专利名称：高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法
技术领域：
本发明涉及高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。
背景技术：
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株，该菌是美国FDA认证的食品安全级的工业生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，得到国际著名酶制剂公司(如Genencor、Novozymes等)高度重视,并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶试剂的表达和生产。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟，发酵成本较低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展以及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉表达异源蛋白也越来越受到重视。值得指出的是外源DNA片段多以非同源末端连接的途径NHEJ (nonhomologousend-joining)整合入宿主基因组，呈随机插入的形式。异源蛋白的表达框在基因组中的不同位置会直接影响到其表达水平。例如，若外源基因插入了沉默子的调控区可能直接导致其不能转录而表达失败，如果外源基因插入增强子的可调控区域也可能使其表达量有大幅度的提高。另一个方面，外源基因进入基因组后，其在基因组中的拷贝数也是随机的，而拷贝数本身也是影响表达量的一个重要因素。由于里氏木霉基因组信息的不完善以及其同源重组率的局限性，很难确定基因组中具体哪一个位置更有利于基因的表达，同时，对所有转化子进行拷贝数鉴定本身也是十分繁琐的工作。随着里氏木霉遗传操作体系的不断优化，其转化效率已经可以基本满足人们的需要，但当得到大量的转化子，如何筛选目的蛋白高效表达的转化子成了问题的关键。对于重组蛋白的异源表达，传统的筛选手段只能是挑取大量的转化子进行发酵后，对目的蛋白进行活性测定等方法进行筛�。庋姆椒ū冉戏彼觯韬姆汛罅康娜肆ξ锪Γ掖拥玫阶拥缴秆〉礁咝П泶锏木曛芷谝脖冉铣�。更重要的是，随着转化效率的不断提高，用传统的方法很难对所有的转化子进行鉴定，这样很容易把一些真正的高表达菌株遗漏掉。这就需要建立一种高通量的筛选方法。流式细胞仪技术(flow cytometry)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞仪将流体喷射技术、激光技术、空气技术、Y射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器，通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。2003年BD公司推出了世界上首款台式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪FACS Aria，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞，其分选准确度高，速度快，可达到70000个/S。由于分选时间短，使分选到的细胞活性良好，并且它可以将细胞分选至流式细胞管、培养皿、细胞培养板(6孔板、24孔板及96孔板)，以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养。目前，流式细胞仪分选技术已广泛应用于医学研究，但其在丝状真菌领域的应用较少。目前，国内外尚没有利用流式细胞仪分选技术高通量筛选高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌的报道。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种鉴定或辅助鉴定高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤I)将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5'端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽
2A ；2)制备融合基因表达盒和筛选标记基因表达盒以及含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体；3)用含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并将所有转化子制备成原生质体，收集所述转化子的原生质体细胞；4)用流式细胞仪对步骤3)的所述原生质体进行分�。泻焐獾乃鲎游泶锿庠吹鞍椎闹刈槔锸夏久够蚝蜓”泶锿庠吹鞍椎闹刈槔锸夏久梗藓焐獾乃鲎游潜泶锿庠吹鞍椎闹刈槔锸夏久够蚝蜓》潜泶锿庠吹鞍椎闹刈槔锸夏久埂Ｆ渲校泶锖惺前康幕�(所述融合基因或所述筛选标记基因)及其表达所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达目的基因。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与目的基因的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导目的基因表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于目的基因的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。在这些例子中，应将目的基因的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于目的基因的适当位置，以使调控序列指导目的基因的表达。其中，2)中的含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体可以是一个重组表达载体也可以是两个重组表达载体，即所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒位于同一个重组表达载体中或所述融合基因表达盒位于一个重组表达载体中，所述筛选基因表达盒位于另一个重组表达载体中。上述所述筛选基因表达盒中的筛选标记基因是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。在本发明的实施例中，所述筛选标记基因为pyr4，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的基因。上述I)中的融合基因也属于本发明的保护范围。所述融合基因具体可为由红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述连接肽2A序列的核苷酸序列为序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。该连接肽2A序
列是根据里氏木霉密码子偏好性设计的。本申请的实验证明，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游的融合基因比所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的下游的融合基因的外源蛋白表达量高。在本发明的一个实施例中，所述融合基因中所述外源蛋白基因具体为脂肪酶基因；所述脂肪酶基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述红色荧光蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。所述融合基因的编码序列具体可为B1-B3中的任一种BI、序列表中序列7的第1-1596位(SL2AR基因的编码序列)；B2、序列表中序列7的第58位-1596位(L2AR基因的编码序列)；B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位(R2AL的编码序列)。本发明的实施例中，公开了两个融合基因表达盒。一个融合基因表达盒从上游至下游依次由CBHl基因启动子、CBHl基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽序列、红色荧光蛋白基因和CBHl基因终止子组成。其中，CBHl基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽序列和红色荧光蛋白基因组成融合基因SL2AR基因。SL2AR基因的编码序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位为CBHl基因信号肽的编码序列，52-57位为EcoRI识别序列，第58位-867位为脂肪酶的成熟蛋白编码序列，第868-918位为连接肽2A的编码序列，第919-1596位为红色荧光蛋白的编码序列。SL2AR基因编码序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位为CBHl基因信号肽，第20-531位为融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位为脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位为连接肽2A，第307-531位为红色荧光蛋白。CBHl基因启动子的序列是序列I的第1-1912位，CBHl基因终止子(Tcbhl)的序列如序列表中序列3所不。另一个融合基因表达盒从上游至下游依次由CBHl基因启动子、红色荧光蛋白基因、连接肽序列、脂肪酶信号肽序列、脂肪酶基因和CBHl基因终止子组成。其中，红色荧光蛋白基因、连接肽序列、脂肪酶信号肽序列和脂肪酶基因组成融合基因R2AL基因。R2AL基因的编码序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为带信号肽的脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。CBHl基因启动子的序列是序列表中的序列2，CBHl基因终止子(Tcbhl)的序列如序列表中序列3所示。上述鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法可用于筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉。本发明还提供了一种具体的筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。本发明所提供的筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤t匕较经上述任一种方法鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越闻。本发明的实验证明，融合基因中的连接肽2A序列可使红色荧光蛋白和目标外源蛋白这两个蛋白等量(I: I)表达并独立存在，具有信号肽的外源蛋白(脂肪酶)可以有效分泌到胞外，而缺乏信号肽的红色荧光蛋白留在胞内，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。本发明的实验证明红色荧光蛋白的荧光强度可以很好地表征外源蛋白的表达量，细胞内红色荧光蛋白的荧光强度和发酵液中外源蛋白的分泌量呈正相关。本发明还涉及下述任一种与上述融合基因相关的生物材料I)由上述融合基因转录得到的RNA分子；2)含有上述融合基因的重组载体、重组细胞或重组微生物；3)含有I)所述RNA分子的重组载体、重组细胞或重组微生物；4)由上述融合基因编码的蛋白质；所述蛋白质的氨基酸序列为A1-A4中的任一种Al、序列表中的序列8 (带脂肪酶信号肽的前体蛋白SL2AR序列)；A2、序列表中的序列8第20-531位(SL2AR的成熟蛋白L2AR序列)；A3、序列表中的序列6 (带脂肪酶信号肽的前体蛋白R2AL序列)A4、将序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列(将R2AL中的脂肪酶信号肽去掉得到的成熟蛋白)。在本发明的一个实施例中，含有上述融合基因的重组微生物具体为里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株号为TRl 124,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6384。本发明可用于筛选高效表达外源蛋白的里氏木霉工程菌，本发明筛选到的一株表达脂肪酶的里氏木霉工程菌-里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No. 6384其发酵上清液的脂肪酶酶活可达238IU/mL。菌种名称里氏木霉拉丁名Trichodermareesei菌株编号TRl124保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年7月20日保藏中心登记入 册编号CGMCC No. 638
图I为质粒pSKLR和pSKRL的结构示意2为原生质体的制备及红色突光蛋白的诱导表达不意图。图3为红色荧光蛋白和脂肪酶表达量的对应关系示意4为SDS-Page比较分析里氏木霉工程菌TRl 124、菌株TU6和NlO的发酵液上清。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。培养基、试剂I) 土豆培养基PDA (100ml) :20g去皮马铃薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，双层纱布过滤，加入2g葡萄糖和I. 8g琼脂粉，用水定容至lOOmL，115°C高压蒸气灭菌。2)基本培养基(Minimal medium, MM)组成溶剂为水,每升培养基中溶质及其质量为0. 05g (NH4)2SO4,0. 15g KH2PO4,0. 006g MgSO4,0. 006g CaCl2,0. 00005g FeSO4 ·7Η20，0. 000016g MnSO4 · H20,0. 000014g ZnSO4 · 7H20，0. 00002g CoCl203)发酵培养基在丽培养基中加入下列碳源(如1%纤维素、3%乳糖、1%木聚糖、2%葡萄糖、2%甘油，终浓度)之一，pH 5·2±0· I。Al、含I. OM山梨醇但不含尿苷的丽培养基平板(MM+山梨醇+2%葡萄糖):在ΜΜ+2%葡萄糖培养基中加入山梨醇至终浓度为I. 0Μ，再加入琼脂制成固体培养基。Α2、ΜΜ+0. l%Triton XlOO的平板在含有2%葡萄糖的MM中加入Triton XlOO至体积终浓度为O. 1%，再加入琼脂制成固体培养基。A3、含2%葡萄糖的丽液体培养基在丽中加入葡萄糖至终浓度为2% (质量百分浓度)得到的液体培养基。A4、MM+1%微晶纤维素液体培养基在MM中加入微晶纤维素至终浓度为1% (质量百分浓度)得到的液体培养基。4)LB培养基溶剂是水，每升培养基中溶质及其质量百分含量为1%蛋白胨，1%氯化钠，O. 5%酵母提取物。5)里氏木霉染色体DNA提取缓冲液Tris. Cl pH 8. 5 200mMEDTA pH 8. O25mMNaCl250mMSDS2%
6)原生质体制备及转化相关试剂O. 2M 磷酸缓冲液 ρΗ7· 4 (每 IOOmL)O. 2Μ Na2HPO48 ImLO. 2Μ NaH2PO419mLI. 2mol/L 的 MgSO4 溶液MgSO4I. 2M磷酸缓冲液pH 7. 4 IOmMO. 6M的山梨醇溶液山梨醇O. 6MTris. Cl pH 7. OO. OlMI. OM的山梨醇溶液山梨醇I. OMCaCl2O. OlMTris. Cl pH 7. 5O. OlMPEG 溶液PEG400050%CaCl2O. 05MTris. Cl pH 7. 5O. OlM实施例I、高产异源脂肪酶的重组里氏木霉菌株的筛选本实施例筛选到了两种转化子，分别是pSKLR转化子和pSKRL转化子。I、红色荧光蛋白与异源脂肪酶融合表达载体pSKLR和pSKRL的构建I) PCR扩增纤维二糖水解酶I (CBHl)基因启动子和信号肽片段PScbhl 以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株 QM9414 (ATCC 26921)基因组 DNA 为模板，Pcbhl-F，PScbhl-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为95 °C预变性5min，94 °C变性30s，61. 1°C退火30s，72。。延伸2min,30个循环；最后72°C扩展延伸lOmin，扩增得到是含有cbhl基因信号肽的启动子片段PScbhl。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带，连接至pEASY-Blunt simple载体,形成重组载体,转化大肠杆菌DH5 α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明PScbhl的序列如序列表中序列I所示，序列I的第1-1912位为CBHl基因启动子，第1913-1963位为CBHl基因信号肽序列。2) PCR扩增纤维二糖水解酶I (CBHl)基因启动子Pcbhl 以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，Pcbhl-F，Pcbhl-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环；最后72°C扩展延伸lOmin，扩增得到cbhl基因的启动子片段Pcbhl。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带,连接至pEASY-Blunt simple载体,形成重组载体，转化大肠杆菌DH5ci。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明Pcbhl的序列如序列表中序列2所示。3) PCR扩增纤维二糖水解酶I (CBH1)基因终止子Tcbhl以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因组DNA为模板，Tcbh I-F，Tcbhl-R为引物进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30 s，60°C退火30s，72°C延伸2. 5min,30个循环；最后72°C扩展延伸lOmin，扩增得到cbhl基因的终止子片段Tcbhl。琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收目的条带,连接至pEASY-Blunt simple载体，形成重组载体，转化大肠杆菌DH5 α。挑取转化子进行鉴定并抽提质粒，进行测序，结果表明Tcbhl的序列如序列表中序列3所示。4)重叠延伸PCR扩增红色荧光蛋白，2Α序列与脂肪酶基因的融合片段L2AR (月旨肪酶基因在上游，红色荧光蛋白基因在下游)。第一轮PCR :以黑曲霉总RNA反转录得到的cDNA为模板，Iipase2a-F, Iipase2a-R为引物扩增含有连接肽2A序列和部分红色荧光蛋白基因片段的脂肪酶基因片段。以质粒pDsRed-Monomer-Nl (Clontech Catalog#6921_l)为模板，2ared-F，2ared-R为引物扩增含有2A序列和部分脂肪酶基因片段的红色荧光蛋白基因。将这两个片段进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收试剂盒纯化。第二轮PCR:将胶回收纯化的两个PCR产物等摩尔混合作为模板，Iipase2a-F，2ared_R为引物进行Overlap PCR扩增即可得到两个基因融合的片段L2AR。将该片段克隆入pMDlSTsimple载体中进行测序。测序结果表明L2AR的核苷酸序列是序列表中序列4的第8-1547位，序列4的第8-818位为
脂肪酶基因，第819-869位为连接肽2A序列，第870-1547位为红色荧光蛋白基因。5)重叠延伸PCR扩增红色荧光蛋白，2A序列与脂肪酶基因的融合片段R2AL (红色荧光蛋白基因在上游，脂肪酶基因在下游)。第一轮PCR :以质粒pDsRed-Monomer-Nl为模板，2aRed-CF，2aRed-CR为引物扩增含有部分脂肪酶基因片段的红色荧光蛋白(RFP)基因片段。以黑曲霉总RNA反转录得到的cDNA为模板，2alp-cF，2alp-cR为引物扩增含有部分RFP基因片段的脂肪酶基因。将这两个片段进行琼脂糖凝胶电泳并胶回收试剂盒纯化。第二轮PCR:将胶回收纯化的两个PCR产物等摩尔混合作为模板，2aRed-CF，2alp-CR为引物进行PCR扩增即可得到两个基因融合的片段R2AL。将该片段克隆入PMD18-T simple载体中进行测序。测序结果表明R2AL的核苷酸序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。6)融合基因表达载体pSKRL和pSKLR的构建用限制性内切酶SalI和SpeI对质粒pBluescript SK(+)(Stratagene, Catalog#212205)进行双酶切，SalI，EcoRI 对 Pcbhl 片段和 PScbhl 进行双酶切消化，EcoRI，SpeI对片段R2AL和L2AR进行双酶切消化，分别将消化好的载体片段、Pcbhl片段、R2AL或载体片段、PScbhl片段、L2AR片段混合进行三片段连接，转化大肠杆菌，分别用引物2aRed-cF，2alp_cR和lipase2a_F，2ared_R引物对两种转化子进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的克隆抽提质粒命名为pPSKPRL和pPSKPLR。用限制性内切酶SpeI和NotI酶切消化终止子片段Tcbhl以及质粒载体pPSKPRL和pPSKPLR，并将酶切消化后的终止子片段分别与消化后的pPSKPRL和pPSKPLR进行连接，转化大肠杆菌，引物Tcbhl-F和Tcbhl-R对所得克隆进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的克隆抽提质粒即为融合表达载体PSKRL和pSKLR(结构见图I)。所用到的引物见表I。pSKLR的结构示意图如图I中A所示，含有的融合基因表达盒由CBHl基因启动子、CBHl基因信号肽序列、脂肪酶基因、连接肽基因、红色荧光蛋白基因和CBHl基因终止子组成。CBHl基因启动子、CBHl基因信号肽在图中以PScbhl表示，脂肪酶基因以lipase表示，连接肽基因以2A表示，红色荧光蛋白基因以DsRed表示，CBHl基因终止子以Tcbhl表示。pSKLR含有的将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因是SL2AR基因(脂肪酶基因在上游，红色荧光蛋白基因在下游)。SL2AR基因的编码序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位为CBHl基因信号肽的编码序列，52-57位为EcoRI识别序列，第58位-867位为脂肪酶的成熟蛋白编码序列，第868-918位为连接肽2A的编码序列，第919-1596位为红色荧光蛋白的编码序列。SL2AR基因编码序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位为CBHl基因信号肽，第20-531位为融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位为脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位为连接肽2A，第307-531位为红色荧光蛋白。pSKRL的结构示意图如图I中B所示，含有的融合基因表达盒由CBHl基因启动子、红色荧光蛋白基因、连接肽基因、脂肪酶基因和CBHl基因终止子组成。CBHl基因启动子在图中以Pcbhl表不，脂肪酶基因以lipase表不，连接妝基因以2A表不，红色突光蛋白基因
以DsRed表示，CBHl基因终止子以Tcbhl表示。pSKRL含有的将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因是R2AL基因(脂肪酶基因在下游，红色荧光蛋白基因在上游)。R2AL基因的编码序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位为红色荧光蛋白基因，第685-735位为连接肽2A序列，第736-1629位为带信号肽的脂肪酶基因，其中第736-816为脂肪酶自身信号肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL编码的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位为红色荧光蛋白序列，第226-242位为连接肽2A序列，第243-269为脂肪酶自身信号肽序列，第270-539位为脂肪酶的成熟蛋白序列。表I :用于构建重组载体的引物
权利要求
1.鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤 1)将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5'端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A ； 2)制备融合基因表达盒和筛选标记基因表达盒以及含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体； 3)用所述重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并制备成原生质体,收集所述转化子的原生质体细胞； 4)用流式细胞仪对步骤3)的所述原生质体细胞进行分选，有红色荧光的所述转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的所述转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述融合基因是权利要求6-8中任一所述的融合基因。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述融合基因表达盒由纤维二糖水解酶I基因的启动子、纤维二糖水解酶I基因终止子和位于二者之间的所述融合基因组成，所述纤维二糖水解酶I基因的启动子位于所述融合基因的上游。
4.权利要求1-3中任一所述的方法在筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉中的应用。
5.筛选高表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤比较经权利要求1-3中任一所述方法鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越闻。
6.融合基因，是由红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述连接肽2A序列的核苷酸序列为序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。
7.根据权利要求6所述的融合基因，其特征在于所述外源蛋白基因为脂肪酶基因；所述脂肪酶基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述红色荧光蛋白基因编码的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。
8.根据权利要求7所述的融合基因，其特征在于所述融合基因的编码序列为B1-B3中的任一种 BI、序列表中序列7的第1-1596位； B2、序列表中序列7的第58位-1596位； B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位。
9.下述任一种材料 O由权利要求6-8中任一所述的融合基因转录得到的RNA分子； 2)含有权利要求6-8中任一所述的融合基因的重组载体、重组细胞或重组微生物； 3)含有I)所述RNA分子的重组载体、重组细胞或重组微生物； 4)由权利要求6-8中任一所述的融合基因编码的蛋白质；所述蛋白质的氨基酸序列为A1-A4中的任一种 Al、序列表中的序列8 ；A2、序列表中的序列8第20-531位； A3、序列表中的序列6 ； A4、将序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列。
10.里氏木霉(Trichoderma reesei),其特征在于所述里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株号为TR1124，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6384。
全文摘要
本发明公开了高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。该高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法包括如下步骤比较经流式细胞仪鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。其中的外源蛋白基因以融合基因的形式导入里氏木霉，该融合基因是将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A。
文档编号G01N15/14GK102876706SQ20121027182
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者董志扬, 秦丽娜 申请人:中国科学院微生物研究所
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