专利名称：乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)基因分型的荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法及其试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害，机体细胞识别病毒抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受包括宿主与病毒的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，可能也从中扮演了重要的角色。不同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。从目前的研究来看，HBV C基因型与较重的肝脏病变相关，B型则与较轻的病变相关；A型与慢性肝炎相关，D型与急性自限型肝炎相关；其它基因型与疾病谱的关系还有待特殊发现。Kao发现C型与重症如肝硬化和肝细胞癌有关，B型多存在于年轻的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫清除阶段血清转化比B型延迟，同时C型比B型有更高的C基因启动子突变率。在抗病毒治疗中，B型比C型对拉咪呋啶敏感，不过两型产生药抗性的几率是一样的。Mayerat等比较了35例急性肝炎及30例慢性肝炎病人中的基因型分布，发现在慢性肝炎组中，A型占80％(28/35)，D型占11％(4/35)；急性肝炎组D型占80％(24/30)，A型占10％(3/30)，提示病毒基因型在病毒-宿主相互作用中有一定差异，这可能是因为基因型A所产生的抗原性要弱于基因型D，诱导机体产生免疫清除的能力也较弱，导致感染迁延。Lindh等对东亚地区的43名基因型为B和C的HBV慢性感染者的基因型及CP变异的研究表明，T1762变异更易出现在C基因型，感染C型后更易出现较重的肝脏炎症。
对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入细致的研究，现有研究表明不同亚型的HBV感染的临床病程和对治疗的反应都存在着一定的差异。病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一，乙型肝炎病毒变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可发生于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中利用RNA中间体，病毒聚合酶和逆转录酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人机体和不同的药物与不同的变异毒株长期相互作用表现出不同的基因型。虽然没有确切数据表明HBV的变异比例，但病毒变异是高频并永恒的，现在已经由最初的A～D四型发展到了A～H八型，病毒与机体的继续斗争将会出现更多的变异热点和基因型。尽管HBV分型、变异与临床表征有着一定关联度，但是目前仍然没有完全阐明清楚。大规模的系统流行病学分子特征普查将更有助人们认识HBV与机体以及药物的辨证关系，这就依赖于简便快速的HBV分型方法。
目前我国的HBV携带者众多，约占10％。在没有特效药的今天，治疗乙肝仍然难有一个普遍应用的标准方案，造成不同患者的治疗效果不一，长期的宿主携带和药物滥用会提高变异株出现的风险。乙型肝炎是病毒与机体免疫应答的主要结果，需要制订长期有针对性的治疗方案。对HBV进行基因分型以及变异热点的检测，在选择合适的药物或制订治疗方案等方面都有重要指导。目前临床检测市场迫切需要有相关成熟的技术方案尤其是针对病毒分子特征以及机理的方法，来进一步指导乙肝的临床治疗以及发现和构建特效药物，虽然有很多实验室都在研究HBV分型及变异的检测方法，但国内外市场上还是一片空白。
国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断；应用SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的PCR后产物电泳的方法也容易污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，最具有实用价值。基因芯片技术是近几年发展起来的新技术，它通过借鉴电子计算机机芯片阵列原理，利用核酸分子杂交和化学发光技术，使检测结果具有灵敏度高、所需样本微量和操作简便等特点，是一种先进的SSO法。理论上，利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的，不过费用较高，还在实验研究阶段，目前尚未见有基因芯片进行HBV基因分型的研究报道。
实时荧光PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。到目前止还未见荧光PCR用于HBV基因分型的报道。HBV的变异是绝对的，并且要不断的产生和累积各种变异，目前除了基因组全序列分析之外的所有方法都不能保证100％分型准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更有效又简便的乙型肝炎病毒基因分型的检测方法；本发明的另一目的在于提供用于该方法的试剂盒。
本发明在大量分析现有已分型的HBV DNA序列的基础上，找出HBV基因型的型特异性碱基的分布规律，采取了特异性引物和特异性探针结合的荧光PCR检测方法，既提高了分型灵敏度、准确度，又延续了荧光PCR检测方法的快速简便性能，实现了本发明的目的。
本发明的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法的技术特征在于，在按下述方法设计得到的探针和对应引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增，实现乙型肝炎病毒基因分型检测；所述的探针和引物的设计方法如下1.序列联配从GenBank中找出已作基因分型的HBV DNA全序列进行序列联配；2.根据序列联配结果找出HBV基因型的型特异性碱基的聚集区域；3.根据型特异性碱基的聚集区域确定型特异的HBV DNA序列片断；4.根据型特异的HBV DNA序列片断设计探针；5.根据探针设计引物。
本发明从GenBank中找出尽量多的HBV DNA全序列，计有530多条，其中已经作基因分型描述的有143条，其中A型23条，B型34条，C型52条，D型13条，E型3条，F型14条，G型2条，H型2条；把序列格式整理成FASTA格式；然后把已经作基因分型的143条序列提交到EBI(European Bioinformatics Institute，欧洲生物信息学研究所)作序列联配(Multiple Sequence alignment，又称多序列比对)以发现HBV DNA在变异累积以及进化上的微小区别。
我们分析序列联配结果在全序列范围上找出型特异性碱基(所谓型特异性碱基是指各型在同一位置上各自相对于其他型而异的碱基，也就是说例如在某一位置上A型绝大多数出现某一个固定的碱基，而其他型都不会是这一碱基)，再进一步找出各型HBV DNA型特异性碱基的聚集区域，本发明遵循的原则是100bp内至少有6个以上的型特异性碱基才认为是型特异性碱基聚集区域。型特异性碱基的分布多数是无规则分布的，但是长期的病毒进化发展及其与宿主的相互关系使病毒在某些区域呈一定规律的型特异性碱基分布，这是本方法分型的最基本依据。例如A型和D型，这两型有很明显的特征，A型在第2355碱基附近比其他型多出约6个碱基，D型在第2845碱基附近缺失约33个碱基。这种插入和缺失也同样被本发明视为是型特异性碱基。再仔细分析BC两型的型特异性碱基是B型在第1611～1677碱基之间存在型特异性碱基聚集区域，C型在第1314～1390碱基之间存在型特异性碱基聚集区域。
根据荧光PCR探针设计的一般原则设计探针(探针Tm值在68～70℃之间，GC含量在30％～80％之间，不能有连续出现的6个相同碱基，5’端不能为碱基G，避免二级结构)，使得探针尽可能包含型特异性碱基。在探针的基础上，根据荧光PCR引物设计的一般原则设计引物(引物Tm值要比探针低10℃左右，与探针同向的那一条引物应该与探针靠近，最好相隔不超过2个碱基，避免二级结构)，使得引物3’端最后一个碱基尽可能是型特异性碱基。以上描述主要针对B/C两型，对于A/D两型因为型特异性碱基差异太大，只要把探针设计在插入/缺失的几个碱基上就可以了。设计的引物探针与反应结果成正对应，即是说在某一型反应中有扩增就定为某一型。
本发明所述的探针和引物的设计方法适用于乙型肝炎病毒各基因型，但针对东南亚尤其是中国人常见的B、C、D和A型，下面仅给出这几个型最好的探针和引物的设计(FAM为发光基团，BHQ1为淬灭基团，冒号前是引物或探针的名称，后面是具体序列；各型引物探针分别是上游引物、探针、下游引物的排列方式)。
乙型肝炎病毒C基因型，其型特异的HBV DNA序列片段为GAAACTTATCGGCACCGACAACTCTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTG所述的引物和探针的序列为BVc1314priGAAACTTATCGGCACCGACAACBVc1340proFAM-CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCT-BHQ1BVc1390rpriCACAGCCTAGCAGCCATGG乙型肝炎病毒B基因型，其型特异的HBV DNA序列片段为AGACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAG所述的引物和探针的序列为BVb1611priAGACCACCGTGAACGCCCBVb1650rproFAM-AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTG-BHQ1BVb1677rpriCTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC乙型肝炎病毒D基因型，其型特异的HBV DNA序列片段为GTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTG所述的引物和探针的序列为BVd2811priGTGGGTCACCATATTCTTGGGABVd2835proFAM-CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC-BHQ1BVd2879rpriCAGAGGATTGCTGGTGGAAA乙型肝炎病毒A基因型，其型特异的HBV DNA序列片段为ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGG(A)GACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCTCGCCTC所述的引物和探针的序列为
BVa2322priATCAGTTCCGGAAACTACTGTTGTTABVa2349proFAM-ACGACGGGACCGAGGCAGGTC-BHQ1BVa2390rpriGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA本发明的荧光PCR反应与一般的荧光PCR反应一样，所需的荧光PCR反应液中含有PCR反应缓冲液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及探针和所对应的一对上、下游引物；上述物质的浓度都在通常的PCR反应所需的浓度范围内，所述的PCR反应缓冲液为1×PCR反应缓冲液包括10mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，50mmol/L KCl，5％甘油；Mg2+溶液浓度为2.5mmol/L；所述的dNTP浓度为0.2mmol/L；Taq DNA聚合酶为1U；探针浓度为0.12μmol/L；上、下游引物浓度各为0.6μmol/L；为预防污染PCR反应液中最好还含有尿嘧啶糖苷酶(UNG)0.1U。
本发明确定的PCR扩增条件为94℃ 1min→94℃ 5s→退火温度55～65℃ 30s，其中94℃ 5s→55～65℃ 30s之间进行30～50次循环；所述的退火温度最好为60℃，所述的循环最好为40次。依据本公司以往的经验，利用荧光PCR仪检测HBV，扩增的长度在200bp以内，可以采用两步法。因为PCR最关键的是退火温度，所以根据以上体系和已选择的引物探针尝试不同的退火温度，根据设计引物和探针的Tm值，在退火温度55～65℃范围内，对55℃、58℃、60℃、61℃和62℃五个温度的反应结果作比较，发现用60℃作退火温度适合98％的HBV DNA型特异性扩增，少数在60℃没有扩增的HBV DNA在调节到55℃后可以明确分型，少数B型C型都有扩增的HBV DNA在调节到61℃后可以明确分型。
本发明所需的乙型肝炎病毒DNA可以用通常的方法从血清样品中提�。詈貌捎帽痉⒚魈峁┑姆椒ǎ昙凳├�。
本发明标记探针的荧光染料是通常荧光PCR检测采用的，最好是FAM(Carboxyfluorescein，羧基荧光素，吸收波长492nm，发射波长518nm，绿色)；淬灭剂是BHQ1(Black Hole Quencher 1，一种叫黑洞的光吸收物质，其有效吸收光的波长在500-580nm。)。
本发明测定结果的判断引物和探针设计的期望结果判断是呈正对应的，即哪一型有荧光扩增就可判别为此型。因为A型和D型与其他型有比较明显的序列差异，所以在结果判断上，先看A/D型有否扩增，A/D型有扩增而B/C型都没扩增的就应是A/D型；A/D型没有扩增的前提下再看B/C型哪一个有扩增，就为哪一型。有时候会碰到BC都没扩增，这种现象通过降低反应退火温度(2～5℃左右)仍然可以再分型；有时候也有BC都有扩增的现象，这种现象通过升高反应退火温度(1～2℃左右)仍然可以再分型。不过这只针对中国人常见的ABCD型，对于都没有扩增的不能惘下断言，因为可能会是EFGH等型；对于都有扩增的也要谨慎，因为可能存在混合型病毒感染或者是不同型的HBV的嵌合体。所以推荐进行全序列分析。
一种用于本发明乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法的试剂盒，含有PCR反应液，包括PCR反应缓冲液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及由本发明上述方法设计的任一条探针和所对应的一对上、下游引物。上述物质的浓度都在通常PCR反应所需的浓度范围内，所述的PCR反应缓冲液为1×PCR反应缓冲液包括10mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，50mmol/LKCl，5％甘油；所述的Mg2+溶液浓度为2.5mmol/L；所述的dNTP浓度为0.2mmol/L；所述的Taq DNA聚合酶为1U；所述的探针浓度为0.12μmol/L；所述的上、下游引物浓度各为0.6μmol/L；PCR反应液中最好还含有尿嘧啶糖苷酶(UNG)0.1U。本发明试剂盒最好还含有DNA提取试剂，包括A液6mol/L异硫氰酸胍，30mmol/L柠檬酸钠，0.58％十二烷基磺酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，2％糖原；B液异丙醇；C液75％乙醇水溶液。
本发明效果及优点经过超过100份标本的验证，本发明方法分型准确度达到98％，通过调整反应条件可达到100％的准确度；比全序列分析方法简单快捷，实验流程少，耗时短，费用又低，又比常规的PCR及RFLP相关的方法准确，而且本发明方法封闭式的检测能有效的避免污染。
具体实施例方式
下列仅以中国人常见的HBV基因A、B、C、和D型实验为例进一步说明本发明，不应该当作对本发明的限制。
实施例1本发明乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR测定方法及其试剂盒。
1.试剂盒组成(1)DNA提取试剂包括A液6mol/L异硫氰酸胍，30mmol/L柠檬酸钠，0.58％十二烷基磺酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，2％糖原；B液异丙醇；C液75％乙醇水溶液。
(2)PCR反应试剂A型PCR反应液(每人份用量)加入量 终浓度10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，2.5μL 1×PCR缓冲液pH 8.9，500mmol/L KCl，50％甘油)25mmol/L MgCl22.5μL 2.5mmol/L5mmol/L dNTP 1μL 0.2mmol/L100pmol/μL A型引物1 0.15μL0.6μmol/L100pmol/μL A型引物2 0.15μL0.6μmol/L100pmol/μL A型探针 0.03μL0.12μmol/L5U/μL Taq酶 1U
1U/μL UNG 0.1U用纯化水定容至23μL。
所述的A型引物和探针的序列为引物1ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTA引物2GAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA探针ACGACGGGACCGAGGCAGGTCB型PCR反应液(每人份用量)除引物和探针为B型，其序列与A型的序列不同外，其它试剂及其浓度与A型PCR反应液相同。
所述的B型引物和探针的序列为引物1AGACCACCGTGAACGCCC引物2CTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC探针AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTGC型PCR反应液(每人份用量)除引物和探针为C型，其序列与A型的序列不同外，其它试剂及其浓度与A型PCR反应液相同。
所述的C型引物和探针的序列为引物1GAAACTTATCGGCACCGACAAC引物2CACAGCCTAGCAGCCATGG探针CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTD型PCR反应液(每人份用量)除引物和探针为D型，其序列与A型的序列不同外，其它试剂及其浓度与A型PCR反应液相同。
所述的D型引物和探针的序列为引物1GTGGGTCACCATATTCTTGGGA引物2CAGAGGATTGCTGGTGGAAA探针CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC(3)型别阳性标准品乙型肝炎病毒基因A型标准品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因B型标准品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因C型标准品(105～107copies/mL)、乙型肝炎病毒基因D型标准品(105～107copies/mL)。
2.乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR测定
(1)临床样本取样用无菌注射器抽取受检者静脉血1mL，注入无菌1.5mL离心管中，于室温静置2小时，转入4℃放置。如果没有明显的血清上清，则5000r/min离心5分钟，取上清转入另一无菌离心管中(注意勿带入红细胞)，即为血清标本。
(2)血清标本的DNA提取处理取120μL DNA提取A液于0.5mL离心管中，每管分别加入已检定为HBV DNA阳性的待检血清、阴性对照血清60μL，做好标记，混匀，98℃加热10分钟裂解；加入180μL DNA提取B液，充分混匀，13000r/min离心8分钟，去上清；加入150μL DNA提取C液，颠倒混匀数次，13000出r/min离心3分钟，吸弃上清(将200μL加样枪枪尖伸至管底一次吸干)，开盖室温放置5分钟晾干；加入15μL纯化水稀释混悬沉淀物，短暂离心使液体落于管底部，备用(提取所用A、B和C液见试剂盒)。
按上述试剂盒加入量分别取各型反应液于各个PCR反应管内，再分别加入2μL提取的DNA模板及各型的阳性对照品，整个反应体系为25μL，同时做空白对照；盖上管盖，将反应管置于全自动荧光PCR ABI7000检测仪中，参照仪器操作说明设定空白对照、各型阳性对照、待检样本等参数进行PCR反应。
荧光PCR反应条件设定94℃ 1分钟；94℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。荧光素设定为FAM。
3.结果判定综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，使仪器给出正确的结果。空白及阴性对照为阴性；各型阳性对照均为阳性。待测样本在A型反应液中有扩增即为A型，在D型反应液中有扩增即为D型；A/D型阴性的在B型反应液中有扩增即为B型，在C型反应液中有扩增即为C型。
实施例2临床实验本实验共检测了103份标本，其中A型1例，D型1例，B型46例，C型53例。有1例标本所有型反应液都为阴性，适当降低反应温度(55℃)再进行PCR反应，发现为C型。有1例B、C型反应都有扩增，提高反应温度(61℃)再进行PCR反应，发现也是C型。临床中也出现过多型HBV混合感染、或嵌合型HBV感染的情况，因此如果出现多个型反应液中都有扩增的情况，而反应条件的调整没能明显分型的话，应该进行HBV全序列分析。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于，在按下述方法设计得到的探针和对应引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的乙型肝炎病毒DNA进行PCR扩增，实现乙型肝炎病毒基因分型检测；所述的探针和引物的设计方法如下(1)序列联配从GenBank中找出已作基因分型的乙型肝炎病毒DNA全序列进行序列联配；(2)根据序列联配结果找出乙型肝炎病毒基因型的型特异性碱基的聚集区域；(3)根据型特异性碱基的聚集区域确定型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片断；(4)根据型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片断设计探针；(5)根据探针设计引物。
2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型为C基因型，所述的型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片段为GAAACTTATCGGCACCGACAACTCTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTG所述的引物和探针的序列为引物1GAAACTTATCGGCACCGACAAC引物2CACAGCCTAGCAGCCATGG探针CTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCT
3.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型为B基因型，所述的型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片段为GGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCATGGGGGACTGTTGGGGTGGAGCCCTC所述的引物和探针的序列为引物1AGACCACCGTGAACGCCC引物2CTGAAAGTCCAAGAGTCCTCTTATGC探针AGACCTTGGGCAGGTTCCGGTG
4.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型为D基因型，所述的型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片段为GTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTG所述的引物和探针的序列为引物1GTGGGTCACCATATTCTTGGGA引物2CAGAGGATTGCTGGTGGAAA探针CAAGAGCTACAGCATGGGGCAGAATC
5.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒基因型为A基因型，所述的型特异的乙型肝炎病毒DNA序列片段为ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGG(A)GACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCTCGCCTC所述的引物和探针的序列为引物1ATCACTTCCGGAAACTACTGTTGTTA引物2GAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA探针ACGACGGGACCGAGGCAGGTC
6.根据权利要求1～5中所述的任一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的PCR扩增条件为
94℃ 1min→94℃ 5s→退火温度55～65℃ 30s，其中94℃ 5s→55～65℃ 30s之间进行30～50次循环。
7.根据权利要求6所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的退火温度为60℃，所述的循环为40次。
8.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法，其特征在于所述的乙型肝炎病毒DNA提取方法如下取120μL DNA提取A液于0.5mL离心管中，每管分别加入待检血清、阴性对照血清60μL，做好标记，混匀，98℃加热10分钟裂解；加入180μL DNA提取B液，充分混匀，13000r/min离心8分钟，去上清；加入150μL DNA提取C液，颠倒混匀数次，13000rpm/min离心3分钟，吸弃上清，开盖室温放置5分钟晾干；加入15μL纯化水稀释混悬沉淀物，短暂离心使液体落于管底部；所述的A液包括6mol/L异硫氰酸胍，30mmol/L柠檬酸钠，0.58％十二烷基磺酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，2％糖原；所述的B液为异丙醇；所述的C液为75％乙醇水溶液。
9.一种用于乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有PCR反应液，包括PCR反应缓冲液，Mg2+溶液，dNTP，Taq DNA聚合酶，以及权利要求1～5中所述的任一组探针和所对应的一对上、下游引物。
10.根据权利要求9所述的一种用于乙型肝炎病毒基因分型的荧光PCR检测方法的试剂盒，其特征在于所述的PCR反应缓冲液为1×PCR反应缓冲液包括10mmol/L Tris-HCl，pH8.9，50mmol/L KCl，5％甘油；所述的Mg2+溶液浓度为2.5mmol/L；所述的dNTP浓度为0.2mmol/L；所述的Taq DNA聚合酶为1U；所述的探针浓度为0.12μmol/L；所述的上、下游引物浓度各为0.6μmol/L；所述的PCR反应液中还含有尿嘧啶糖苷酶0.1U；所述的试剂盒还含有DNA提取试剂，包括A液6mol/L异硫氰酸胍，30mmol/L柠檬酸钠，0.58％十二烷基磺酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，2％糖原；B液异丙醇；C液75％乙醇水溶液。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒(HBV)基因分型的荧光PCR检测方法及其试剂盒。其方法特征在于，从GenBank中找出已作基因分型的HBV DNA全序列进行序列联配；根据序列联配结果找出HBV基因型的型特异性碱基的聚集区域；根据型特异性碱基的聚集区域设计探针和一对引物。在该探针和引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的HBV DNA进行PCR扩增实现HBV基因分型检测。本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒和型别阳性标准品。本发明方法分型准确度达到98％，通过调整反应条件可达到100％；比全序列分析简单快捷，实验流程少，耗时短，费用低，又比常规的PCR及RFLP相关的方法快捷，准确，而且本发明方法封闭式的检测能有效地避免污染。
文档编号G01N33/52GK1588066SQ20041005123
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者白培胜, 黄茜华, 周荣 申请人:广州华银基因科技有限公司
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