专利名称：人体或动物组织的脱水包埋改良方法
技术领域：
本发明是涉及人体或动物组织的脱水包埋改良方法，该方法可广泛应用于医学、生物学等领域的研究。
背景技术：
石腊切片(paraffin section)技术是医学组织学、发育生物学等研究的主要实验方法，同时也是观察人体或动物组织结构变化的重要手段。人体与动、植物标本的形态学观察、免疫组化、原位杂交及原位PCR等检测技术，都离不开标本组织处理和石蜡切片的制作。制作石蜡切片的最终目的，需将组织通过脱水包埋处理制成石蜡块。常规的石蜡切片技术包括五个基本步骤，即固定、脱水、透明、浸蜡和包埋。其中脱水包埋过程是关系到切片质量与组织后续实验成功与否的重要步骤。组织脱水指通过某种溶剂将组织内的水分逐渐置换出来的过程，因为水与石蜡互不相融，脱水后有利于透明剂和石蜡的渗入。一般医学以及生物学中的脱水过程是利用由低到高浓度梯度的乙醇逐级完成的，由于乙醇与石蜡也不能混合，因此需要经过一种乙醇与石蜡之间的媒浸物，即透明剂，用透明剂取代组织中的乙醇，使液态的石蜡最终取代透明剂以顺利地渗入组织间隙中，最后用石蜡浸溃组织并铸制成坚实的蜡块用于制成石蜡薄片，另外，石蜡对组织具有良好的保护作用，将组织包埋在石蜡中可长期保存备用。目前，石蜡切片技术中通常用到的透明剂是二甲苯(Xylene，C6H4(CH3)2)，它能溶于醇，也为石蜡的溶剂，但不能与水混合。二甲苯的透明速度快，但它对组织的收缩性很强，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，会严重影响切片质量。有些组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头发和眼球等，由于组织过硬不宜用二甲苯透明。另外，二甲苯也极易挥发，对人体�：洗�。除二甲苯以外，甲苯、苯、香柏油、氯仿等也可作为透明剂。甲苯和苯的性质与二甲苯相似，香柏油对组织收缩性�。该魉俣燃�3mm以下厚度的组织块需要透明12h以上，5mm厚的组织块需要透明25h 36h，而香柏油不易与石蜡融合，因此经香柏油透明后，须经二甲苯短时间媒浸才能进行石蜡包埋。除此之外上述溶剂也易挥发且气味较重，对人体具有一定程度毒副作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单有效、成本低廉、克服了切片时石蜡组织块易碎的缺陷、且不容易破坏人体或动物组织的脱水包埋改良方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种人体或动物组织的脱水包埋改良方法，包括固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，其具体过程为，首先将固定后的组织通过由低到高浓度的乙醇 进行梯度脱水(第一步脱水)，然后将梯度脱水后的组织放置于体积比为I:广1.5的无水乙醇(通常无水乙醇中乙醇的体积浓度在99.7%以上)与丁醇中进行混合液脱水(第二步脱水)，混合液脱水的时间为30min 60min，再将混合液脱水后的组织放入丁醇中于4°C 16°C的温度下进一步脱水(第三步脱水)，进一步脱水的时间为8h 20h ;脱水完成后，将组织浸溃于丁醇中进行透明；最后将透明后的组织进行浸蜡和包埋。上述方法中，所述丁醇优选正丁醇或异丁醇。上述方法中，优选的，所述混合液脱水与所述进一步脱水过程中使用的丁醇具有相同的分子结构式，更优选同时使用异丁醇；所述脱水过程与透明过程中使用的丁醇具有不同的分子结构式，更优选脱水过程使用异丁醇，透明过程使用正丁醇。上述方法中，所述梯度脱水的过程为:将所述组织依次通过50%体积浓度的乙醇脱水5min 30min(优选IOmin 20min)、70%体积浓度的乙醇脱水Ih 3h、80%体积浓度的乙醇脱水0.5h 3h、95%体积浓度的乙醇脱水20min 120min(优选60min 120min)和无水乙醇脱水20min 120min (优选60min 120min);所述梯度脱水的过程优选在4°C 16°C温度下进行。上述梯度脱水过程中，95%体积浓度的乙醇优选脱水两次，第二次脱水所用乙醇为重新换过的95%体积浓度的乙醇。上述梯度脱水过程中，无水乙醇优选脱水两次，第二次脱水所用乙醇为重新换过的无水乙醇。上述方法中，所述透明过程中组织的浸溃时间优选Ih 4h。上述方法中，所述浸蜡过程为:将透明后的组织先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中0.5h 2h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中0.5h 2h。
与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明的方法没有采用常规的单一乙醇脱水以及二甲苯透明的方法，而是采用乙醇与丁醇(主要是正丁醇或异丁醇，下同)作为脱水剂，再用丁醇作为透明剂处理组织，弃用了二甲苯。由于丁醇可与水、乙醇相混合，也能与液体石蜡相融合，因此兼具脱水和透明作用。丁醇的脱水能力较乙醇弱，但脱水和透明的作用缓和，对组织没有损伤，不会引起组织块因过度脱水和透明而收缩硬化，使组织破碎影响切片，比传统方法易于掌控操作的时间和过程，提高了组织的安全性与可靠性，透明后的组织平整，无收缩、变形等现象，并且不存在透明时间过长的问题。丁醇作为透明剂，其透明效果比二甲苯优越。另外，由于组织块的性质不一，在高浓度乙醇和二甲苯溶液中停留的时间很难恰当掌控，用传统方法包埋组织，容易导致组织块破碎难于切片甚至毁损组织，再者传统方法脱水包埋过程只能在同一天的时间内完成，脱水、透明、浸蜡到包埋过程将不间断持续至少十几个小时，使实验者在时间调配上极不方便，而本发明能使组织块在丁醇中过夜，因此实验者对实验操作时间可以进行合理安排与规划。相较二甲苯，丁醇没有腐蚀性，且毒副作用不大，对实验操作人员具有很高的安全性。由于本发明使用了缓和作用的丁醇，并根据不同的组织对作用时间稍加调整，使组织块不易收缩硬化易于切片，大大提高了实验成功的可靠性。(2)本发明方法操作简单方便，成本低廉，效果好，可应用于几乎所有需要石蜡包埋处理的组织，可广泛推广至临床病理诊断等科研工作中。
具体实施例方式以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例1:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，选取皮肤组织(还可以为腺体、粘膜等疏松组织)作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过临床手术或动物实验得到皮肤组织样品，迅速切成约0.5cmX IcmX Icm(厚X长X宽)大小块状，先用4%多聚甲醛(质量/体积比，溶剂为PBS)固定，4°C下过夜，时间为8h 16h，然后置于0.02% (质量/体积比)NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的皮肤组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将皮肤组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水20min、70%体积浓度的乙醇脱水lh、80%体积浓度的乙醇脱水lh、95%体积浓度的乙醇脱水45min、再次用95%体积浓度的乙醇脱水45min、无水乙醇脱水45min，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C 16°C下进行；梯度脱水后，将皮肤组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为45min ;混合液脱水后，将得到的皮肤组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为14h 18h。3.透明: 将脱水完成后的皮肤组织样品放入正丁醇中浸溃2h。4.浸蜡:将透明处理后的皮肤组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中lh，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中lh，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度 60。。。5.包埋:将浸蜡后的皮肤组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。实施例2:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，选取肝组织(还可以为脾、肾、肌肉等实质性的正常组织，还可以为癌体组织)作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过临床手术或动物实验得到肝组织样品，迅速切成约0.5cmX IcmX Icm大小块状，先用4%多聚甲醛固定，4°C下过夜，时间为8h 16h，然后置于0.02%NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的肝组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将肝组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水30min、70%体积浓度的乙醇脱水Ih 2h、80%体积浓度的乙醇脱水Ih 2h、95%体积浓度的乙醇脱水lh、再次用95%体积浓度的乙醇脱水lh、无水乙醇脱水lh、再次用无水乙醇脱水lh，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C 16°C下进行；梯度脱水后，将肝组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇的混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为Ih ;混合液脱水后，将得到的肝组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为14h 18h。3.透明:将脱水完成后的肝组织样品放入正丁醇中浸溃2h 4h。4.浸蜡:将透明处理后的肝组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中1.5h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中1.5h，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度60°C。5.包埋:将浸蜡后的肝组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。实施例3:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，选取骨骼组织作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过临床手术或动物实验得到骨骼组织样品，迅速切成约0.5cmX IcmX Icm大小块状，先用4%多聚甲醛固定，4°C下过夜，时间为8h 16h，然后置于0.02%NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的骨骼组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将骨骼组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水30min、70%体积浓度的乙醇脱水2h、80%体积浓度的乙醇脱水lh、95%体积浓度的乙醇脱水lh、再次用95%体积浓度的乙醇脱水lh、无水乙醇脱水lh，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C 16°C下进行；梯度脱水后，将骨骼组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇的混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为Ih ;混合液脱水后，将骨骼组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为14h 18h。3.透明:将脱水完成后的骨骼组织样品放入正丁醇中浸溃3h (3h 4h均可)。4.浸蜡:将透明处理后的骨骼组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中2h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中lh，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度 60。。。5.包埋:将 浸蜡后的骨骼组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。实施例4:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，选取血管组织(还可以为肠等中空的组织)作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过临床手术或动物实验得到血管组织样品，迅速切成0.5cm Icm长大小节段，先用4%多聚甲醛固定，4°C过夜，时间为8h 16h，然后置于0.02%NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的血管组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将血管组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水15min、70体积浓度的乙醇脱水1.5h、80%体积浓度的乙醇脱水lh、95%体积浓度的乙醇脱水30min、再次用95%体积浓度的乙醇脱水30min、无水乙醇脱水30min，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C 16°C下进行；梯度脱水后，将血管组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇的混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为Ih ;混合液脱水后，将得到的血管组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为12h 16h。3.透明:将脱水完成后的血管组织样品放入正丁醇中浸溃2h (2h 4h均可)。4.浸蜡:将透明处理后的血管组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中lh，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中lh，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度 60。。。5.包埋:将浸蜡后的血管组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。
实施例5:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，选取脑组织(还可以为睾丸等柔软组织)作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过动物实验得到脑组织样品，迅速切成约0.5cmX IcmX Icm大小块状，先用4%多聚甲醛固定，4°C下固定12h (还可以为2h 16h，随组织大小而定)，然后置于
0.02%NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的脑组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将脑组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水20min、70%体积浓度的乙醇脱水1.5h、80%体积浓度的乙醇脱水lh、95%体积浓度的乙醇脱水lh、再次用95%体积浓度的乙醇脱水lh、无水乙醇脱水lh、再次用无水乙醇脱水lh，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C 16°C下进行；梯度脱水后，将脑组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇的混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为Ih ;混合液脱水后，将得到的脑组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为12h 20h。3.透明:将脱水完成后的脑组织样品放入正丁醇中浸溃2 h (2h 4h均可)。4.浸蜡:将透明处理后的脑组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中2h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中2h，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度60。。。5.包埋:将浸蜡后的脑组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。实施例6:
一种本发明的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，用临床胃镜取组织方法取息肉组织(还可以为胃粘膜等细小组织，或者为其他临床穿刺的肾脏、肝脏、骨髓组织等细小组织)作为实施对象，具体操作步骤如下:
1.固定:通过临床胃镜取组织得到息肉组织样品，先用4%多聚甲醛固定，4°C下固定2h 6h，然后置于0.02%NaN3的PBS保存液中保存备用，可长期保存。2.脱水:首先将固定后的息肉组织样品进行乙醇浓度梯度脱水:将息肉组织样品依次通过50%体积浓度的乙醇脱水5min、70%体积浓度的乙醇脱水lh、80%体积浓度的乙醇脱水30min、95%体积浓度的乙醇脱水20min、再次用95%体积浓度的乙醇脱水20min、无水乙醇脱水20min，完成梯度脱水，梯度脱水过程均在4°C下进行；梯度脱水完成后，将息肉组织样品放置于体积比为1:1的无水乙醇与异丁醇的混合溶液中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为30min ;混合液脱水后，将得到的息肉组织样品放入异丁醇中置于4°C的冰箱内过夜以进一步脱水，时间为8h 12h。3.透明:将脱 水完成后的息肉组织样品放入正丁醇中浸溃Ih (Ih 2h均可)。4.浸蜡:将透明处理后的息肉组织样品先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中
0.5h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中0.5h，设置第一次浸蜡温度为55°C，第二次浸蜡温度60°C。5.包埋:将浸蜡后的息肉组织样品置于包埋框中央的底部，然后加硬蜡至包埋框后置于4°C下过夜后切片。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。`
权利要求
1.一种人体或动物组织的脱水包埋改良方法，包括固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，其特征在于，首先将固定后的组织通过由低到高浓度的乙醇进行梯度脱水，然后将梯度脱水后的组织放置于体积比为1:1 1.5的无水乙醇与丁醇中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为30min 60min，再将混合液脱水后的组织放入丁醇中于4°C 16°C的温度下进一步脱水，进一步脱水的时间为8h 20h ;脱水完成后，将组织浸溃于丁醇中进行透明；最后将透明后的组织进行浸蜡和包埋。
2.根据权利要求1所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述丁醇为正丁醇或异丁醇。
3.根据权利要求1或2所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述混合液脱水与所述进一步脱水过程中使用的丁醇具有相同的分子结构式，所述脱水过程与透明过程中使用的丁醇具有不同的分子结构式。
4.根据权利要求3所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述梯度脱水的过程为:将所述组织依次通过50%体积浓度的乙醇脱水5min 30min、70%体积浓度的乙醇脱水Ih 3h、80%体积浓度的乙醇脱水0.5h 3h、95%体积浓度的乙醇脱水20min 120min和无水乙醇脱水20min 120min ;所述梯度脱水的过程均在4°C 16°C温度下进行。
5.根据权利要求4所述的人 体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述梯度脱水过程中，95%体积浓度的乙醇脱水两次。
6.根据权利要求4或5所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述梯度脱水过程中，无水乙醇脱水两次。
7.根据权利要求3所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述透明过程中，组织的浸溃时间为Ih 4h。
8.根据权利要求3所述的人体或动物组织的脱水包埋改良方法，其特征在于，所述浸蜡过程为:将透明后的组织先浸没于熔点为45°C 56°C的软蜡中0.5h 2h，再浸没于熔点为56°C 60°C的硬蜡中0.5h 2h。
全文摘要
本发明公开了一种人体或动物组织的脱水包埋改良方法，包括固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，其过程为首先将固定后的组织通过由低到高浓度的乙醇进行梯度脱水，然后将梯度脱水后的组织放置于体积比为1∶1~1.5的无水乙醇与丁醇中进行混合液脱水，混合液脱水的时间为30min～60min，再将混合液脱水后的组织放入丁醇中于4℃～16℃的温度下进一步脱水，进一步脱水的时间为8h～20h；脱水完成后，将组织浸渍于丁醇中进行透明；最后将透明后的组织进行浸蜡和包埋。本发明的方法操作简单方便、安全性和可靠性高、效果显著且应用广泛。
文档编号G01N1/28GK103234797SQ20131015460
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者周军, 周丽, 温蒲圆 申请人:中南大学湘雅三医院
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