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专利名称：一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法。
背景技术：
在国际上，食用菌多糖被称作“生物反应调节物”。大量研究已表明，食用菌多糖具有免疫调剂活性，可提高免疫力。同时，食用菌多糖具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多重功效。目前，越来越多的注意力集中到食用菌多糖的免疫功效。多糖在医药及食品保健领域迅速发展，具有很好的开发前景。
不同多糖的生物活性有所差别，活性高低受多糖的结构、分子量等多种因素影响，因此，多糖类药品及保健品的功效存在很大差异检测食用菌多糖生物活性是判断多糖药品及保健品功效的方法之一。目前，有关多糖生物活性的检测手段主要是整体水平和原代细水平检测。传统的动物学实验检测多糖活性方法存在动物个体差异、工作量大、资金消耗多等不足，同时涉及动物实验伦理问题；原代细胞检测多糖生物活性亦存在细胞稳定性等问题。核酸类药物也可作为免疫增强剂、抗病毒抗肿瘤剂，可用于抗肿瘤、抗肿瘤的辅助治疗。目前，核酸类药物的检测方法主要是DNA含量的测定、RNA含量的测定及核甘酸、核苷含量的测定。现有的检测方法仅对核酸含量高低作出评价，但不适用于药物的有效性测定。因此，一种快速有效地检测多糖、核酸生物活性方法的建立势在必行。

发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法的技术方案。所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤
1)取多糖或核酸样品，配制成多糖或核酸溶液；
2)取THP-I细胞，调整细胞密度至IO5 IO6个/ml；
3)取步骤2)得到的细胞液，加入步骤I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸终浓度达到10 μ g 20mg/ml，然后进行培养；
4)取步骤3)得到的培养物离心后收集细胞上清液；
5)取步骤4)得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN-α浓度，IFN-α浓度高低说明被检测多糖或核酸样品的生物活性高低。所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤I)中用蒸馏水或RPMI1640培养基配制多糖或核酸溶液。所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤2)中用RPMI1640培养基调整THP-I细胞密度。所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤2)中调整细胞密度的THP-I细胞置于37°C下进行培养24 36h。所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤3)中加入多糖或核酸溶液后的细胞液 置于37°C、C02浓度5%的二氧化碳培养箱培养24 48h。本发明中RPMI1640培养基为现有培养基，THP-I细胞为现有细胞，均在市场上购得。已有研究发现，多糖具有抗病毒、抗肿瘤等活性，但其提高机体的免疫调节能力并非直接作用于肿瘤细胞和病原微生物，而是通过刺激、激活免疫细胞释放细胞因子发挥作用。IFN-α是由活性淋巴细胞产生的，就有抗病毒、抗肿瘤活性，参与免疫调节。因此，IFN-α浓度的高低可作为机体免疫调节能力的一种评价指标。本发明采用稳定的单核细胞株THP-I细胞，通过细胞分泌的细胞因子INF-α浓度评价多糖及核酸生物活性，降低了检测难度、提高了检测结果的稳定性。本发明的有益效果是实现了高通量有效检测多糖、核酸生物活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明为定量测定多糖或核酸生物活性提供了基础。本发明主要针对多糖及核酸进行生物活性检测，同时适用于其他免疫调节物质的活性检测。


图I为灰树花多糖生物活性检测 图2为香菇多糖生物活性检测 图3为虫草多糖生物活性检测 图4核糖核酸II生物活性检测图。图中*表示 ρ〈0· 05, *** 表示 ρ〈0· 01。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例I :灰树花多糖活性检测
取灰树花多糖烘干样品，用RPMI1640培养基或蒸馏水配制5mg/ml的灰树花多糖溶
液；
用RPMI1640培养基将THP-I细胞密度调整至IO5 IO6个/ml ；
将调整好密度的细胞置于细胞培养碟中，在37°C下培养24h或36h ；
培养碟中加入适量5mg/ml灰树花多糖，至灰树花多糖终浓度分别为0mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养36或48h ；
以IOOOg离心力离心20min收集细胞上清；
用ELASA法检测IFN-α浓度，即用人IFN-α酶联免疫分析试剂盒检测IFN-α浓度(人IFN-α酶联免疫分析试剂盒为现有产品)
标准品及待测样本分别取ΙΟΟμΙ加入到酶标板孔中，做好标记；分别向孔中加50μ1酶联亲和物，充分混匀，避免产生气泡；
酶标板覆膜于37°C孵育反应60min，充分弃尽孔内液体并扣干孔内剩余残液，用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次，并扣干孔内剩余液体；
每孔依照次序分别加入底物I和II各50μ1，充分混匀。室温下避光反应15min ； 反应后每孔加终止液5θμ ,充分混匀，终止反应；
30min内使用酶标仪在450nm下读取OD值。已有研究表明灰树花多糖具有免疫调节活性，图I所示结果与已有研究成果基本一致，说明灰树花多糖具有免疫调节活性，因此可以验证此检测方法的有效性。
实施例2 :香菇多糖活性检测
取香菇多糖烘干样品，用RPMI1640培养基配制5mg/ml的香菇多糖溶液；
用RPMI1640培养基将THP-I细胞密度调整至IO5-IO6个/ml ；
将调整好密度的细胞置于细胞培养碟中，在37°C下培养24h ；
培养碟中加入适量5mg/ml香菇多糖，至香菇多糖终浓度分别为(^g/ml、50(^g/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养24或36h ；
以IOOOg离心力离心20min收集细胞上清；
ELISA法检测IFN-α浓度方法同实施例I。已有大量研究表明香菇多糖具有免疫调节活性，图2所示结果与已有的动物及原代细胞检测结果基本一致，因此可以验证此检测方法的有效性。实施例3 :冬虫夏草多糖活性检测。用RPMI1640培养基配制lmg/ml的冬虫夏草多糖溶液；
用RPMI1640培养基将THP-I细胞密度调整至IO5-IO6个/ml ；
将调整好密度的细胞置于细胞培养碟中，在37°C下培养36h ；
培养碟中加入适量lmg/ml冬虫夏草多糖，至冬虫夏草多糖终浓度分别为OPg/ml、10M-g/ml> 100M-g/ml>200M-g/ml ；
37 °C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养48h ；
以IOOOg离心力离心20min收集细胞上清；
ELISA法检测IFN-α浓度方法同实施例I。已有研究表明虫草多糖具有免疫调节活性，图3所示结果与已有研究结果基本一致，因此可以验证此检测方法的有效性。实施例4 核糖核酸II生物活性检测
用RPMI1640培养基将核糖核酸II分别稀释10倍、100倍，配制不同浓度的核糖核酸
II ；
用RPMI1640培养基将THP-I细胞密度调整至IO5-IO6个/ml ；
将调整好密度的细胞置于细胞培养碟中，在37°C下培养培养24h ；
培养碟中分别加入等量不同浓度的核糖核酸II ；
37 0C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养48h ；
以IOOOg离心力离心20min收集细胞上清；
ELISA法检测IFN-α浓度方法同实施例I。
实验结果如图4所示，图4表明此方法对核酸免疫活性检测亦有效。 经实验表明，本发明也能够检测出除上述实验例之后的其它多糖和核酸的生物活性。
权利要求
1.一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤 1)取多糖或核酸样品，配制成多糖或核酸溶液； 2)取THP-I细胞，调整细胞密度至IO5 IO6个/ml； 3)取步骤2)得到的细胞液，加入步骤I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸终浓度达到10 μ g 20mg/ml，然后进行培养； 4)取步骤3)得到的培养物离心后收集细胞上清液； 5)取步骤4)得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN-α浓度，IFN-α浓度高低说明被检测多糖或核酸样品的生物活性高低。
2.如权利要求I所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤I)中用蒸馏水或RPMI1640培养基配制多糖或核酸溶液。
3.如权利要求I所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤2)中用RPMI1640培养基调整THP-I细胞密度。
4.如权利要求I所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤2)中调整细胞密度的THP-I细胞置于37°C下进行培养24 36h。
5.如权利要求I所述的一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤3)中加入多糖或核酸溶液后的细胞液置于37°C、CO2浓度5%的二氧化碳培养箱培养24 48h。
全文摘要
一种免疫调节多糖及核酸生物活性检测方法，属于生物检测技术领域。其包括以下工艺步骤1)取多糖或核酸样品，配制成多糖或核酸溶液；2)取THP-1细胞，调整细胞密度至105～106个/ml；3)取步骤2)得到的细胞液，加入步骤1)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸终浓度达到10μg～20mg/ml，然后进行培养；4)取步骤3)得到的培养物离心后收集细胞上清液；5)取步骤4)得到的细胞上清液用ELASA法检测IFN-α浓度。本发明的有益效果是实现了高通量有效检测多糖、核酸生物活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明为定量测定多糖或核酸生物活性提供了基础。
文档编号G01N33/68GK102901831SQ20121041217
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者吕正兵, 张晓菲, 舒建洪, 盛清, 陈健, 钱晨云 申请人:杭州宝康亿富生物科技有限公司