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专利名称：：食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及了一种定量检测人血清中食物过敏原特异性IgG的酶联免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒及其生产方法，筛查确定致敏食物过敏原及过敏反应程度。
背景技术：
：过敏性疾病是现代社会中最常见的一种疾病，它是由广泛存在的过敏原引发的，我国大约有5-10%的人受过敏原侵扰。过敏反应(allergicreaction)又称变态反应，过敏原(allergen)又称变应原。过敏反应有两个主要类型由IgE介导的速发型过敏反应，通常在接触过敏原后短时间立即发生，病症明显；由IgG及其亚类IgG4介导的迟发型过敏反应，通常在接触过敏原几小时或几天后才会出现反应症状，有长期疲劳、关节炎、荨麻疹、湿疹、头痛、肠胃功能失调及其它慢性症状。IgG介导的过敏反应，通常是由食物过敏原引发的，且患者皮试多呈阴性，迫切需要从众多食物中筛查出引发过敏反应的过敏原，进而很好地对症预防和治疗(周光炎等译，2002，免疫学，PP323-369,人民卫生出版社；SampsonHA,1999，Foodallergy,partl，JAllergyClinImmunol，103:717-728)。过敏患者摄入食物过敏原后，体内产生的IgG抗体及其亚类与脱颗粒化的嗜碱性粒细胞及肥大巨细胞结合，活化互补的递级细胞和组织，引发过敏反应；在过敏患者的血液中可检测出IgG及其亚类浓度的升高(BrightonWD,1980,FrequencyofoccurrenceofIgG(S-TS),ClinAllergy,10:97-100)。过敏患者再次摄入食物过敏原后，提高循环血液中特异性IgG浓度，已被为减轻过敏反应病症而进行免疫治疗患者的血清IgG浓度的检测多次证实(KemenyDMetal,1986,SubclassofIgGinallergicdisease,ClimAllergy,16:571-574)。根据近40年来的大量研究，食物过敏原分两大类植物蛋白和动物蛋白。由它们的结构和功能特性，含过敏原的植物蛋白的是豆科植物、树坚果、谷物、水果、蔬菜等中的醇溶蛋白的超家族，花生、树坚果、大豆等的种子忙藏蛋白的杯状蛋白超家族和谷物的a-淀粉酶、蛋白酶抑制剂等植物防卫系统的蛋白家族(BreitenederHeral,2004,Aclassificationofplantfoodallergens,JAllergyClimlmmunol，113:821-830);含过敏原的动物蛋白的来源为哺乳动物的肉及乳蛋白，鸟类、鱼、甲壳动物、软体动物、两栖动物和爬行动物等的肉蛋白，来源广发、丰富；以它们为原料还生产了数不清的"营养健康食品"(WalJM，1999,Nahmng,43:sl68-174)，迫切需要体外检测食物过敏原。过敏反应在临床上可以通过皮肤试验以及各种体外检测方法，如放射性免疫分析(RIA)法、免疫印迹(IS)、免疫沉淀(IP)和酶联免疫吸附分析(ELISA)法等，结合发病症状等来确定致敏的过敏原(SampsonHA，1999,Foodallergy,part2,JAllergyClinlmmunol，l03:981-989)。ELISA方法较RIA、IS、IP等方法安全、简单、经济快速，是世界上当前发展最快且最常用的体外检测致敏性过敏原及其过敏程度的方法(YungingerJWeral，2002,JAllergyClinImmunol,105:1077-1084)。ELISA试剂盒检测食物中过敏原蛋白所需技术，如过敏原蛋白的提纯方法，人IgG抗体的制备、纯化，抗人IgG抗体生产提纯，酶标记抗体的制备纯化等均已成熟(PorstmannT,kiessigST,1992,Enzymeimmunoassaytechniques,Anoverview,JImmunolMethods,150:5-21)为食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒的商品化生产建立了技术基础，国外也己生产出了商品化体外检测试剂盒，如Pharmacia公司(www.purduepharma.com)的immunoCAP100specificIgGkit,Biomerica公司(www.biomerica.com)的AllerquantIgGfoodallergyacreeningELISAkit等。
发明内容本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、使用方便、快速地定量检测人血清中的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒,用以筛查患者致敏的食物过敏原并确定患者致敏反应的程度。本发明的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒，其组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓縮洗涤液和终止反应液；財已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括牛奶、羊奶；已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括家禽蛋白、家禽蛋黄；已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、杉^已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；酶标记抗体辣根过氧化物酶标记的抗人IgG单克隆抗体；TMB底物显色液2.08mmol/L3，3，，5，5'—四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/L卩一环糊精，O.lmol/LpH5.0的醋酸缓冲液。样品稀释液1Ommol/LpH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1%BSA，0.05%Tween-20和lmg/L庆大霉素；浓縮洗涤液O.lmol/LpH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1%胎牛血清，0.5%Tween-20和20mg/L庆大霉素；终止反应液1.0mol/LH2SO4。本发明的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤(1)食物过敏原蛋白的制备将含过敏原蛋白的食物经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；(2)酶标记抗体的制备用辣根过氧化物酶(Horseradishperaxidase,HRP)标记纯化的抗人IgG抗体；(3)配制人IgG标准液、TMB底物显色液、浓縮洗涤液和终止反应液；(4)酶标板包被用抗人IgG抗体和食物过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。本发明的试剂盒的使用方法，包括如下操作步骤(1)加入样品液和标准液到相应的酶标板微孔中，使样品液中的食物过敏原特异性IgG抗体各自与相应的固相过敏原蛋白结合或标准液中的人IgG与固相载体上的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的杂蛋白和其他物质；(2)使已结合的人IgG抗体与HRP-抗人IgG抗体相结合，洗去多余的酶标记抗体；(3)加入TMB底物显色液，室温孵育反应，终止酶反应后检测显色反应的强度。本发明的有益效果在于本发明建立了夹心式ELISA方法简接测定样品液中的食物过敏原特异性IgG抗体含量和定性筛查致敏食物过敏原，检测灵敏度小于0.7U/ml，剂量一反应曲线的线性相关系数^0.99，具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，为体外辅助诊断确定使患者致敏的食物过敏原及过敏反应程度提供了有效的手段。具体实施方法以下结合实施例进一步说明本发明。实施例1本发明的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒，其组成包括己包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓縮洗涤液和终止反应液。上述的酶标板为96(12条8孔或8条12孔)。食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒的制备方法1.食物过敏原蛋白的制备1.1食物过敏原蛋白的粗浸提液1.1.1奶类提取液奶类浸液的制作有两种方法(1)先用离心法(2400转/分钟)离心15分钟，用小匙除去上层脂肪，取400ml脱脂乳，加入5ml1%凝乳酶或乳冻片，不搅拌，放入37'C恒温水浴或孵箱内30分钟，如乳清蛋白与酪蛋白(casein)分离，用干净纱布过滤，再用普通滤纸过滤。按l:2(W/V)的比例，用缓冲盐水提取液稀释乳清蛋白即为乳清蛋白提取液。(2)将含有乳清的滤液加3倍丙酮，放入冰箱24h，使乳清沉淀；用离心法除去上清液，再用丙酮浸洗几次，干燥后研细成粉未贮存。提取时按l:50(W/V)用缓冲盐水提取液在冰箱内提取48小时，每日搅拌或振荡2小时。酪蛋白用丙酮和乙醚反复脱脂、最后研磨，用3号或4号筛筛出，按l:50(W/V)比例提取。l丄2蛋类提取液蛋白和蛋黄均按l:20(W/V)的比例用缓冲盐水提取液稀释，充分混匀后直接过滤和除菌，不需提�。�亦无需作毒性试验。蛋黄也可制成干粉，方法是加入丙酮脱脂2-3小时，倾去丙酮层，待挥发干燥后，用打碎机打碎，再用乙醚脱脂4小时备用。蛋黄干粉按l:50比例(w/V)用缓冲盐水提取液提取。l丄3肉类提取液取新鲜瘦肉，去掉脂肪和结缔组织，剁成碎末，或用绞肉机绞碎。交替用甲苯、二甲苯、丙酮及乙醚等不同溶剂反复脱脂，室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。按l:25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。l丄4谷物、坚果、豆类蛋白提取液(1)千燥、去壳、脱皮、磨粉贮存；在索氏提取器中按粉正己烷=1:10(W/V)的比例脱脂6小时，干燥脱脂粉再磨细贮于-2(TC下的密封容器中备用。(2)脱脂粉用提取缓冲液(含20mmolNaH2PO4，lmol/LNaCl，pH7.0)提取蛋白；脱脂粉提取缓冲液的比例为lg:10ml(W/V),室温提取1.5小时，然后4。C下20000g离心30分钟，保存上清液。1.1.5水果、蔬菜类蛋白提取液洗净、凉干、搅碎、提�。蝗〔糠植獬鏊�分含量。按lg(干重)10ml提取缓冲液(含20mmo1NaH2P04,lmol/LNaCl,pH7.0)提取蛋白；室温提取1.5小时，然后4。C下20000g离心30分钟，保存上清液。U.6水产类蛋白提取液取新鲜水产肉，去脂肪，粉碎。用丙酮或乙醚反复脱脂、室温下干燥，过筛，贮存于密闭玻璃瓶中备用。按l:25(W/V)的比例用缓冲盐水提取液提取48小时，提取过程中每日搅拌或振荡2小时。粗滤后如液体混浊，可用分液漏斗加乙醚再脱脂。1.2食物过敏原蛋白的提取食物过敏原蛋白的粗提取液需经透析、SDS-PAGE电泳免疫印迹确认、割胶、离心提取的较纯的过敏原蛋白组分。(1)将浸提液在透析袋(MWCO10000)中对10mmol/LPBS(pH7.2)透析48小时，期间缓缓搅动PBS溶液，并更换PBS液4次；(2)透析后的过敏原蛋白溶液过0.45um滤膜，并稀释成4mg/ml的蛋白溶液；(3)过敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的胶柱，电泳分离；在分子量10-100kD的区域用病人阳性血清在一个电泳胶柱进行免疫印迹，显色；(4)切割下其余胶柱过敏原蛋白定位的相应条带，加入适量PBS溶液后，室温2000g离心IO分钟；(5)测出过敏原蛋白溶液的浓度，加入适量防腐剂，-2(TC下冷冻贮存。2.人IgG标准液的制备2.1材料人IgG抗体来源于人血浆中经亲和色谱纯化，纯度>95%的人IgG抗体(购自美国Biodesign公司)。2.2步骤用样品稀释液将抗人IgG抗体配制成浓度为200ug/ml人IgG标准液。3.包被酶标板3.1材料(1)活化处理过的酶标板(Nunc，Nunc-ImmunoplatesTM,USA或Greiner，Greinerlabortechnik，Germany);(2)食物过敏原蛋白；(3)0.05mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)或活化包被液；(4)0.01mol/LPBS溶液；(5)3。/。BSA封闭液；(6)金属箔袋及真空封口机等。3.2步骤(1)用包被液(0.05mol/L碳酸缓冲液，pH9.6或根据过敏原蛋白的特性选择的活化包被液)适当稀释过敏原蛋白溶液成0.05ug/ml-10ug/ml的包被浓度，混匀，待包被的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入100ul;(2)酶标板封膜后4"C下反应过夜；(3)倒掉包被的抗体和抗原溶液，洗板，每孔加入250ul3。/。BSA封闭液，4t:下封闭过夜；(4)倒空封闭液，用洗涤液洗板4次，拍干；(5)将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属箔袋内，在4'C下贮存。4.酶标记抗体(辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgG抗体)的制备4.1材料(1)辣根过氧化物酶(HRP，RZ>3.2，活性》00U/ml;购自美国SIGMA公司)；(2)O.lmol/LNal04溶液；(3)0.2mol/L碳酸缓冲液，pH9.5;(4)抗人IgG抗体(购自美国KPL公司)；(5)4.0mg/ml的NaBH4溶液；(6)0.15mol/L的PBS，pH7.4;(7)ProteinA-Sepharose4FastFlow亲和色谱柱材料及色谱柱；(8)亲和色谱纯化用的柠檬酸、磷酸及Tris缓冲液；(9)SephadexG25凝胶色谱柱；(10)分光光度计等。4.2步骤(1)称取5mgHRP溶解于lml蒸馏水中，然后加入0.2ml新配的O.lmol/LNaI(X溶液，室温下避光搅拌20分钟；(2)将上述溶液装入透析袋中，对lmol/LpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4"C过夜；(3)加20pl0.2mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上已醛化的HRP溶液的pH升高到9.09.5，然后立即加入10mg抗人IgG抗体在lml0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；(4)加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，4'C下再静置2小时；(5)将上述溶液装入透析袋中，对0.15mol/LpH7.4PBS透析，4。C过夜。少量沉淀应离心弃去；(6)色谱柱中装入2mlProteinA-Sepharose4FastFlow;用5mlpH3.0柠檬酸钠缓冲液清洗柱，接着用10mlpH8.0的磷酸缓冲液清洗；(7)用Tris调节上述制备的HRP标记的抗人IgG抗体溶液的pH值至8.0，以约5ml/小时的速度将标记制备的HRP-抗人IgE抗体溶液上柱；(8)用pH8.0的磷酸缓冲液清洗色谱柱，清洗流出液含非免疫球蛋白等杂蛋白；(9)用10ml0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液洗脱HRP-抗人IgG抗体。酶标记抗体洗脱后柱用10ml磷酸缓冲液清洗；(10)在280nm处监控洗脱液的吸光度，收集大于基线的馏份。收集的馏份迅速用2mol/LTris溶液中和。(11)收集的馏份过PDIO(SephadexG25)柱并用PBS交换洗脱馏份的介质溶液；(12)灭菌后，加入载体蛋白冷冻干燥，收集的酶标记抗体，贮存在4'C以下的暗处。4.食物过敏原特异性IgG抗体ELISA检测试剂盒的使用方法(1)酶标板条安装已包被的酶标板条平衡至室温后，开启包装袋，取出所需筛查食物过敏原蛋白包被的酶标板条组合，牢固地安装在酶标板框架上。不需用的酶标板置于包装袋中，驱气密封好，放在2-8"C下贮存。(2)样品孵育取100ul人IgG标准液系列和稀释后的样品液加入到相应的包被酶标板孔中；空白孔中只加入100ul样品稀释液；用膜封好酶标板孔，在37'C下孵育45分钟。(3)洗板吸走或倒空孔中液体，洗板4次后拍干。(4)酶标记抗体孵育用移液器每孔加入100ul酶标记抗体溶液；封好酶标板，在37。C下孵育反应用45分钟；如步骤(3)洗板4次。(5)底物反应显色每孔加入100ulTMB底物显色液，轻轻晃摇30秒钟，室温静置反应15分钟。(6)终止反应检测每孔加入100ul终止反应液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔的吸光度值。(7)结果计算计算重复孔的平均吸光度值；以标准溶液系列的平均吸光度值的对数值对相应浓度的对数值进行线性回归，构建工作曲线；由样品重复孔的平均吸光度值大于cut-off值的那个过敏原孔的吸光度值从工作曲线计算出患者该食物过敏原的特异性IgG抗体含量，并按给定的分级将该过敏原致敏反应定级。食物过敏原特异性IgG浓度的分级方法吸光度分级<0,200(阴性)0.21-0.601(弱阳性)0.61-1.202(阳性)>1.203(强阳性)实施例2:用ELISA法筛査食物过敏原试验对32例食物过敏患者(2—18岁的21人，18—56岁的11人)，抽取血液制备血清定性筛査食物(牛奶；蛋白/蛋黄；玉米、小麦、燕麦、大麦；奸、蟹、蚌；带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉；土豆、西红柿；扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；猪肉、牛肉、羊肉)过敏原。按上述食物过敏原特异性IgG抗体ELISA检测试剂盒的使用方法测出患者血清在不同食物过敏原包被孔的吸光度，其中值大于cut-off值(0.20)的判断为阳性。检测结果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>检测结果表明，采用本发明的试剂盒能够简便、快速、准确地检测出致敏食物过敏原，灵敏度达91.2%，特异性达86.5%。权利要求1、食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液；其中已包被的奶类食物过敏原蛋白的酶标板包括牛奶、羊奶；已包被的蛋类食物过敏原蛋白的酶标板包括家禽蛋白、家禽蛋黄；已包被的肉类食物过敏原蛋白的酶标板包括猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、驴肉；已包被的谷物类食物过敏原蛋白的酶标板包括玉米、小麦、燕麦、大麦、荞麦、大米、小米；已包被的坚果类食物过敏原蛋白的酶标板包括杏仁、花生、榛子、腰果、核桃、开心果、巴西坚果、芝麻；已包被的水果类食物过敏原蛋白的酶标板包括西瓜、菠萝、橙子、芒果、香蕉、柑桔、胡柚、柠檬、苹果、葡萄、梨、草莓、桃；已包被的蔬菜类食物过敏原蛋白的酶标板包括芹菜、菠菜、洋葱、茄子、大蒜、辣椒、土豆、西红柿；已包被的水产类食物过敏原蛋白的酶标板包括带鱼、黄鱼、比目鱼、三文鱼；鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、虾、蟹、蚌、贻贝、牡蛎、黄鳝、鳗鱼；已包被的豆类食物过敏原蛋白的酶标板包括扁豆、蚕豆、黄豆、豌豆；酶标记抗体辣根过氧化物酶标记的抗人IgG单克隆抗体；TMB底物显色液2.08mmol/L3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，12mmol/L过氧化氢，10mmol/Lβ-环糊精，0.1mol/LpH5.0的醋酸缓冲液。样品稀释液10mmol/LpH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％BSA，0.05％Tween-20和1mg/L庆大霉素；浓缩洗涤液0.1mol/LpH7.4-7.6的磷酸盐缓冲液中含1％胎牛血清，0.5％Tween-20和20mg/L庆大霉素；终止反应液1.0mol/LH2SO4。2、根据权利要求l所述的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒，其特征在于所说的酶标板为96孔。3、根据权利要求1所述的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)食物过敏原蛋白的制备将含过敏原蛋白的食物经粉碎、脱脂、提取、SDS-PAGE电泳确证、洗脱、干燥；(2)酶标记抗体的制备用辣根过氧化物酶标记纯化的抗人IgG抗体；(3)配制人IgG标准液、TMB底物显色液、浓縮洗涤液和终止反应液；(4)酶标板包被用抗人IgG抗体和食物过敏原蛋白包被酶标板，并封闭。全文摘要本发明公开的食物过敏原特异性IgGELISA检测试剂盒，包括已包被的奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、水产类、豆类食物过敏原蛋白的酶标板、人IgG标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、浓缩洗涤液和终止反应液。用于检测人血清中食物过敏原特异性IgG抗体浓度，由样品血清吸光度大于cut-off值的过敏原孔筛查致敏食物过敏原，且从标准曲线计算出样品血清中的特异性IgG浓度，定量分级确定过敏反应程度，具有灵敏、快速、简便、稳定的优点，可应用于过敏性疾病的体外临床辅助诊断及科学研究。文档编号G01N33/68GK101109750SQ200710070198公开日2008年1月23日申请日期2007年7月27日优先权日2007年7月27日发明者吴善东申请人:杭州浙大生科生物技术有限公司