专利名称：用于膜分析的配有参照显示部分的试验装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用特异结合反应的用于膜分析的试验装置。
背景技术：
近年来，基于特异结合反应检测原理的试验装置实际不需要使用者进行技能性且耗时的程序，已越来越多地用于不同领域的试验，主要涉及临床诊断、环境分析和食品卫生控制。有多种类型试验装置基于特异结合反应的检测原理。其中用于膜分析的侧流型和流通型试验装置已广泛使用。在一种结构中，常用的侧流型试验装置为条状，并且包括多孔膜载体，液体可通过毛细管作用在载体内转移。将上面已固定能够特异结合到待测物质的物质(捕捉试剂)的检测显示部分提供到此膜载体的一部分上。另外，以能够通过毛细管作用在膜载体内转移的方式，在条的膜载体上游提供能够特异结合到待测物质的物质，此物质已用含酶(如过氧化物酶)或着色颗粒(如金胶体颗粒)的标记物质(标记试剂)标记。例如，在特异结合反应为其中抗原为待测物质的抗原-抗体反应时，能够特异结合到待测物质的抗体用作捕捉试剂，并且能够特异结合到待测物质的标记抗体用作标记试剂。在此情况下，当液体样品被提供到其中已提供标记试剂的条上游的部位时，液体样品开始与标记试剂接触，使标记试剂溶解或分散。如果待测物质存在于液体样品，已溶解或分散的标记试剂结合到此物质，以便形成“标记试剂-待测物质”复合体。“标记试剂-待测物质”复合体被进一步转移到条下游，达到检测显示部分。在检测显示部分，“标记试剂-待测物质”复合体被检测显示部分中的捕捉试剂捕捉，以便形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”夹心复合体。然后， 可目视观察在检测显示部分中组成这种夹心复合体的标记试剂的标记物质。为了确定待测物质的存在与否，可通过任意方式进行检测，如显色(参见专利文献1至4)。在一种结构中，常用的流通型试验装置包括液体可通过的多孔膜载体。将上面已固定能够特异结合到待测物质的物质(捕捉试剂)的检测显示部分提供到此膜载体上表面的一部分，并将吸水工具提供到膜载体的下表面上。例如，在特异结合反应为其中抗原为待测物质的抗原-抗体反应时，用作能够特异结合到待测物质的捕捉试剂的抗体已固定到膜载体的上表面的一部分上。在此情况下，在液体样品被提供到膜载体的上表面时，液体样品通过膜载体，以便由吸收工具吸收。如果待测物质存在于样品中，待测物质就会被提供到膜载体上表面的检测显示部分中固定的捕捉试剂捕捉，以便在检测显示部分中形成“待测物质-捕捉试剂”复合体。能够特异结合到待测物质的抗体已用含酶(如过氧化物酶)或着色颗粒(如金属胶体颗粒)的标记物质(标记试剂)标记，随后被提供到膜载体的上表面。 因此，使抗体能结合到已在检测显示部分捕捉的待测物质。因此，在检测显示部分形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”复合体。然后，可目视观察在检测显示部分中组成这种夹心复合体的标记试剂的标记物质。为了测定待测物质的存在与否，可通过任意方式进行检测， 如显色(参见专利文献5至7)。可将参照显示部分提供到以上试验装置，所述参照显示部分对操作者显示指示合理试验完成的参照试验结果。当样品中不存在待测物质时，此参照显示部分指示样品和标记试剂通过膜载体，即使在检测显示部分中检测不到标记物质。例如，在检测显示部分中检测不到待测物质的情况下，如果能够在参照显示部分中证明样品和标记试剂通过膜载体， 就证明合理试验完成。另一方面，如果在参照显示部分中不能证明样品和标记试剂通过膜载体或条，就可认为由于某些原因导致与样品或标记试剂相关的失效。这表明不合理试验完成。在此情况下，可认为所得试验结果无效。因此，要重新试验样品。在很多情况下，已使用一种试验装置，所述试验装置包括允许对标记试剂的抗原-抗体反应的参照显示部分。例如，在膜载体的参照显示部分中固定的与待测物质相同的物质或与待测物质相同的对标记试剂具有免疫特异反应性的物质(参见专利文献8)。然而，使用抗原-抗体反应的参照试验可能受样品中所含抗原的量、外来物质类型、PH和其他因素影响。这导致在某些情况下在参照显示部分中差的显示灵敏性和不清晰显示。因此， 期待具有显示改善的稳定性的参照显示部分的试验装置。有发明试验装置，其中利用对标记试剂为抗原-抗体反应以外的反应，在参照显示部分中使用成色剂或指示剂。例如，提供具有参照显示部分的侧流型试验装置，其中参照显示部分经构造，以便通过使滤纸能吸收成色剂并使该滤纸干燥指示反应完成，成色剂包括溴甲酚绿、2，5-二硝基苯酚或溴酚蓝(参见专利文献9)。在此情况下，在用水湿润成色剂时发生显色，指示反应完成。然而，在此方法的一种情况下，根据样品的PH，不发生成色剂的正常显色。在另一种情况下，即使发生正常显色，在样品通过参照显示部分时，成色剂也会随液体样品流出。因此，不能稳定进行参照试验。另外，有一种侧流型试验装置，其中进行参照试验，以便通过使滤纸能直接吸收用于染色的作为指示剂的染料指示反应完成，染料包括苯并红紫4B或刚果红(参见专利文献10)。然而，在此方法中，滤纸用于保持指示剂，因此，有必要使滤纸结合到试验装置中。因此，增加试验装置元件部分数，得到复杂组合体。另外，鉴于专利文献9和10中公开的发明难点进行了一个发明。该发明涉及一种侧流型试验装置，其中进行参照试验，以便通过使膜载体能吸收指示剂并使该膜载体干燥指示反应完成，指示剂包括在含酸低级醇溶液中溶解的酸性染料(包含至少一种曙红B、曙红Y、 焰红染料B和溴酚蓝)(参见专利文献11)。然而，在使用成色剂或指示剂的以上参照试验情况下，在液体样品以合理方式通过膜载体时可证明反应完成。然而，标记试剂以合理方式通过膜载体不能被证明。发明公开发明解决问题由标记抗体引起的抗原-抗体反应用于包括特异结合反应的膜分析的很多常规试验装置的参照显示部分。抗原-抗体反应可能受样品中所含抗原的量、外来物质类型、PH 和其他因素影响。这导致在某些情况下在参照显示部分中差的显示灵敏性和不清晰显示。 另外，在上面使用成色剂或指示剂的参照显示部分不能表明标记抗体以合理方式通过膜载体。本发明鉴于常规问题产生。本发明的目的是提供一种具有参照显示部分的试验装置， 所述参照显示部分以改善的精确度和稳定性快速并且清晰地显示合理试验完成。问题解决方法由于对达到以上目的方法的深入研究，本发明人发现，在用于包括特异结合反应的膜分析的参照显示部分使用阳离子物质允许快速和清晰显示参照试验结果，从而以改善的稳定性进行参照试验。这使本发明得以完成。以下具体描述本发明。[1] 一种用于膜分析的试验装置，所述试验装置利用待检物质与固定在膜载体上的捕捉试剂和用标记物质标记的试剂的特异结合反应，所述装置包括用于指示合理试验完成的在上面已固定用于捕捉标记试剂的阳离子聚合物的参照显示部分。[2] [1]的试验装置，其中所述参照显示部分构造成使膜载体能吸收阳离子聚合物，并使膜干燥。[3][1]或[2]的试验装置，其中所述特异结合反应为抗原-抗体反应。[4] [1]至[3]中任一项的试验装置，其中所述阳离子聚合物为聚合物化合物，其在主链或侧链上具有氨基或亚氨基，具有0. 4meq/g至21meq/g的阳离子电荷密度和300至 5, 000, 000的平均分子量。[5] [1]至W]中任一项的试验装置，其中所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺或其衍生物。[6] [1]至[5]中任一项的试验装置，所述试验装置为侧流型试验装置。[7] [6]的试验装置，其中所述指示合理试验完成的参照显示部分构造成位于在上面已固定捕捉试剂的检测显示部分的下游。[8] [1]至[5]中任一项的试验装置，所述试验装置为流通型试验装置。[9] [8]的试验装置，其中所述指示合理试验完成的参照显示部分构造成在平面上提供，上面已固定捕捉试剂的检测显示部分位于该平面上。[10] 一种用于膜分析的证明合理试验完成的方法，所述方法利用待检物质与固定在膜载体上的捕捉试剂和用标记物质标记的试剂的特异结合反应，其中通过使标记试剂结合到在参照显示部分中固定的阳离子聚合物，在膜上参照显示部分检测标记试剂标记时可证明合理试验完成。[11] [10]的方法，其中所述特异结合反应为抗原-抗体反应。[12] [10]或[11]的方法，其中所述阳离子聚合物为聚合物化合物，其在主链或侧链上具有氨基或亚氨基，具有0. 4meq/g至21meq/g的阳离子电荷密度和300至5，000, 000 的平均分子量。[13] [10]至[12]中任一项的方法，其中所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺或其衍生物。本说明书包括日本专利申请号2008-214226的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，所述申请为本申请的优先权文件。发明效果根据本发明，参照试验结果可更快更清晰地显示，基本不受样品中所含抗原的量、 外来物质类型、PH和其他因素影响。因此，可提供一种试验装置，所述试验装置包括与常规方法的情况比较具有改善精确性和稳定性的参照显示部分。另外，利用廉价的聚乙烯亚胺或聚烯丙基胺作为阳离子物质，可提供一种易制造试验装置，所述装置包括比常规方法的情况更快更清晰显示结果的参照显示部分。附图简述
图1显示本发明的一个实施方案的侧流型试剂盒的顶视图和横截面视图。图2显示本发明的一个实施方案的流通型试剂盒(1型)的顶视图和横截面视图。图3显示本发明的一个实施方案的流通型试剂盒O型)的顶视图和横截面视图。参考数字说明1 背片2 膜载体3 经浸渍元件4 样品提供元件5:吸水元件6 检测显示部分7 参照显示部分8 塑料皮氏培养皿9 吸水垫10 膜载体11 检测显示部分12 参照显示部分a =A型检测显示部分b =B型检测显示部分C:参照显示部分发明最佳实施方式以下详细描述本发明。本发明涉及用于膜分析的试验装置，所述试验装置基于与待测物质的特异结合反应的检测原理，其中阳离子物质用于作为膜载体的膜上定位的参照显示部分。试验装置包含能够特异结合到待测物质的捕捉试剂和能够特异结合到待测物质的用标记物质标记的标记试剂。待测物质与在试验装置的检测显示部分提供的捕捉试剂和标记试剂形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”夹心复合体。另外，试验装置提供有对操作者显示合理试验完成的参照显示部分。通过观察参照显示部分，操作者可证明合理试验执行和完成。可将参照显示部分称为“反应完成显示部分”或“证实部分”。在本发明中使用的术语“特异结合” 表示两种物质之间的选择反应性。例如，该术语表示特异免疫反应，如抗原-抗体反应，特异反应如受体及其配体之间的反应，或特异结合。此试验装置的实例包括流通型试验装置和侧流型试验装置。在流通型试验装置中，分析物穿过上述膜。在侧流型试验装置中，分析物展开，并沿膜转移。术语“膜分析”是指以下分析其中在膜类型载体上进行至少一个反应步骤，使得以上特异结合在载体上进行。在本发明中待检测的物质的实例包括但不限于病毒，如流感病毒、腺病毒、RS病毒、撤￥、冊￥、!1(^、!11￥工8￥、诺如病毒(norovirus)、轮状病毒和细小病毒或其成分或抗体； 细菌，如大肠埃希氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、副溶血弧菌、沙眼衣原体、溶血性链球菌、酿脓链球菌、百日咳杆菌、幽门螺杆菌、钩端螺旋体、梅毒密螺旋体、 龚地弓形虫、包柔氏螺旋体、炭疽和MRSA或其成分或抗体；一些物质，如支原体脂、人转铁蛋白、人白蛋白、人免疫球蛋白、微球蛋白、CRP、肌钙蛋白、β -葡聚糖和RF或其成分或抗体；肽激素，如人绒毛膜促性腺激素或其抗体；类固醇，如类固醇激素或其抗体；生理活性胺，如肾上腺素和吗啡或其抗体；维生素，如维生素B或其抗体；前列腺素或其抗体；抗生素，如四环素或其抗体；细菌等产生的毒素或其抗体；多种肿瘤标志物或其抗体；农用化学品或其抗体；以及多核苷酸或寡核苷酸序列(与病原微生物衍生的核酸序列互补)。术语“捕捉试剂”是指固定在膜上以结合到任何以上待测物质的试剂。此试剂用于捕捉待测物质。如果待测物质为抗原，可用抗该抗原的抗体作为捕捉试剂。如果待测物质为抗体，可用抗体结合的抗原作为捕捉试剂。另外，在使用其中存在配体-受体关系的物质时，其中任何一个均可为待测物质，而另一个可以为捕捉试剂。另外，如果待测物质为核酸，则可用具有与该核酸序列互补并因此可与该核酸杂交的序列的核酸作为捕捉试剂。根据本发明，术语“标记试剂”是指通过使足够标记物质结合到能够特异结合到待测物质的物质得到的缀合物。如果待测物质为抗原，可用抗该抗原的抗体作为能够特异结合到待测物质的物质。如果待测物质为抗体，可用该抗体结合的抗原作为能够特异结合到待测物质的物质。在使用其中存在配体-受体关系的物质时，其中任何一个均可为待测物质，而另一个可以为能够特异结合到待测物质的物质。另外，如果待测物质为核酸，则可用具有与该核酸序列互补并因此可与该核酸杂交的序列的核酸作为能够特异结合到待测物质的物质。可使用任何一般用于物质标记的标记物质。其实例包括金属胶体颗粒，如金胶体颗粒；非金属胶体颗粒，如硒胶体颗粒；树脂物质的颗粒，如有色胶乳颗粒；不溶性颗粒， 如染料胶体颗�：陀猩侍澹淮呋陨从Φ拿福缂钚粤姿崦负凸趸锩福挥馊玖希缓头派湫酝凰�。用于本发明的标记物质一般为市售产品。本发明检测装置的重要特征是阳离子物质用于参照显示部分。通过使阳离子物质固定于膜载体上，可提供参照显示部分。在此，通过使膜载体能吸收阳离子物质然后干燥， 可进行阳离子物质在膜载体上的固定。假定阳离子物质保持强正电荷，以使到达其附近的两性物(如蛋白质)带负电荷，随后，其通过负电荷和阳离子物质本身的正电荷之间的电作用捕捉该蛋白质。这可能是因为强阳离子物质附近的PH总是为碱性，这最终导致到达阳离子物质附近的两性物(如蛋白质)带负电荷。在本发明中使用的阳离子物质为强阳离子性，达到能够使到达其附近的两性物带负电荷的程度。与常规抗原-抗体反应引起的标记试剂结合不同，阳离子物质就结合方面而言没有选择性(即，特异性)。阳离子物质可吸收任何阴离子物质或在碱性条件下带负电荷的任何两性物。即，对于其中阳离子物质用于参照显示部分的本发明的装置，能够特异结合到待测物质的物质，其能结合到标记物质，为阴
7离子物质或在碱性条件下带负电荷的两性物。其实例为蛋白质，如抗体。然而，有一个问题是，结合标记试剂可能受结合样品中外来物质抑制。通过施加足量阳离子物质，可很容易解决这一问题。这是本发明的一个很重要的特征。通常，过量抗原、抗体等施加到膜载体倾向于影响结合体积或结合速率方面的特性。因此，待施加的抗体的量不能显著增加。这可能是因为抗原或抗体分子的表位或表位识别部位被不同抗原或抗体分子屏蔽。本发明利用电作用，因此，通过简单增加或减少待固定的阳离子物质的量，可控制结合体积。阳离子聚合物、阳离子表面活性剂等可用作待施加到参照显示部分的阳离子物质。例如，待使用的阳离子聚合物为聚合物化合物，其在主链或侧链上具有氨基或亚氨基，具有0. 4meq/g至21meq/ g(优选1. Omeq/g至21meq/g,更优选4. Omeq/g至21meq/g)的阳离子电荷密度，和300至 5，000, 000的平均分子量。此阳离子聚合物的实例包括聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺和聚乙烯基胺。聚乙烯亚胺的实例包括线形PEI和含伯胺、仲胺或叔胺的支化聚乙烯亚胺，并且可使用它们中的任何聚乙烯亚胺。另外，聚乙烯亚胺的分子量不受限制。也可包括经过化学改性 (例如脱酰)的聚乙烯亚胺。另外，聚烯丙基胺的实例包括聚烯丙基胺衍生物，如聚(烯丙基双胍-co-烯丙基胺)和聚(烯丙基-N-氨基甲酰基胍基-co-烯丙基胺)。阳离子表面活性剂的实例包括苯扎氯铵和十四烷基溴化三甲基铵。可使用以上物质的混合物。在以上实例中，就成本、容易生产和快速和清晰反应性而言，聚乙烯亚胺或聚烯丙基胺合乎需要。 待固定的以上阳离子物质的量不受限制。然而，物质以0.1%至10% (w/v)浓度制备。然后，将0. 1 μ 1至10 μ 1物质加到侧流型或流通型试验装置的膜，随后固定。在一种供选方法中，通过在部分试验装置的膜上布置由化学改性带正电荷的尼龙膜，使得它们相互重叠， 可给予此试验装置参照显示功能。以下描述本发明的试验装置的具体实施方案。本发明的试验装置可以为侧流型装置或流通型装置。侧流型试验装置的结构的具体实例显示于图1中。图1所示试验装置仅仅为实例， 因此，本发明的试验装置就结构或尺寸而言不限于图1所示结构。在图1中，数字参数1、 2、3、4、5、6和7分别表示背片、膜载体、经浸渍元件，样品提供元件、吸水元件、检测显示部分和参照显示部分。背片为由塑料等制成的片，并用于保持试验装置结构。膜载体2由带状硝化纤维素膜(具有5mm宽度和30mm长度)组成。捕捉试剂固定在离开膜载体2末端 7. 5mm的部位，层析展开开始侧上(图1中膜载体2的左端)，以便形成分析物检测显示部分6。可用包括物理吸附、化学结合等的已知方法作为在膜载体2上固定捕捉试剂的方法。 捕捉试剂以线形固定在膜载体2上，以便形成检测显示部分6。然而，也可以任何形式固定， 如圆形或方形。阳离子物质固定在离开膜载体2上检测显示部分6的4. Omm的部位，以便形成分析物参照显示部分7。与检测显示部分6的情况一样，对于参照显示部分7，可用包括物理吸附、化学结合等的已知方法作为在膜载体2上固定阳离子物质的方法。阳离子物质以线形固定在膜载体2上，以便形成参照显示部分7。然而，也可以任何形式固定，如圆形或方形。如图1的实例中所示，合乎需要地在上面已固定捕捉试剂的检测显示部分的下游形成参照显示部分。在本发明的侧流型试验装置中，溶液流从样品提供元件开始，并移向吸水元件。在本文中，术语“上游”和“下游”根据此流的方向定义。硝化纤维素膜为膜载体2 的实例所描述。然而，可使用任何膜，只要其允许层析展开试样中所含的分析物，并且上述捕捉试剂和阳离子物质能够固定在上面。可使用的膜的实例包括其他纤维素膜、尼龙膜和玻璃纤维膜。经浸渍元件3由用标记试剂浸渍的元件组成。包含合成纤维的5mmX8mm大小的带状非织造织物用于经浸渍元件3。然而，本发明不限于此。例如，也可使用纤维素织物(滤纸、硝化纤维素膜等)和含玻璃纤维、聚乙烯、聚丙烯等的多孔塑料织物。标记试剂用标记物质标记，并特异结合到待测物质。标记物质的实例包括但不限于色标记物质、酶标记物质和荧光标记物质。其中，通过视觉观察检测显示部分6的颜色变化，就快速和方便测定而言，优选使用色标记物质。除了金属胶体(如金胶体或钼胶体)外，色标记物质的实例还包括用着色剂(如红色或蓝色着色剂)染色的胶乳，如合成胶乳(例如，聚苯乙烯胶乳) 或天然橡胶胶乳。其中聚苯乙烯胶乳为特别优选。通过用标记试剂的悬浮体浸渍由含合成纤维等的以上非织造织物组成的元件，并使经浸渍元件干燥，可制备经浸渍元件3。如图1 所示，膜载体2结合到背片1的中部。经浸渍元件3的下游末端部分位于膜载体2末端部分之上或之下，在上面层析展开开始侧(以后称为“上游侧”(即，图1中的左侧)，而其相反侧被称为“下游侧”(即，图1中的右侧))上，从而使得经浸渍元件3连接到膜载体2。然后，使经浸渍元件3的上游部分结合到背片1。如此可制备本发明的侧流型试验装置。可将图1中所示条状装置称为“层析条”。在用抗原-抗体反应捕捉待测物质时，有时将该装置称为“免疫层析装置”或“免疫层析条”。另外，如有必要，也可使样品提供元件4的下游部分位于经浸渍元件3的上表面上，使得它们相互重叠，并使样品提供元件4的上游部分结合到背片1。也可使吸水元件5 的上游部分位于膜载体2的下游部分的上表面上，使得它们相互重叠，并使吸水元件5的下游部分结合到背片1。可使用的样品提供元件4的实例包括由多孔聚乙烯、多孔聚丙烯等的多孔合成纤维组成的非织造织物；纤维素纸，如滤纸和棉织物；织造织物；和非织造织物。吸水元件5为提供到样品提供元件4的液体样品流达到的元件。样品提供元件吸收并保持流动样品，使得分析物样品从上游快速流到下游。因此，吸水元件5可由能够快速吸收和保持液体的材料组成。此类材料的实例包括纤维素、玻璃纤维和由多孔塑料(如聚乙烯或聚丙烯)组成的非织造织物。具体地讲，纤维素为最适合材料。另外，图1中所示侧流型免疫层析装置可具有这样一种结构，其中层压材料片结合到用于保护的膜载体2的表面，或者，其中试样入口的开口和测定窗的开口在用于结合到壳的样品提供元件4、检测显示部分6和参照显示部分7的合适塑料壳上产生。在液体样品被提供到样品提供元件4时，该液体样品透过样品提供元件4，并通过毛细管作用转移到经浸渍元件3，然后，液体样品溶解经浸渍元件3中的标记试剂。如果待测物质存在于液体样品中，则该物质结合到标记试剂，以便形成“标记试剂-待测物质”复合体。此“标记试剂-待测物质”复合体进一步通过毛细管作用渗透，并转移到膜载体2，以通过检测显示部分6。此时，检测显示部分6中的捕捉试剂捕捉“标记试剂-待测物质”复合体，以便形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”夹心复合体。另外，不与待测物质反应的一部分标记试剂在检测显示部分6中不被捕捉，被进一步转移到位于模载体2下游的参照显示部分7。转移到参照显示部分7的标记试剂部分被参照显示部分7上固定的阳离子物质捕捉。在此情况下，液体样品中的一部分阴离子物质可能已结合到参照显示部分7上的阳离子物质。然而，这不太可能影响捕捉标记试剂。随后检测由检测显示部分6捕捉的标记试剂的部分和由参照显示部分7捕捉的部分。可根据相关标记方法选择检测标记试剂的最适合方法。例如，在用酶标记的情况下，提供底物用于显色。在用荧光物质或放射性同
9位素标记的情况下，使用专用装置进行测定。在用有色颗粒(如金胶体颗粒或胶乳颗粒) 标记的情况下，通过视觉观察确认聚集图像。在参照显示部分7检测标记试剂的标记时，这表明提供到样品提供元件4的液体样品已通过检测显示部分6，并达到参照显示部分7。因此，可以确定已正常进行分析。如果待测物质存在于液体样品中，则在检测显示部分6和参照显示部分7中检测到标记试剂的标记。如果待测物质不存在于液体样品中，则只在参照显示部分7中检测到标记试剂的标记。另外，在侧流型装置的另一个实施方案中有一种方法，其中样品提供元件4直接位于膜载体上，使得它们相互重叠，在其间没有经浸渍元件3，并且液体样品和标记试剂预先混合，将混合物提供到样品提供元件4。在液体样品和标记试剂预先混合时，液体样品中的待测物质形成“标记试剂-待测物质”复合体。下一步，将液体样品和标记试剂的混合物提供到样品提供元件4。因此，液体样品和标记试剂的混合物渗透样品提供元件4，并通过毛细管作用转移到膜载体。转移到膜载体的液体样品和标记试剂的混合物通过检测显示部分6。此时，液体样品和标记试剂的混合物中“标记试剂-待测物质”通过检测显示部分6 中的捕捉试剂捕捉，以便形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂，，夹心复合体。另外，未由捕捉试剂捕捉的一部分“标记试剂-待测物质”复合体和未反应部分标记试剂进一步转移到位于检测显示部分6下游的参照显示部分7，并捕捉于参照显示部分7中。对于流通型装置的具体实施方案，将图2中所示的结构描述为实例。图2所示试验装置仅仅为实例，因此，本发明的试验装置就结构、尺寸等而言不限于图2所示结构。在图2中，数字参数8、9、10、11和12分别表示35mm塑料皮氏培养皿、吸水垫、膜载体、检测显示部分和参照显示部分。将切成20mmX20mm大小的片的硝化纤维素膜(孔径3 μ m, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)用于液体可渗透膜载体10。在上面已固定捕捉试剂的分析物检测显示部分11提供于膜载体10上。可用包括物理吸附、化学结合等的已知方法作为在膜载体 10上固定捕捉试剂的方法。捕捉试剂以圆形固定在膜载体10上，以便形成检测显示部分 11。然而，也可以任何形式固定，如线形或方形。上面已固定阳离子物质的参照显示部分12 以这样一种方式提供到膜载体10上，使得参照显示部分12和检测显示部分11以其间一定距离存在于相同平面上。与检测显示部分11的情况一样，可用包括物理吸附、化学结合等的已知方法作为在膜载体10上固定参照显示部分12的方法。阳离子物质以圆形固定在膜载体10上，以便形成参照显示部分12。然而，也可以任何形式固定，如线形或方形。硝化纤维素膜用于膜载体10。然而，可使用任何膜，只要它允许层析展开试样中所含的分析物，并且上述捕捉试剂和阳离子物质能够固定在上面。可使用的膜的实例包括其他纤维素膜和含非织造织物、棉纤维、塑料纤维(如尼龙或聚氨酯纤维)或其混合纤维的膜。将具有足够尺寸(大于20mmX20mm尺寸的硝化纤维素膜)的吸水垫9放入塑料皮氏培养皿8中。另外， 膜载体10置于吸水垫9上，以便可以观察在上面已滴加和固定试剂的面(上表面)。液体样品加到膜载体10的上表面。膜载体10的上表面称为样品滴注面。吸水垫9为流动的提供的液体样品达到的元件。它作为吸水工具吸收和保持流动样品。对于与膜载体下表面接触的吸水工具，从脱脂棉或滤纸得到的纤维可形成吸水垫，并如图2的实例中所示使用。然而，可使用任何工具，如含吸水聚合物的药物或吸真空器，只要它能够吸收或吸出通过膜载体的液体。另外，在图2所示的实例中，使用塑料皮氏培养皿。然而，试验装置的结构不限于塑料皮氏培养皿。可使用任何结构，只要能够通过例如使它们结合到塑料装置中保持膜载体和吸水工具。在液体样品提供到膜载体10的上表面(样品滴注面)时，该液体样品通过膜，并由吸水垫9吸收。此时，如果待测物质存在于液体样品中，待测物质就会被检测显示部分11 中的捕捉试剂捕捉，以便形成“待测物质-捕捉试剂”复合体。下一步，能够特异结合到待测物质的用酶(如过氧化物酶)、荧光物质、放射性同位素、着色颗粒(如金胶体颗粒或胶乳颗粒)等(标记试剂)标记的物质提供到膜载体10的试剂滴注面，以使其能结合到已由检测显示部分11捕捉的待测物质。因此，形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”夹心复合体。 另外，一部分标记试剂部分被参照显示部分12中固定的阳离子物质捕捉。在此情况下，液体样品中的一部分阴离子物质可能已结合到参照显示部分12中的阳离子物质。然而，这不太可能影响捕捉标记试剂。随后检测由检测显示部分11捕捉的标记试剂的部分和由参照显示部分12捕捉的部分。可根据相关标记方法选择检测标记试剂的最适合方法。例如，在用酶标记的情况下，提供底物用于显色。在用荧光物质或放射性同位素标记的情况下，测定使用专用装置。在用有色颗粒(如金胶体颗粒或胶乳颗粒)标记的情况下，通过视觉观察确认聚集图像。如果待测物质存在于液体样品中，则在检测显示部分11和参照显示部分12 两者中均检测到标记试剂的标记。如果待测物质不存在于液体样品中，则只在参照显示部分12中检测到标记试剂的标记。另外，在一种方法中使用流通型装置的另一种结构，其中液体样品和标记试剂预先混合，然后，混合物被提供到膜载体的样品滴注面。在液体样品和标记试剂预先混合时， 液体样品中的待测物质形成“标记试剂-待测物质”复合体。下一步，将液体样品和标记试剂的混合物提供到膜载体的样品滴注面。液体样品和标记试剂的混合物通过膜载体，并由吸水工具吸收。此时，液体样品中的“标记试剂-待测物质”复合体由检测显示部分中的捕捉试剂捕捉。因此，形成“标记试剂-待测物质-捕捉试剂”夹心复合体。另外，一部分“标记试剂-待测物质”复合体和未反应部分的标记试剂捕捉于参照显示部分。如果在参照显示部分中检测到标记试剂的标记，则表明提供到样品滴注面的液体样品已通过检测显示部分11和参照显示部分12。因此，可以确定已正常进行分析。由本发明的试验装置检测的液体样品可选自以下实例临床液体样品，如尿、液状粪便、血液、血清、上呼吸道涂片和吸出流体；环境得到的含水样品；液体饮食，如饮用水； 和由微生物、固状粪便、土壤、污泥、固体食物、环境成分等溶解或悬浮于液体得到的溶液和乳液及其上清液。
实施例下面参照以下实施例更详细地描述本发明，虽然本发明不限于这些实施例。实施例1 制造侧流型试验装置1.制备胶乳标记试剂将具有0. 2 μ m平均粒径的蓝色聚苯乙烯胶乳颗粒(Ceradyne，Inc.)加入到预先用50mM MES缓冲液(pH 6.0)透析到0. 25% (w/v)最终浓度的抗腺病毒单克隆抗体溶液 (0.5mg/mL)。将生成物在37°C放置2小时，不时进行搅拌。下一步，在4°C在5，000X g进行离心15分钟，以去除上清液。将补加0. 5% (w/v)BSA的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7. 5)加到经沉淀的胶乳颗粒，使得胶乳颗粒的体积调节到初始体积。使胶乳颗粒再次分散，并在4°C放置16小时。在4°C在5，OOOXg再次离心15分钟，以去除上清液。使经沉淀的胶乳颗粒在三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH 7. 5)中分散到0. 1% (w/v)最终浓度。如此得到胶乳标记试剂。2.制备胶乳标记试剂浸渍的元件将玻璃纤维滤纸(Whatman)切成5mmX IOmm大小的片。滴加以上1中制备的胶乳标记试剂(5 μ L)，随后在37°C干燥3小时。如此得到经浸渍元件3。3.侧流型试验装置的组合体使用具有类似于图1所示结构的侧流型试验装置。用具有5mm(宽度)和30mm(长度)大小的硝化纤维素膜片(Millipore)作为膜载体2。用正压喷雾装置(BioJet ；BioDot)将杂交瘤细胞系衍生的抗腺病毒单克隆抗体溶液(5. Omg/mL)(不同于以上1中所述的溶液)作为捕捉试剂施加到载体，以便形成离开该载体1个长轴端(指定为上游端，而其相反端称为下游端)6mm的线。另外，将(w/v)聚乙烯亚胺P_70(Wako Pure Chemical hdustries，Ltd.)作为参照试剂施加到载体，以便在下游侧形成离开预先形成线4mm的线。随后，将载体在37°C条件下干燥3小时。如此形成检测显示部分6和参照显示部分7。下一步，使膜载体2以结合到与试剂施加面相反的面的方式结合到切成5毫米宽度的塑料背片I(BioDot)(在此情况下，背片1必须具有足够剩余长度，因为必须在膜载体 2的两端单独固定以上经浸渍元件3和以下的吸水元件幻。随后，经浸渍元件3以经浸渍元件3和膜载体2相互重叠Imm的方式结合到膜载体2上游侧的背片1上。然后，以样品提供元件4和经浸渍元件3相互重叠9mm的方式，使作为样品提供元件4的5mmX IOmm大小的滤纸片(Advantec Toyo Kaisha Ltd.)结合到背片。另外，以吸水元件5和膜载体相互重叠IOmm的方式，使作为吸水元件5的5mmX 30mm大小的厚滤纸(Whatman)结合到膜载体2下游侧的背片1上。最后，将从两端向外突出的背片的不需要部分切掉。如此得到图 1中所示的侧流型试验装置。4.抗原检测用含(w/v)Triton X-100和2% (w/v)盐酸精氨酸的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 8.0)作为展开剂，并用腺病毒CF抗原(Denka Seiken Co.，Ltd.)作为分析物进行模型试验。将腺病毒CF抗原用作为稀释溶剂的展开剂充分稀释。如此制备液体样品。将液体样品(IOOyL)加到小试管中。将以上3中制备的侧流型试验装置插入试管，使得样品提供元件4(在上游侧)向下放置。将试管竖直放在架中，并在室温放置。另外，对于阴性对照，单独用展开剂(IOOyL)进行类似试验。首先，使液体样品透过样品提供元件 4。随后，使其与经浸渍元件3中所含胶乳标记的抗体混合，混合物通过毛细管作用透过膜载体2。使已透过的液体样品和胶乳标记抗体的混合物按次序通过检测显示部分6和参照显示部分7，并最终由最接近下游端的吸水元件5吸收。如此完成反应过程。在足以形成线信号的时间(在此实施例中为20分钟)过去后，观察在硝化纤维素膜上检测显示部分6和参照显示部分7中出现的蓝线的存在与否和线特征(如宽度和色调)。因此，在其中已渗透液体样品的试验装置的检测显示部分6和参照显示部分7中分别观察到清晰的蓝线。利用稀释到1，000倍的含以上腺病毒CF抗原的溶液，可在检测显示部分6中证实阳性信号。同时，在其中已只渗透展开剂(用作阴性对照)的试验装置的情况下，在参照显示部分7中观察到清晰的蓝线，另一方面，在检测显示部分6中未显示线。因此证明，由使膜载体吸收阳离子物质并使载体干燥形成的参照显示部分也可显示强色线，因此足够作为参照显示部分。在此，在实施例1中使用的试验装置为利用抗原-抗体反应的免疫层析条。可使此免疫层析条结合到塑料壳，所得产品可用作免疫层析装置。实施例2 制造流通型试验装置1.制备金胶体标记试剂将预先用2mM硼酸钠水溶液透析的抗A型或抗B型流感病毒NP单克隆抗体 (100yg/mL) (1体积)加到用碳酸钾水溶液调节至pH 5. 5的金胶体溶液(BBI，粒径:40nm ； 氯金酸浓度0.01% ( 八))(9体积)(最终浓度1(^8/1^)，随后缓慢搅拌5分钟。随后向其中加入10% (w/v)BSA溶液(1体积)，随后进一步搅拌10分钟。随后，在4°C在14，OOOrpm 离心全部体积生成物30分钟，以去除上清液。将(w/v)BSA和补加150mM氯化钠的IOmM 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH 8. 5)加到经沉淀的金胶体颗粒，用于重新分散。稀释分散体，使得在530nm的吸光度变为2. 0。最后，将以上述方式制备的等量金胶体标记抗A型抗体和金胶体标记抗B型抗体一起混合，以便得到金胶体标记抗流感抗体。2.试剂施加到硝化纤维素膜使用具有类似于图3所示结构的流通型试验装置。将硝化纤维素膜(孔径3 μ m，Toyo Roshi Kaisha，Ltd.)切成20_X 20mm大小的片。用该片作为液体可渗透膜载体10。假定在此硝化纤维素膜中心画出IOmmX IOmm大小的方块，对应于此方块四个角的点从任意一个角开始以顺时针方向由“a”、“b”、“c”和“d”表不。抗A型和抗B型流感病毒NP单克隆抗体，已分别从不同于以上1中所述抗体的杂交瘤细胞系得到，分别预先用IOmM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析，以将浓度调节到:3mg/mL。将抗A型流感病毒NP单克隆抗体和抗B型流感病毒NP单克隆抗体分别以IyL 量滴加到硝化纤维素膜上的点“a”和“b”。因此形成A型检测显示部分“a”和B型检测显示部分“b”。随后，将聚乙烯亚胺 P-70(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (1 μ L) 滴加到点“c”，以便形成参照显示部分“C”。不向余下的点“d”加抗体，将点“d”指定为空白，并作为标记用于在试验完成后辨别点“a”、“b”和“C”的位置(或者，可用铅笔等在点 “d”标上小记号)。将上面已滴加试剂的硝化纤维素膜在37°C干燥3小时。3.流通型试验装置的组合体将具有大于以上膜载体10尺寸(20mmX 20mm)的纤维素吸水垫9 (Vessel Inc.) 放入35mm直径的塑料皮氏培养皿8中。另外，将膜载体10置于吸水垫9上，以便可观察在上面已滴加试剂的面(上表面)。如此得到流通型免疫层析装置。4.抗原检测用含5% (w/v)BSA,5% (w/v) Triton X-100 和 2% (w/v)明胶的 IOmM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)作为分析物稀释剂。用已充分稀释的A型流感病毒或B型流感病毒作为阳性分析物。用以上分析物稀释剂作为阴性分析物。将以上1中得到的金胶体标记抗流感抗体与以1 4比用上述分析物稀释剂稀释的各分析物混合。将各生成物(ImL)滴加到以上3中得到的试验装置的硝化纤维素膜上。 滴加缓慢地逐渐进行，并在室温放置膜载体10，直至在上面观察不到液体。然后确定从金胶体得到的红色点的存在与否。结果，A型流感病毒在A型检测显示部分“a”中在高至105pfu/mL检测到，此部分对于B型流感病毒得到阴性结果。B型流感病毒在B型检测显示部分“b”中在高至l(fpfU/ mL检测到，此部分对于A型流感病毒得到阴性结果。同时，在参照显示部分“C”的情况下， 不考虑分析物类型或浓度，在任何情况下都形成强色斑点，因此，证明此部分足以作为参照显示部分。实施例3 比较和检验参照显示试剂1.制备侧流型试验装置以实施例1中所述的方式，用以下7个类型试剂作为参照显示部分所用的候选试剂制造侧流型试验装置。(1)3. Omg/mL兔抗小鼠免疫球蛋白抗体(Dako)常规方法(2) 1% (w/v)聚乙烯亚胺 P_70(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.):阳离子物质(3)1% (w/v)聚烯丙基胺 HCl-IOS (Nitto Boseki Co.，Ltd.)阳离子物质(4) 1% (w/v)羧甲基纤维素(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)阴离子物质(5) 1% (w/v)丝胶蛋白(Toyo Boseki Kabushiki Kaisha)阴离子物质(6) 1% (w/v)聚乙二醇(Nacalai Tesque, Inc.)非离子物质(7)1% (w/v)聚乙烯醇(Nacalai Tesque, Inc.)非离子物质2.检验方法如实施例1中那样，用含(w/v) Triton X-100和2% (w/v)盐酸精氨酸的50mM 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 8.0)作为展开剂，用腺病毒CF抗原(Denka Seiken Co., Ltd.)作为分析物。用展开剂作为稀释溶剂充分稀释腺病毒CF抗原。将稀释100倍的分析物指定为强阳性分析物。将稀释500倍的分析物指定为弱阳性分析物。如此制备液体样品。按实施例1中所述的方式进行试验。观察到在各试验装置的参照显示部分7中出现的蓝线的存在与否和线特征(如宽度和颜色)。3.结果和讨论根据关于参照显示部分7中线的形成、此线出现的时间和此线对检测显示部分6 中出现的线的影响的比较，检验在相应参照显示部分7中已使用不同试剂的试验装置(表 1)。作为在⑴的常规方法的情况下观察的线与其他线(特别在⑵和⑶的情况下)比较的结果，阳离子物质得到的线显示比(1)的常规方法情况下观察到的更深且更清晰的色调。另外，线出现的时间短于(1)的情况。在涉及使用分别包含阴离子物质或非离子物质的参照试剂的其他情况下，不形成线，并且相关参照显示部分7不合理起作用。在(5)中使用的丝胶蛋白为含阳离子氨基酸残基的蛋白质。然而，该蛋白质分子整体上带负电荷。因此认为丝胶蛋白在以上情况下不作为参照显示试剂。另外，在使用任何以上参照显示试剂时，证明对相应检测线没有影响，与相关样品中抗原浓度无关。这可能是因为参照显示部分 7位于检测显示部分6下游。
[表1]
参照显示试剂检测线强度(强阳性分析物)检测线强度(弱阳性分析物)参照线强度参照线出现的时间(3次检测结果的平均值)参照线特征(1)++++++25 (秒)(2)+-H-+11 i"卜20细线，深色调(3)I I H++++15粗线，深色调(4)++++--(5)++++ x--(6)++++--(7)++++--阴性+:弱阳性(可检测为阳性，即使具有浅色调，并缺乏线清晰度)++:阳性(清晰阳性)+++ 强阳性(清晰阳性，具有特别深的色调)本文提到的所有公布、专利和专利申请均全文通过弓I用结合到本文中。
1权利要求
1.一种用于膜分析的试验装置，所述试验装置利用待检物质与固定在膜载体上的捕捉试剂和用标记物质标记的试剂的特异结合反应，所述试验装置包括用于显示合理试验完成的在上面已固定用于捕捉标记试剂的阳离子聚合物的参照显示部分。
2.权利要求1的试验装置，其中所述参照显示部分构造成使膜载体能吸收阳离子聚合物，并使膜干燥。
3.权利要求1或2的试验装置，其中所述特异结合反应为抗原-抗体反应。
4.权利要求1至3中任一项的试验装置，其中所述阳离子聚合物为聚合物化合物，其在主链或侧链上具有氨基或亚氨基，具有0. 4meq/g至21meq/g的阳离子电荷密度和300至 5, 000, 000的平均分子量。
5.权利要求1至4中任一项的试验装置，其中所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺或其衍生物。
6.权利要求1至5中任一项的试验装置，所述试验装置为侧流型试验装置。
7 权利要求6的试验装置，其中所述指示合理试验完成的参照显示部分构造成位于在上面已固定捕捉试剂的检测显示部分的下游。
8.权利要求1至5中任一项的试验装置，所述试验装置为流通型试验装置。
9.权利要求8的试验装置，其中所述指示合理试验完成的参照显示部分构造成在平面上提供，上面已固定捕捉试剂的检测显示部分位于所述平面上。
10.一种用于膜分析的证明合理试验完成的方法，所述方法利用待检物质与固定在膜载体上的捕捉试剂和用标记物质标记的试剂的特异结合反应，由此通过使标记试剂能结合到在参照显示部分固定的阳离子聚合物，在膜上参照显示部分检测标记试剂标记时可证明合理试验完成。
11.权利要求10的方法，其中所述特异结合反应为抗原-抗体反应。
12.权利要求10或11的方法，其中所述阳离子聚合物为聚合物化合物，其在主链或侧链上具有氨基或亚氨基，具有0. 4meq/g至21meq/g的阳离子电荷密度和300至5，000, 000 的平均分子量。
13.权利要求10至12中任一项的方法，其中所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺或其衍生物。
全文摘要
本发明提供一种具有参照显示部分的试验装置，所述参照显示部分以改善的精确度和稳定性快速并且清晰地显示合理试验完成。这种试验装置为用于膜分析的试验装置，所述试验装置利用待检物质与固定在膜载体上的捕捉试剂和用标记物质标记的试剂的特异结合反应，所述试验装置包含用于显示合理试验完成的在上面已固定用于捕捉标记试剂的阳离子聚合物的参照显示部分。
文档编号G01N33/543GK102197307SQ20098014276
公开日2011年9月21日 申请日期2009年8月21日 优先权日2008年8月22日
发明者前侧恒男 申请人:电化生研株式会社
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