专利名称：一种分子生物传感器及其对dna或蛋白质进行单分子检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速高灵敏分子生物传感器及其对DNA或蛋白质进行直接、实时单分子检测的方法。
背景技术：
建立一种在单分子水平上直接进行生物和化学活性检测的实用平台是工业和科研领域共同关注的目标之一，因为这对于环境监测、工业质量控制以及临床诊断等一系列的应用都具有重要意义。为了能够可信地检测DNA-蛋白质的相互作用，目前已经发展了多种直接以及标记的技术如酶联免疫吸附试验、表面等离子共振、电化学、扫描探针显微镜、纳米粒子、微悬臂梁、碳纳米管、阻抗、纳米线等。但是很多现有的方法难以进行实时检测或者动力学的分析，一些方法面临很高的技术要求，一些则缺乏高的灵敏度以及选择性。因此需要进行策略优化，设计并且建立一种对于单个结合事件能够进行快速实时检测，同时兼具灵敏度、选择性、可逆性特征的方法体系。(l:Sander，C. et al. Science, 2000，287，1977. 2 :Liu，J.，Cao, Ζ.，Lu, Y. Chem. Rev.，2009，109，1948. 3 =Drummond, Τ. G.， Hill, Μ. G. ， Barton, J. K. Nat. Biotechnol. ,2003,21,1192. 4 =Patolsky, F. ， Zheng, G.， Lieber, C. Μ. Nat. Protoc. , 2006,1,1711. 5 :Fang, X. H. , Tan, W. H. Accounts of Chemical Research,2010,43,48. 6 :Nam, J. -Μ. , Thaxton, C.S., Mirkin, C.A. Science,2003,301, 1884. 7 Zheng, G. ,Patolsky,F. ，Cui，Y. , Wang, W. U. , Lieber, C. M. Nat. Biotechnol. 2005, 23，1294.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高灵敏基于核酸适体的分子生物传感器及其制备方法。本发明所提供的基于核酸适体的分子生物传感器，包括a)至少一个单壁碳纳米管晶体管器件，每个所述单壁碳纳米管晶体管器件包括栅极、源极、漏极和导电沟道；所述导电沟道为单壁碳纳米管，所述源极和漏极位于所述单壁碳纳米管上；其中，所述单壁碳纳米管被切割为两段，形成长度为I-IOnm间隙的两段单壁碳纳米管；b)经末端氨基修饰的核酸适体，其通过酰胺键与形成所述间隙的碳纳米管的两端连接；所述核酸适体能够特异性识别待测分子。其中，所述栅极为含有厚度为IOO-IOOOnm 二氧化硅层的硅基底，其电阻率为 5-20ohm · cnf1 ；所述源极和漏极均由Cr电极层和设于所述Cr电极层上的Au电极层组成， 所述Cr电极层厚度为3-lOnm，所述Au电极层厚度为40-100nm ；所述源极和漏极之间的距离为5-30 μ m ；所述单壁碳纳米管的直径为l-3nm。上述单壁碳纳米管晶体管器件既可以是底栅结构也可以是顶栅结构，但是由于底CN 102375007 A
说明书
2/10 页 栅结构的制备工艺相对简单方便优先选用。制备上述基于核酸适体的生物传感器的方法，包括下述步骤1)构建单壁碳纳米管晶体管器件；2)对步骤1)得到的单壁碳纳米管晶体管器件中的单壁碳纳米管依次进行电子束刻蚀、氧化切割，在所述单壁碳纳米管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙；3)将步骤2、得到的具有纳米间隙的单壁碳纳米管末端羧基进行活化，然后将经活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的核酸适体在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到所述基于核酸适体的生物传感器。上述步骤1)中单壁碳纳米管晶体管器件可按照常规方法进行构建，具体方法如下在含有厚度为IOO-IOOOnm 二氧化硅层的高导性硅芯片(基底电阻率为5-20ohm ·cnT1) 基底表面，采用化学气相沉积法制备单壁碳纳米管阵列，得到的单壁碳纳米管的长度为 30-10000 μ m ；在所述单壁碳纳米管阵列上间隔5-30 μ m蒸镀漏极和源极；所述漏极和源极的制备方法为在单壁碳纳米管上依次蒸镀厚度为3-lOnm的Cr电极层、厚度为40-100nm 的Au电极层。步骤幻中对具有纳米间隙的单壁碳纳米管末端羧基进行活化的方法为将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS，EDCI)的IO-IOOmM MES缓冲溶液中浸泡8-12小时；所述MES缓冲溶液的pH值为3_10，所述MES缓冲溶液中 Sulfo-NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的浓度为5-15mM，EDCI (1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐)的浓度为3-10mM;步骤3)中所述PBS缓冲液的浓度为lO-lOOmM，pH 值为6-8。步骤2)中电子束刻蚀和氧化切割得到的纳米间隙(I-IOnm)由于太小以至于不能通过SEM进行表征，但是能够使用AFM进行直接、局域的成像表征。对本发明制备的基于核酸适体的生物传感器进行电学信号监测，结果表明碳纳米管的最初的半导体或者金属的性质在连接核酸适体后得以保留。另外，可将上述基于核酸适体的生物传感器在不同的缓冲溶液中进行处理，然后进行电学性质监测，排除连接过程中离子参与导电的干扰。本发明还提供了上述基于核酸适体的生物传感器在检测DNA或蛋白质中的应用。利用基于核酸适体的生物传感器对DNA或蛋白质进行单分子检测的方法如下1)对本发明制备的基于核酸适体的生物传感器进行DNA或蛋白质结合与识别的电学信号检测，同时进行对照实验设计排除干扰因素；2)对本发明制备的基于核酸适体的生物传感器进行DNA或蛋白质检测的选择性、 灵敏度以及可逆性的测试；3)根据步骤1)和幻的实验结果确定检测条件，在微流控SWNT晶体管生物传感器阵列上实现生物相互作用的实时检测。上述1)- 各步骤的确定均使用探针台对于器件的电学信号进行监测，在常温常压下测量数据结果。当用本发明的生物传感器检测Thrombin时，所用的核酸适体为 H2N- (CH2) 6-5 ‘ -TTTTTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' -(CH2)6-NH2GSSApt-A, 其核苷酸序列如序列1所示)。
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当用本发明的生物传感器检测免疫球蛋白E(IgE)时，所用的核酸适体为H2N_(CH 2) 6-5 ‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-B,其核苷酸序列如序列3所示)。当用本发明的生物传感器检测血管内皮生长因子(VEGF)时，所用的核算适体为吐 N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCAGUUUGAGAAGUCGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列 4 所示)在上述检测方法中，步骤1)是该方法的关键步骤，具体的结合过程是将待测的 DNA或蛋白质的溶液的液滴覆盖在所述生物传感器表面10-60min，为达到器件最大的响应性质，溶液需确定在最佳的PH值，核酸适体-蛋白质发生相互作用之后，用缓冲溶液(可以是PBS缓冲溶液或者Tris-HCl的溶液)冲洗干净，氮气吹干后进行电学信号的测量，通过电信号的变化实现对DNA或蛋白质的检测。对器件的电学信号进行监测后，能够观察到器件导电性质明显增强，为验证实验结果的可信性，对不同的连接器件在相同实验条件下进行重复性实验，结果表明上述实验现象具有一致性特征。步骤1)中观察到的导电性的明显变化来源于共价连接在电路中的局域化的单个 DNA或RNA探针分子，而不是源自肖特基势垒的改变或表面的非特异性吸附过程。为排除潜在的假相，本发明在相同的处理条件下进行了两种类型的对照实验。在第一类对照实验中发明人对原生的碳管按照上述结合过程(即按照具有纳米间隙的单壁碳纳米管与核酸适体的结合过程)在相同条件下进行处理，进行电学性质的测量。经过蛋白质处理的结合过程之后，所有的SWNT器件都显示出电阻轻微增加的趋势，与之前文献报道的在未经切割的、表面功能化修饰DNA分子的SWNT的器件表面吸附蛋白质分子将引起器件电流减弱的现象一致。该现象与上述基于核酸适体的生物传感器观察的实验结果相反。第二类的对照实验中，发明人对于在氧气等离子体处理阶段没有完全切断的部分切割的SWNT器件进行了相同的处理，依然观察到的是与第一类对照实验类似但与所述基于核酸适体生物传感器变化趋势相反的电流变化结果。步骤2)为验证基于核酸适体的生物传感器的选择性，发明人设计了 2类重要的结合实验。其一是对于功能化的器件实施相同的实验处理，但是用另外一种非特异性结合的蛋白质取代特异性结合的蛋白质，处理过程导致器件电阻明显增加，待除去非特异性结合的蛋白质之后，用特异性结合的蛋白质进一步处理器件会观察到与工作器件电阻减小相同的现象，这可以很好的验证该方法具有很好的选择性。其二是将连接对照DNA分子的器件用于蛋白质相互作用的检测，对照DNA与待检测的蛋白质不存在相互作用，未发生工作器件的电阻变化，而是显示出类似SWNT表面非特异性吸附蛋白质引起电阻增加的结果。步骤幻中是通过改变蛋白质的浓度来研究连接器件的灵敏度。多个基于核酸适体的生物传感器用来检测不同浓度的蛋白质。在蛋白质溶液处理前后，通过电学测量的I-V 曲线监测结合过程，在不同的检测浓度下可以得到不同器件之间一致的实验结果，再次证明本发明具有好的可信性与重现性。使用本发明基于核酸适体的生物传感器进行的单分子器件的生物检测与之前检测蛋白质的方法相比，具有更高的检测灵敏度，目前使用aptamer 和Thrombin的模型体系的检测灵敏度已经达到2. 6aM。而其他方法的检测限分别是酶联免疫吸附试验( 3pg/mL)，表面等离子共振( 10-100pg/mL)、微悬臂梁( 0. 2ng/mL)、 碳纳米管( IpM)、纳米线阵列( 0. 9pg/mL)等。最近有文献报道(Nam,J. -Μ. ,Thaxton,C. S.，Mirkin, C. A. Science, 2003, 301,1884.)使用磁性和金纳米粒子得到蛋白质的检测灵敏度30aM与本发明生物传感器灵敏度结果相近，但是该方法需要标记以及多步的化学以及生物处理。由于本发明提供的生物传感器中只含有1个至多2个的蛋白质结合位点， 本发明具有检测DNA-蛋白质相互作用的单分子灵敏度(具体见实例一所述)。步骤2、中选择性和灵敏度检测方法建立之后，本发明将研究器件响应的可逆性。 可逆性的实验可以根据DNA(或RNA)-蛋白质相互作用的作用力的类型以及作用力的大小选择最佳的测试方法和条件，如蛋白质溶液的PH值等因素。连接器件在蛋白质作用之后经过处理可以回到初始状态，实现多次可逆的循环检测。以上各步骤的实验结果为实时的生物检测奠定了实验基础。步骤3)中的实时检测是本发明的核心之处。为了能够更方便的进行实时检测操作，本发明还提供了一种结合微流控技术制备 SffNT晶体管生物传感器阵列的方法。该方法是将上述生物传感器制备成SWNT晶体管生物传感器阵列并引入微流道组件得到的。具体制备方法如下通过两次光刻的方法发明人设计并制备了含有若干个(对阵列的个数没有具体要求，为保证成功率，优选至少50个)单独的SWNT晶体管的重复模型 (以制备79个单独的SWNT晶体管为例，见图5a)。该方法需要生长高密度的、电学性质良好的超长SWNT阵列。第一步光刻是在含有SWNT阵列的硅基底上形成毫米尺寸的电极图形，显影后蒸镀金属电极(Cr/Au电极层)。为了消除肖特基势垒改变以及蛋白质在金属电极表面的非特异性结合的可能性，通过电子束热蒸镀的方法在金属电极表面沉积50-100nm 的二氧化硅钝化电极。紧接着使用第二次的光刻保护SWNTs器件的中心区域电极，其余部分用氧等离子体刻蚀除去(见图5b)。制得的器件可以通过SEM的手段进行表征，图如显示的是一根碳管完全穿过电极的SEM照片，按照之前所述的单分子器件的制备步骤(步骤 2)和步骤幻，能够在每片的79个单独的SWNT晶体管中平均得到2个工作器件。结合微流控技术，便可以实时检测DNA-蛋白质的相互作用，图5c是本发明大量制备的器件的照片， 5d显示的是微流控测试过程中PDMS覆盖在中心电极的微流沟道示意图。实时检测的操作过程中，根据步骤2)的实验结果选择合适的测量条件，首先使用缓冲溶液对器件进行稳定，然后向上述微流控SWNT晶体管生物传感器阵列中注入待检测的蛋白质溶液。在实时检测过程中，器件在不同浓度蛋白质溶液的刺激下可以实现良好的电流变化的可逆性，同时使用对照蛋白质进行刺激未观察到电流的明显变化；对照DNA分子链的连接器件在实时测量的条件下当待测蛋白质溶液通过时，电流波动可以忽略。值得强调的一点是，同一器件在不同浓度蛋白质溶液通过时表现出的可逆的电流变化的数值几乎一致，使该发明有别于之前关于碳管和纳米线在检测蛋白质时观察到的变化范围与浓度有依赖关系的研究报道，成为一种独特的研究平台方法。实时检测中缺乏浓度依赖性的事实证明这些器件是在单分子水平上进行的DNA-蛋白质相互作用的检测。本发明是将分子电子学与生物体系相结合，利用功能化的单分子器件通过电学信号测量实现对DNA或者蛋白质的活性进行直接的、实时的、具有专一选择性与超高灵敏度检测的可靠、实用的普适性方法。由于本方明技术上的独特之处，必将拥有广阔的应用前景。可以根据特定目的可控地进行单分子连接与功能化，在单分子水平上实现特定的生物活性。这些性质有助于本发明提供的基于核酸适体的生物传感器从事于临床中生物活体组织的问题研究以及检测环境中痕量的特定化学或者生物有害物质。由于单分子器件的可靠性与重现性，可以在硅基底上将不同的器件集成，与目前的CMOS技术具有良好的相容性， 可以构建对药物开发或者其他检测适用的低噪声、灵活性强的实时检测阵列。这种快速响应、稳定、直接、灵活、同时具有超高灵敏度与选择性的响应器件的制备，证明本发明可以成为从基因组学到蛋白质组学中获取信息的有力工具，成为发展更加准确的分子水平上临床及时诊断护理的新技术。本发明所提供的直接的、实时的单分子器件生物检测普适性方法具有以下优点1、本发明只需将DNA分子(或RNA分子)连接在碳纳米管的分子点电极之间得到功能化的单分子器件即可进行生物体系中相互作用的测量，在合适的条件下达到优良的检测结果，无需进行再次标记，是一种直接的测量手段；2、本发明使用的功能化单分子器件具有很好的稳定性，在检测DNA(或RNA)-蛋白质相互作用的过程中能够快速响应，通过电学信号的特征显示生物体系的识别与结合作用；3、本发明的检测方法利用的是功能化器件中的单分子位点进行相互作用的识别， 具有单分子水平检测的特征，因此与目前现有的方法相比，具有更高的检测灵敏度和选择性特征，控制合适的结合条件，可以实现器件的可逆性检测；4、本发明提供了一种利用单分子器件能够实时检测生物体系相互作用的方法，利用实际样品的检测，拓展了其应用领域，可以在液相条件下对样品进行检测，保持样品天然活性，加快了实际应用的步伐；5、本发明是一种普适性的方法，可以根据特定的目的构建功能化的单分子器件， 在适宜的条件下进行直接、实时、超高灵敏度与选择性的测量，可以用于环境监测、工业控制、临场诊断等不同的实际领域。
图1为本发明以aptamer-Thrombin体系为模型的器件检测示意图以及器件结构表征以及实施例1中各步骤的电学性质。图2为实施例1中单分子器件检测的性质图，包括选择性、灵敏度以及可逆性实验结果以及传输机制。图3为实施例1中连接Con-A的单分子器件的对照实验示意图。图4为实施例1进行实时检测时的器件结构表征以及实时检测结果。图5为实施例1中实时检测的器件设计以及各步骤的光学显微镜照片。图6为实施例2和实施例3中结合过程的电学性质图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明， 均可从商业途径获得。实施例中所涉及的DNA或RNA序列均由宝生物工程(大连)有限公司按照序列进行合成构建得到。实施例一单分子aptamer器件检测Thrombin的应用
1、制备单分子aptamer器件1)在含有厚度为300nm热氧化层二氧化硅的高导性硅芯片基底上(电阻率为 5-20ohm · cnT1)，使用化学气相沉积的方法生长高质量的超长的碳纳米管阵列，在一根单壁碳纳米管(长度为7000 μ m)上间隔约20微米依次蒸镀Cr (5nm)、Au (50nm)作为器件的源极和漏极，构建SWNT晶体管器件；2)将步骤1)得到的SWNT器件进行超精细的电子束刻蚀和氧化切割，在碳管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙，图1中b图显示的是器件的SEM以及AFM图片，图中碳管的直径 1. 2nm，纳米间隙的大小是 IOnm ；3)将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES缓冲溶液(pH值为4. 7，Sulfo-NHS的浓度为5mM，EDCI的浓度为IOmM) 中浸泡12小时，进行末端羧基活化；然后将经活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的， 浓度为10 μ M的DNA单分子链aptamer在PBS缓冲液(10mM，pH值为7. 2)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到连接aptamer的单分子器件。设计并使用了 2种不同的DNA单分子链，其序列如下DH2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (记为Apt-A，其核苷酸序列如序列1所示)，2) H2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TCC AM CCA ACC ACC ATT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (记为Con-A，其核苷酸序列如序列2所示)。其中Apt-A是一种中间含有15个碱基，在3'和5'进行T7修饰，与人的 α -thrombin作用时可以形成G4结构的单分子链；Con-A是中间含有15个碱基两端经过T7 修饰，不和α -thrombin有相互作用的对照单分子链。对Apt-A连接得到的器件在不同的缓冲溶液(PBS缓冲溶液pH 7. 2 ；Tris-HCl溶液，pH 8.3)中进行电学信号测量，均没有明显的变化，排除离子导电的影响；Apt-A本身可以形成G4结构，金属离子K+和Mg2+可以在室温下稳定其构象，由于用于连接反应的PBS溶液中含有12mM的K+，推测连接后G4结构已经形成，分别使用20mM的K+和Mg2+处理连接器件，未观察到明显变化，证实了推测的合理性。考虑到Apt-A形成G4后的大小( 2.8nm) 以及碳管的直径(< 3nm)，在连接器件中至多只含有1个的DNA分子。2、单分子aptamer器件检测Hirombin的应用1)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质Thrombin结合与识别的电学信号检测，在最适宜的结合条件PH 8. 3下，器件经过^OnM Thrombin的处理，电阻发生了一个数量级的明显减�。� 300ΜΩ降至 30ΜΩ的水平。图1中的Ic显示的是上述器件在各状态下的电学性质曲线，所有的工作器件均显示出一致的变化趋势。同时进行的对照实验结果证明了观察到的导电性的明显变化来源于共价连接在电路中的局域化的单个DNA探针分子，而不是源自肖特基势垒的改变和表面的非特异性吸附过程；2)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质检测的选择性、灵敏度以及可逆性的测试。器件选择性的测试其一是使用和Thrombin的等电点以及分子量类似的另一种丝氨酸蛋白质Elastase处理器件，观察到与非特异性表面吸附情形类似的器件电阻明显增加的现象，待除去Elastase之后，用Thrombin进一步处理器件则观察到相反的现象，图2中的a图显示的是这一过程的电学测量结果。器件选择性的测试其二是将连接对照DNA分子Con-A的器件用于Thrombin的检测，结果显示类似SWNT表面非特异性吸附的影响，如图3所示。根据Apt-A与Thrombin结合过程中的电流变化，推测在结合过程中，不仅不会破坏G4构象，反而使构象固定更加稳定，增强η电子的堆积，提高DNA分子的电荷传输。另一种可能则是G4构象中间稳定的鸟嘌呤为电荷传输提供了一条新的通道，但目前的实验结果不能区分这两种结果的影响，可能是两者的结合。图2中的b图显示的是这两种机制的示意图。对不同的DNA单分子器件使用一系列不同浓度的Thrombin进行处理(2. 6nM, 2. 6pM, 2. 6fM以及2. 6aM在Tris-HCl PH = 8. 3溶液中)，均显示出良好的重现性，在该体系下，本发明的检测灵敏度是2. 6aM。图 2的c-f显示的是这一过程的测量结果。经过多次尝试，发明人在pH 8. 3的条件下通过6M 盐酸胍对于结合后的器件进行处理，实现了器件的可逆性测量，得到了多次的循环测量结果，如图2的g和h所示。3)根据以上步骤的实验结果确定测量条件，在微流控SWNT晶体管生物传感器阵列上实现生物相互作用的实时检测。制备微流控SWNT晶体管生物传感器阵列具体制备方法如下1)在含有厚度为300nm热氧化层二氧化硅的高导性硅芯片基底上，使用化学气相沉积的方法生长高质量的超长的单壁碳纳米管(SWNT)的阵列；2)在含SWNT阵列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且电极之间依次间隔为20 μ m的电极图形，显影之后蒸镀金属电极(Cr/Au电极层)。为了消除肖特基势垒改变以及蛋白质在金属电极表面的非特异性结合的可能性，通过电子束热蒸镀的方法在金属电极表面沉积 50-100nm的二氧化硅钝化电极。3)紧接着使用第二次的光刻保护SWNTs器件的中心区域电极，其余部分用氧等离子体刻蚀除去(见图5b)。制得的器件可以通过SEM的手段进行表征，图如显示的是一根碳管完全穿过电极的SEM照片。4)将步骤3)得到的SWNT器件阵列进行超精细的电子束刻蚀和氧化切割，在碳管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙。5)将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES缓冲溶液(pH值为4. 7，Sulfo-NHS的浓度为5mM，EDCI的浓度为IOmM) 中浸泡12小时，进行末端羧基活化；然后将经活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的， 浓度为10 μ M的DNA单分子链aptamer (Apt-A)在PBS缓冲液(10mM，pH值为7. 2)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到连接aptamer的单分子器件阵列。在每片硅基底上的79 个单独的SWNT晶体管中平均得到2个工作器件。在上述单分子器件阵列中引入微流控组件，即得到微流控SWNT晶体管生物传感器阵列。结合微流控技术，便可以实时检测DNA-蛋白质的相互作用，图5c是本发明大量制备的器件的照片，5d显示的是微流控测试过程中 PDMS覆盖在中心电极的微流沟道示意图。实时检测时，首先用缓冲溶液(Tris-HCl的溶液)对微流控SWNT晶体管生物传感器阵列器件进行稳定，在pH 8. 3的条件下，通过微流道组件的入口注入Thrombin溶液，对不同浓度的Thrombin (从2. 6fM到2. 6pM到2. 6nM)实时测量，得到良好的可逆的电流变化结果。进一步使用Elastase (3. 4nM)处理该器件，未见明显的电流变化，实验结果中电流变化缺乏浓度依赖性的事实证明这些器件是在单分子水平上进行的DNA-蛋白质相互作用的检测。不同浓度下电流变化的微小差异可能源于随着蛋白质浓度增加带来的碳管表面的非特异性结合的增强以及/或者实时测量过程中器件性质的衰减。实时检测部分的结果在图 4b、c的各图中显示。实施例2、单分子aptamer器件检测免疫球蛋白E(IgE)的应用免疫球蛋白E是一类具有δ链的亲同种细胞抗体，是参与过敏性鼻炎、过敏性哮喘和湿疹等发病机制调节的主要抗体。对于IgE检测对研究过敏性疾病具有重要的意义。1、制备单分子aptamer器件1)在含有厚度为300nm热氧化层二氧化硅的高导性硅芯片基底上，使用化学气相沉积的方法生长高质量的超长的碳纳米管阵列，在一根单壁碳纳米管(长度为7000微米) 上间隔约20微米先后蒸镀Cr (5nm)、Au (50nm)作为器件的源极和漏极，构建SWNT晶体管器件；2)将步骤1)得到的SWNT器件进行超精细的电子束刻蚀和氧化切割，在碳管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙；3)将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES缓冲溶液(pH值为4. 7，Sulfo-NHS的浓度为5mM，EDCI的浓度为IOmM) 中浸泡12小时，进行末端羧基活化；然后将经活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的， 浓度为10 μ M的DNA单分子链aptamer在PBS缓冲液(10mM，pH值为7. 2)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到连接aptamer的单分子器件。设计并使用的核酸适体的序列如下H2N-(CH2) 6-5‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3‘ - (CH2) 6 -NH2(Apt-B，其核苷酸序列如序列3所示)。其中Apt-B是一种能够与免疫球蛋白E发生相互作用的核酸适体，在3'和5'进行氨基修饰。2、单分子aptamer器件检测免疫球蛋白E(IgE)的应用1)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质IgE结合与识别的电学信号检测，在最适宜的结合条件PH 7.4下，器件经过160碰IgE的处理，电阻发生了明显减小。 所有的工作器件均显示出一致的变化趋势，如图6a所示。同时进行的对照实验结果证明了观察到的导电性的明显变化来源于共价连接在电路中的局域化的单个DNA探针分子，而不是源自肖特基势垒的改变和表面的非特异性吸附过程。2)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质检测的选择性、灵敏度以及可逆性的测试。器件选择性的测试是使用与连接的核酸适体无相互作用的牛血清蛋白 (BSA)，实验结果显示的是与非特异性表面吸附类似的器件电阻明显增加的现象，待除去 BSA之后，用IgE进一步处理器件则观察到相反的现象。对不同的DNA单分子器件使用一系列不同浓度的IgE进行处理QnM，2pM以及2fM在PBS pH = 7. 4溶液中)，均显示出良好的重现性。经过多次尝试，发明人在PH 7. 4的条件下通过6M盐酸胍对于结合后的器件进行处理，也可以实现如实施例1中所示的器件的可逆性测量。3)根据以上步骤的实验结果确定测量条件，在微流控SWNT晶体管生物传感器阵列上实现生物相互作用的实时检测。
制备微流控SWNT晶体管生物传感器阵列的方法同实施例1，只需将核酸适体 Apt-A 替换为 Apt-B。实时检测时，首先用缓冲溶液对器件进行稳定，在pH 7.4的条件下，使用不同浓度的IgE(从2fM到2pM到2nM)实时测量，得到良好的可逆的电流变化结果。进一步使用 BSA(3nM)处理该器件，未见明显的电流变化，实验事实证明这些器件是在单分子水平上进行的DNA-蛋白质相互作用的检测。实施例3、单分子aptamer器件检测血管内皮生长因子(VEGF)的应用血管内皮生长因子是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，在肿瘤生长扩散过程中会直接影响VEGF的体内含量，对于VEGF的检测可以应用于癌症的诊断与治疗。1、制备单分子aptamer器件1)在含有厚度为300nm热氧化层二氧化硅的高导性硅芯片基底上，使用化学气相沉积的方法生长高质量的超长的碳纳米管的阵列，在一根单壁碳纳米管(长度为7000微米)上间隔约20微米先后蒸镀Cr (5nm)、Au (50nm)作为器件的源极和漏极，构建SWNT晶体管器件；2)将步骤1)得到的SWNT器件进行超精细的电子束刻蚀和氧化切割，在碳管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙，图1中b图显示的是器件的SEM以及AFM图片，图中碳管的直径 1. 2nm，纳米间隙的大小是 IOnm ；3)将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有氨基耦合和活化试剂(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES缓冲溶液(pH值为4. 7，Sulfo-NHS的浓度为5mM，EDCI的浓度为IOmM) 中浸泡12小时，进行氨基活化；然后将经氨基活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的， 浓度为10 μ M的RNA单分子链aptamer在PBS缓冲液(10mM，pH值为7. 2)中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到连接aptamer的单分子器件。设计并使用的核酸适体的序列如下H2N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCA⑶UUGAGAA⑶CGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列4所示)。其中Apt-C是一种能够与血管内皮生长因子发生相互作用的核酸适体， 在3'和5'进行氨基修饰。2、单分子aptamer器件检测血管内皮生长因子(VEGF)的应用1)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质VEGF结合与识别的电学信号检测，在最适宜的结合条件PH 7.4下，器件经过104碰VEGF的处理，电阻发生了明显减小。所有的工作器件均显示出一致的变化趋势，如图6b所示。同时进行的对照实验结果证明了观察到的导电性的明显变化来源于共价连接在电路中的局域化的单个RNA探针分子， 而不是源自肖特基势垒的改变和表面的非特异性吸附过程。2)对制备得到的单分子aptamer连接器件进行蛋白质检测的灵敏度测试。对不同的RNA单分子器件使用一系列不同浓度的VEGF进行处理(1. 04nM, 104pM以及1. 04fM在 PBS pH = 7. 4溶液中)，均显示出良好的重现性。3)根据以上步骤的实验结果确定测量条件，在微流控SWNT晶体管生物传感器阵列上实现生物相互作用的实时检测。制备微流控SWNT晶体管生物传感器阵列的方法同实施例1，只需将核酸适体
12Apt-A替换为Apt-C。实时检测时，首先用缓冲溶液对器件进行稳定，在pH 7. 4的条件下， 使用2nM的VEGF进行实时测量，可以观察到器件明显的电流增加的变化趋势。
综上所述，本发明是一种实时的、直接的、具有良好选择性与单分子灵敏度的，能够可逆检测DNA-蛋白质相互作用的普适性方法，利用功能化的单分子器件可以根据特定检测目的，对实际样品进行不同体系、专一的选择性与超高灵敏度的实时检测具有广阔的实际应用价值。本发明所举实例不能概括生物体系中众多的相互作用，但是使用本发明所述的方法，经过合理的分子设计与修饰，均可在单分子器件上实现高灵敏度、高选择性的检测。值得一提的是，本发明在检测两种相互作用的物质基础上，还可以继续引入与第二种物质相互作用的其他物质，实现第三种物质的实时检测，如DNA-蛋白质-蛋白质体系(如 DNA-抗体-抗原)和DNA-蛋白质-小分子体系(如DNA-链霉亲和素-生物素)等。除了可用于蛋白质的检测，本发明还可以应用于检测和连接的单分子DNA有相互作用的DNA或者小分子。鉴于本发明广泛的普适性与应用性同时结合微流控的实时检测技术，使得本发明具有广阔的研究与应用的价值和意义。
权利要求
1.一种基于核酸适体的生物传感器，包括a)至少一个单壁碳纳米管晶体管器件，每个所述单壁碳纳米管晶体管器件包括栅极、 源极、漏极和导电沟道；所述导电沟道为单壁碳纳米管，所述源极和漏极位于所述单壁碳纳米管上；其中，所述单壁碳纳米管被切割为两段，形成长度为I-IOnm间隙的两段单壁碳纳米管；b)经末端氨基修饰的核酸适体，其通过酰胺键与形成所述间隙的碳纳米管的两端连接；所述核酸适体能够特异性识别待测分子。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于所述栅极为含有厚度为 IOO-IOOOnm二氧化硅层的硅基底，其电阻率为δΙΟοΙιπ ΜπΓ1 ；所述源极和漏极均由Cr电极层和设于所述Cr电极层上的Au电极层组成，所述Cr电极层厚度为3-lOnm，所述Au电极层厚度为40-100nm ；所述源极和漏极之间的距离为5_30 μ m ；所述单壁碳纳米管的直径为 l-3nm。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于所述基于核酸适体的生物传感器包括至少50个所述单壁碳纳米管晶体管器件；所述基于核酸适体的生物传感器还包括微流道组件，所述微流道组件至少包括样品进口和样品出口的相互连通的分流式微流道。
4.制备权利要求1所述的基于核酸适体的生物传感器的方法，包括下述步骤1)构建单壁碳纳米管晶体管器件；2)对步骤1)得到的单壁碳纳米管晶体管器件中的单壁碳纳米管依次进行电子束刻蚀和氧化切割，在所述单壁碳纳米管之间得到长度为I-IOnm的间隙；3)将步骤幻得到的具有纳米间隙的单壁碳纳米管末端羧基进行活化，然后将活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的核酸适体在磷酸盐缓冲液中进行纳米间隙中的单分子共价连接，得到所述基于核酸适体的生物传感器。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤3)中对具有间隙的单壁碳纳米管末端羧基进行活化的方法为将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有Sulfo-NHS和EDCI的 IO-IOOmM MES缓冲溶液中浸泡8_12小时；所述MES缓冲溶液的pH值为3_10，所述MES缓冲溶液中Sulfo-NHS的浓度为5-15mM，EDCI的浓度为3_10mM ；步骤3)中所述PBS缓冲液的浓度为lO-lOOmM，pH值为6_8。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤1)中构建单壁碳纳米管晶体管器件的方法为在含有厚度为IOO-IOOOnm 二氧化硅层的硅片表面，采用化学气相沉积法制备单壁碳纳米管阵列，所述硅芯片电阻率为5-20ohm · cnT1，所述单壁碳纳米管的长度为 30-10000 μ m ；在所述单壁碳纳米管阵列上间隔5-30 μ m蒸镀漏极和源极；所述漏极和源极的制备方法为在单壁碳纳米管上依次蒸镀厚度为3-lOnm的Cr电极层、厚度为40-100nm 的Au电极层。
7.制备权利要求3所述的生物传感器的方法，包括下述步骤1)在含有厚度为IOO-IOOOnm二氧化硅层的硅片表面，采用化学气相沉积法制备单壁碳纳米管阵列，所述硅片电阻率为5-20ohm · cnT1 ；2)在步骤1)制备的含单壁碳纳米管阵列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且电极之间依次间隔为5-30 μ m的电极图形，显影后依次蒸镀厚度为3-lOnm的Cr电极层和厚度为40-100nm的Au电极层；再通过电子束热蒸镀的方法在Au电极表面沉积50-100nm的二氧化硅钝化电极；3)采用光刻法保护步骤幻得到的器件的中心区域电极，其余部分用氧等离子体刻蚀除去，得到单壁碳纳米管晶体管阵列器件；4)对步骤幻得到的单壁碳纳米管晶体管阵列器件中的单壁碳纳米管依次进行电子束刻蚀和氧化切割，在所述单壁碳纳米管之间得到I-IOnm间隔的纳米间隙；5)将步骤4)得到的具有纳米间隙的单壁碳纳米管进行氨基活化，然后将经氨基活化的单壁碳纳米管与经末端氨基修饰的核酸适体在PBS缓冲液中进行纳米间隙中的单分子共价连接，然后引入微流道组件，得到所述基于核酸适体的生物传感器。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤5)中对具有纳米间隙的单壁碳纳米管末端羧基进行活化的方法为将具有纳米间隙的单壁碳纳米管在含有Sulfo-NHS和EDCI 的IO-IOOmM MES缓冲溶液中浸泡8_12小时；所述MES缓冲溶液的pH值为3_10，所述MES 缓冲溶液中Sulfo-NHS的浓度为5-15mM，EDCI的浓度为3_10mM ；步骤3)中所述PBS缓冲液的浓度为lO-lOOmM，pH值为6_8。
9.权利要求1-3中任一所述的生物传感器在对DNA或蛋白质进行单分子检测中的应用。
10.一种对DNA或蛋白质进行单分子检测的方法，包括下述步骤1)对权利要求1或2所述基于核酸适体的生物传感器进行DNA或蛋白质结合与识别的电学信号检测，确定检测的PH值；2)对权利要求1或2所述基于核酸适体的生物传感器进行DNA或蛋白质检测的选择性、灵敏度以及可逆性的测试；3)根据步骤1)和2、的实验结果确定检测条件，向权利要求3所述生物传感器中注入待检测的DNA或蛋白质溶液，测量检测过程中生物传感器的电流变化，基于电流的变化实现对DNA或蛋白质的实时检测。
全文摘要
本发明公开了一种快速高灵敏分子生物传感器及其对DNA或蛋白质进行单分子检测的方法。本发明所提供的的生物传感器，包括a)至少一个单壁碳纳米管晶体管器件，所述单壁碳纳米管晶体管器件包括栅极、源极、漏极和导电沟道；所述导电沟道为单壁碳纳米管，该单壁碳纳米管被切割为两段，形成长度为1-10nm间隙的两段单壁碳纳米管；b)经末端氨基修饰的核酸适体，其通过酰胺键与形成所述间隙的碳纳米管两端连接。本发明是将纳米/分子电子学与生物体系相结合，利用功能化的单分子器件通过电学信号测量实现对DNA或者蛋白质的活性进行直接的、实时的、具有专一选择性与超高灵敏度检测的可靠、实用的普适性方法。
文档编号G01N27/26GK102375007SQ201010253888
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者刘松, 郭雪峰 申请人:北京大学
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