从而提高产率。
通过优化反应条件，提高α-构型产物的选择性；采取中间产物、产物两步结晶提纯，得到高纯度α-构型糖苷。制备步骤简单，所用的试剂均为一般的试剂，成本较低，使得采用本发明制成的α-葡萄糖苷酶试剂盒的开发推广成为可能。
而且，选择2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷作为酶活力检测底物，性能更为优良经α-1，4-葡萄糖苷酶水解释放色原2-氯-4-硝基-苯酚，其pKa值为5.50，在中性α-葡萄糖苷酶的最适pH条件下已能呈色，因而，水解反应中可直接采用速率法分析。本发明α-葡萄糖苷酶试剂的制备方法更适合于自动化分析，且缩短了反应时间，无需对照试验，减少了试剂的用量，从而可降低试剂盒的成本，应用前景较好。
另外，应用本发明后，可根据2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷与α-葡萄糖苷酶作用的性质建立分析方法，及建立正常参考值范围。所得试剂盒批内变异＜3.5％，批间变异＜5.0％，符合临床检验要求。而且，更适合仪器自动化分析，测定结果更具有可比性和临床参考意义。
具体实施例方式
现结合具体实施例，对本发明一种将α-葡萄糖苷酶试剂用于男性不育症，尤其是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法及其检测试剂的制备方法作进一步详细说明。
本发明一种男性不育症的检测方法，包括以下步骤步骤一制备含2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的酶活力检测试剂液；步骤二制备精浆；步骤三取适量步骤一制得的酶活力检测试剂液与步骤二制备的精浆混合，在适当的条件下进行反应，测定α-葡萄糖苷酶的活性。
步骤一包括取适量2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷试剂粉剂溶于水，定容100.0ml，其中2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的浓度为20.7mmol/L。所述缓冲液固体可采用柠檬酸-柠檬酸氢盐、磷酸二氢盐-磷酸氢盐、酒石酸-酒石酸氢盐等。
此步骤中所用的该试剂粉剂的成份可以是如下实例所示该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.49g，还原型谷胱甘肽为1.0mg。
该试剂粉剂还可包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.55g，还原型谷胱甘肽为1.2mg。
该试剂粉剂可包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.60g，还原型谷胱甘肽为1.3mg。
该试剂粉剂可以是包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.68g，还原型谷胱甘肽为1.5mg。
该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.70g，还原型谷胱甘肽为2.1mg。
该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.88g，还原型谷胱甘肽为3.0mg。
步骤二包括将精液，在37℃温度下放置30min，在2000转/min的转速下离心12min，得到所需精浆。
步骤三包括取检测试剂液1.5ml，精浆50ul，在37℃温度下进行反应；并用自动生化分析仪根据检测试剂液的吸光度的变化来测定α-葡萄糖苷酶的活性，反应检测波长为2-氯-硝基苯酚的最大吸收波长402nm。步骤三还包括以标准α-葡萄糖苷酶进行校正，酶单位(IU/L)为每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶的量，其正常参考范围为41.1±20.3IU/L。
步骤二中，该试剂粉剂还可包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.55g，还原型谷胱甘肽为1.2mg。
步骤二中所使用的试剂粉剂可包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.60g，还原型谷胱甘肽为1.3mg。
步骤二中该试剂粉剂可以是包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.68g，还原型谷胱甘肽为1.5mg。
该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.70g，还原型谷胱甘肽为2.1mg。
该试剂粉剂包含配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的缓冲液固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.88g，还原型谷胱甘肽为3.0mg。
本发明检测试剂的制备方法包括以下步骤步骤一制备五乙酰氧基葡萄糖苷；步骤二采用步骤一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷；步骤三采用步骤二得到的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷。
步骤一包括取适量的葡萄糖与过量的乙酸酐、无乙酸钠混合并加热至90-100℃，搅拌反应30-60min，反应液充分搅拌并滴加碱液调节至pH值呈中性，除去乙酸，滤出五乙酰氧基葡萄糖苷固体。步骤一也可以是取适量的葡萄糖与过量的乙酰氯、硫酸混合并加热至80-90℃，搅拌反应30-60min，反应液充分搅拌并滴加碱液调节至pH值呈中性，除去酰氯和酸，滤出五乙酰氧基葡萄糖苷固体。
葡萄糖分子中的羟基经乙酰化保护后，再催化成苷，可使葡萄糖部分脂溶性增加而加快成苷反应的速率，并减少低聚糖副产物的生成，从而可提高产率。
步骤二包括取五乙酰氧基葡萄糖苷、2-氯-4-硝基苯酚、经灼烧的氯化锌混合，油浴加热溶解，高温条件下充分搅拌。步骤二还包括将反应物以氯仿提�。眉钜合慈ス康�2-氯-4-硝基苯酚，用无水硫酸钠干燥浓缩，再用无水乙醇结晶得到颗粒状的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体。
成苷反应的产物有α-和β-糖苷异构体，而此处所需的为α-构型的产物；而在设计合成线路时，若一味追求选择性，将会大幅度提高成本，但若忽略反应选择性，又会给进一步的分离带来困难。另外，采用氯化锌(ZnCl2)催化成苷，反应条件虽简单，但选择性不高。
经研究，发现α-糖苷为热力学控制，而β-糖苷则受动力学控制。因此，采用相对较高的温度、较长的反应时间，并增加酚糖的投料比，适当增加氯化锌的量均有利于α-糖苷的生成。但应注意的是，升高反应温度及增加氯化锌的用量会导致副反应增多，且极易碳化。
为此，本发明优化反应条件，2-氯-4-硝基苯酚与五乙酰氧基葡萄糖苷的投料比为3∶1，催化剂氯化锌与五乙酰氧基葡萄糖苷的投料比约为0.59∶1，反应温度可升至125-135℃，并适当调整反应时间，避免碳化。此条件下热力学控制的α-糖苷为主要产物，使得反应选择性大幅度提高。
步骤三包括将2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体溶于甲醇，滴加甲醇钠甲醇溶液，搅拌，以TCL监测反应，至乙酰氧基完全水解，减压浓缩至干。TCL监测反应采用的展开剂为3∶7的乙酸乙酯∶正己烷，完全水解后Rf＝0，再用甲醇重结晶。步骤三还包括以TCL检测产物，展开为单点，所用的展开剂为4∶1的乙酸乙酯∶甲醇。所得样品经NMR和元素分析，确定其结构为2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷，其纯度可达99％。
步骤四为取适量缓冲液固体、2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷和还原型谷胱甘肽混合制成粉剂；并以粉剂保存，测定时配制成一定体积的溶液。所述缓冲液固体可采用柠檬酸-柠檬酸氢盐、磷酸二氢盐-磷酸氢盐、酒石酸-酒石酸氢盐等。
测定条件为反应检测波长为2-氯-4-硝基苯酚的最大吸收波长402nm；反应最适pH条件为6.80；最合适酶的反应温度为37℃，最合适缓冲液的浓度是100mmol/L(过高对酶有抑制作用，过低则缓冲容量不够)；底物2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的浓度20.7mmol/L；加适量的还原型谷胱甘肽以消除某些金属离子对酶的抑制作用；其线性范围至少达到70IU/L，反应时间经时反应曲线表明至少10min内，反应时间与ΔA呈比例。
配制试剂盒，可取配制体积为100ml、浓度为100mmol/L、pH值为6.80的缓冲液所需的固体，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷0.70g，和还原型谷胱甘肽3.0mg制成试剂粉剂。试剂粉剂室温下存放期至少半年，建议低温保存。
对本发明进行如下测定试剂配制，将粉剂溶于水，定容100.0ml，将试剂溶液在4℃下可保存两周；对精浆预处理，采集精液，37℃下放置30min，在2000转/min转速下离心12min，取出精浆，其保存条件为-20℃，忌反复冻融；取试剂溶液1.5ml，精浆50ul，37℃下反应，用自动生化分析仪根据溶液吸光度的变化来测定α-葡萄糖苷酶的活性。测定结果以标准α-葡萄糖苷酶校正，酶单位(IU/L)为每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶的量，其正常参考范围为41.1±20.3IU/L。试剂盒批内变异＜3.5％，批间变异＜5.0％。
下面举一具体的实施例(一)α-葡萄糖苷酶反应底物的制备步骤一制备五乙酰氧基葡萄糖苷。取无水葡萄糖20g、乙酸酐150ml、无水乙酸钠10g加入500ml的圆底烧瓶中，搅拌、加热，待固体完全溶解后升温至95℃，搅拌4hr；再将反应液倒入冰水中，充分搅拌，滴加浓NaOH溶液调节溶液至中性，静置过夜。将固体滤出，用红外灯烘干，得到白色粉末38.4g，产率为88.6％，TCL检测为单点，所用展开剂为3∶7的乙酸乙酯∶正己烷，显色剂为5％的硫酸乙醇液。
步骤二采用步骤一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷。取五乙酰氧基葡萄糖苷20g、2-氯-4-硝基苯酚26g和经灼烧的氯化锌4g，加入250ml圆底烧瓶中，油浴加热至130℃，搅拌45min，加入适量氯仿溶解，以0.5mol/L的NaOH洗涤三次，去除过量的2-氯-4-硝基苯酚，饱和NaCl溶液洗涤，分出氯仿层，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，残留物用无水乙醇重结晶，得白色2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷固体16.7g，产率为64.9％。TCL检测为单点；所用展开剂为4∶1的乙酸乙酯∶正己烷，显色剂为5％的硫酸乙醇液。
步骤三采用步骤二得到的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷。取2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷10g溶于200ml甲醇和50ml的1.0mol/L甲醇钠甲醇溶液中，搅拌，以TCL监测反应(展开剂为3∶7的乙酸乙酯∶正己烷，完全水解后Rf＝0)，直至水解完全；减压浓缩至干，得到初成品。经TCL检测为单点，所用展开剂为4∶1的乙酸乙酯∶甲醇。用甲醇进行重结晶，得产物白色2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷晶体4.8g，产率为71.1％。将该样品作NMR和元素分析，确定为2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷，其纯度达99.0％。
(二)配制α-葡萄糖苷酶反应试剂先配制试剂粉剂，取1.35g的KH2PO4和1.41g的Na2HPO4作为缓冲液固体，0.70g的2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷和3.0mg的还原型谷胱甘肽混合制成粉剂。再将此粉剂溶于水，定容100.0ml，配制成试剂溶液。
(三)糖苷酶活性的测定按测定方法测定精浆中α-葡萄糖苷酶的活性，结果为1、有正常生育能力的男性(经精液检查各项指针均在正常范围内，且近期已生育者)，取其精液按分析方法测定α-葡萄糖苷酶活性，结果为39.8IU/L；2、附睾原因不育患者，取其精液按分析方法测定α-葡萄糖苷酶的活性，结果为18.7IU/L。
本发明在底物2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的合成反应中，葡萄糖分子中的羟基经乙酰化保护后，再催化成苷，可使糖部分脂溶性增加而加快成苷反应的速率，并减少低聚糖副产物的生成，从而提高产率。通过优化反应条件，可提高α-构型产物的选择性。采取中间产物、产物两步结晶提纯，可得到高纯度α-构型糖苷。制备步骤简单，所用的试剂均为一般的试剂，成本较低，使得采用本发明制成的α-葡萄糖苷酶试剂盒的开发推广成为可能。
而且，选择2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷作为酶活力检测底物，性能更为优良经α-1，4-葡萄糖苷酶水解释放色原2-氯-4-硝基-苯酚，其pKa值为5.50，在中性α-葡萄糖苷酶最适合的pH条件下已能呈色，因而，水解反应中可直接采用速率法分析。本发明α-葡萄糖苷酶试剂的制备方法更适合于自动化分析，且缩短了反应时间，无需对照试验，减少了试剂的用量，从而可降低试剂盒的成本，应用前景较好。
另外，应用本发明后，可根据2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷与α-葡萄糖苷酶作用的性质建立分析方法，并建立正常参考值范围。
所得试剂盒批内变异＜3.5％，批间变异＜5.0％，符合临床检验要求。而且，更适合仪器自动化分析，测定结果更具有可比性和临床参考意义。
权利要求
1.一种用于男性不育症检测方法的检测试剂由以下步骤制备得到步骤一制备五乙酰氧基葡萄糖苷；步骤二采用步骤一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷；步骤三采用步骤二得到的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于步骤一包括葡萄糖与乙酸酐、无乙酸钠混合加热反应、加入碱液调节pH值呈中性，得到五乙酰氧基葡萄糖苷固体。
3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于步骤一包括葡萄糖与乙酰氯、硫酸混合加热反应、加入碱液调节pH值呈中性，得到五乙酰氧基葡萄糖苷固体。
4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于步骤二包括取五乙酰氧基葡萄糖苷、2-氯-4-硝基苯酚、氯化锌混合，油浴加热、搅拌。
5.如权利要求4所述所述的检测试剂，其特征在于2-氯-4-硝基苯酚与五乙酰氧基葡萄糖苷的投料比为3∶1，氯化锌与五乙酰氧基葡萄糖苷的投料比约为0.59∶1，反应温度可升至125-135℃。
6.如权利要求4或5所述的检测试剂，其特征在于步骤二还包括将反应物以氯仿提�。眉钜合慈ス康�2-氯-4-硝基苯酚，用无水硫酸钠干燥浓缩，用无水乙醇结晶得到颗粒状的2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体。
7.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于步骤三包括将2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷晶体溶于甲醇，加入甲醇钠甲醇溶液，以TCL监测反应。
8.如权利要求7所述的检测试剂，其特征在于TCL监测反应采用的展开剂为3∶7的乙酸乙酯∶正己烷。
9.一种用于男性不育症检测方法的检测试剂粉剂，其特征在于权利要求1所述的检测试剂与缓冲液固体、还原型谷胱甘肽混合制成粉剂。
10.如权利要求9所述的检测试剂，其特征在于所述缓冲液固体选自柠檬酸-柠檬酸氢盐、磷酸二氢盐-磷酸氢盐、酒石酸-酒石酸氢盐。
11.如权利要求9所述的检测试剂，其特征在于缓冲液100ml浓度为100mmol/L、pH值为6.80，2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷为0.49-0.88g，还原型谷胱甘肽为1.0-3.0mg。
全文摘要
本发明关于一种用于男性不育症检测方法的检测试剂，该检测试剂由以下步骤制备得到步骤一制备五乙酰氧基葡萄糖苷；步骤二采用步骤一得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2－氯－4－硝基苯基－α－四乙酰氧基葡萄糖苷；步骤三采用步骤二得到的2－氯－4－硝基苯基－α－四乙酰氧基葡萄糖苷制备2－氯－4－硝基苯基－α－D－葡萄糖苷。该检测试剂用于男性不育症，特别是生精障碍与输精障碍不育症鉴别的检测方法中，以适应仪器自动化分析。
文档编号G01N21/31GK1699969SQ20051007842
公开日2005年11月23日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年7月4日
发明者徐汝明, 张建华, 陆阳 申请人:上海第二医科大学
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