专利名称：亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法。尤其是，涉及对免疫球蛋白纯化有用的结合有特定配体的亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法。
背景技术：
亲和色谱是将与以分离、纯化为目的的物质特异性地结合的物质(配体)固定于不溶性载体，并使用填充有所得配体固定化载体的柱的色谱，例如可用于蛋白质、核酸等生物体相关物质的分离、纯化(日本特开平6-281638号公报)。作为亲和色谱用填充剂的载体，例如使用由琼脂糖凝胶所代表的糖链的交联粒子、以合成聚合物为主成分的粒子。然而，在生物分离的用途中，通常重复使用填充剂。但是，纯化操作后在填充剂内 还残留有微量的夹杂物，因此通常进行作为就地清洗(CIP)而已知的操作。CIP中使用能够从填充剂中溶出夹杂物的试剂(CIP剂)。作为该试剂，例如可以举出氢氧化钠等碱性液。在使用氢氧化钠的情况下，可以有效地除去微生物、蛋白质、脂质以及核酸之类的夹杂物。专利文献专利文献I:日本特开平6-281638号公报
发明内容
但是，利用碱性液从填充剂中除去夹杂物时，填充剂被暴露于碱性条件下。就使用蛋白质作为配体的亲和色谱用填充剂而言，这样的碱性条件过于苛刻，有时产生由配体的不稳定化所致的结合容量降低。本发明的目的是提供耐碱性优异的亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法。就本发明的一种方式涉及的亲和色谱用填充剂而言，由下述通式(I)表示的蛋白质配体被固定于载体。R-R2.....(I)(式中，R表示由含有4 20个组氨酸连续的部位的4 300个氨基酸残基形成的氨基酸序列(也称为“组氨酸连接子”)，R2表示由含有蛋白A的Z区域(以下，简称为“Z区域”)或其片段(Z片段)或者它们的变异体的50 500个氨基酸残基形成的、可与免疫球蛋白结合的氨基酸序列(在这里，R2与R结合的末端是蛋白A的免疫球蛋白结合区域的C末端或N末端))其中，本申请说明书中，蛋白A是指金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁成分蛋白A (Protein A)。在上述亲和色谱用填充剂中，由上述通式(I)表示的蛋白质配体中的氨基可以通过与具有环氧基的上述载体进行环氧基开环反应而被固定化。这种情况下，上述载体可以含有取代2，3- 二羟基丙基作为开环环氧基。
本发明的另一方式涉及的离析免疫球蛋白的方法包括如下工序用上述亲和色谱用填充剂使免疫球蛋白吸附于上述填充剂的工序，使上述免疫球蛋白溶出的工序，以及用碱性液清洗上述填充剂的工序。在本发明中，“蛋白质”是指具有肽结构单位的所有分子，是包括例如将天然型蛋白质的部分片段、天然型蛋白质的氨基酸序列进行人工改变而成的变异体的概念。另外，“免疫球蛋白结合区域”表示单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽的功能单位，“免疫球蛋白结合蛋白质”表示对免疫球蛋白具有特异的亲和性且含有“免疫球蛋白结合区域”的蛋白质。“免疫球蛋白结合”表示与免疫球蛋白分子的互补性决定区(CDR)以外的区域、特别是Fe片段进行结合。在本发明中，与亲和色谱相关而被使用的用语“配体”表示与亲和色谱的靶物质结 合的分子。“蛋白质配体”表示与上述靶物质结合的部分是由蛋白质构成的配体。根据上述亲和色谱用填充剂，由于耐碱性优异，因此对碱性条件下的清洗具有高耐性。另外，在将上述亲和色谱用填充剂用于例如免疫球蛋白的纯化时，即使反复使用，免疫球蛋白的动态结合容量也难以下降，因此可以使得便宜的免疫球蛋白纯化成为可能。
图I是表示在本发明合成例2中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)的氨基酸序列的图。图2是说明插入表达载体(pETM-11)的、编码本发明合成例2的免疫球蛋白结合蛋白质的DNA片段的构成的图。图3是表示本发明的测定例2中的耐碱性评价结果的图表。
具体实施例方式就本发明的一个实施方式涉及的亲和色谱用填充剂而言，由下述通式(I)表示的蛋白质配体被固定于载体。R-R2.....(I)(式中，R表示由含有4 20个组氨酸连续的部位的4 300个氨基酸残基构成的氨基酸序列(组氨酸连接子)，R2表示由含有蛋白A的Z区域(Z区域序列号I)或其片段(Z片段)或者它们的变异体的50 500个氨基酸残基构成的、可与免疫球蛋白结合的氨基酸序列。在这里，R与R2的C末端或N末端结合)I.亲和色谱用填充剂I. I.载体I. I. I.构成载体的形状没有特别限定，可以采用近球状、包括粉体的粒子状、包括中空纤维的纤维状、膜状等任意的形状，但是从表面积大且制造也容易的方面考虑，优选粒子的形状。该粒子可以为多孔性，也可以为非多孔性。粒子状的载体可以用作填充床，也可以以悬浮形态使用。悬浮形态包含流动层(expanded bed,扩张床)以及作为纯粹悬浮物而已知的悬浮形态，粒子可以自由运动。在整体式、填充床和流动层的情况下，分离顺序一般按照根据浓度梯度的现有色谱法。在纯粹悬浮物的情况下，使用分批法。或者，载体可以是片、毛细管或膜之类的形态。构成本实施方式的亲和色谱用填充剂的载体具有优选为20 80 μ m、更优选为30 60 μ m的粒径(体积平均粒径)。如果粒径为20 μ m以上，则柱压力在高流速下难以升高。如果粒径为80 μ m以下，则蛋白质配体、抗体等生物体相关物质的结合容量难以下降。应予说明，本发明中的“粒径”是指利用激光衍射散射式粒度分布测定装置而得到的载体的体积平均粒径。构成本实施方式的亲和色谱用填充剂的载体优选为多孔，具有50 150m2/g、更优选为80 120m2/g的比表面积。在这里,如果比表面积为50m2/g以上,则蛋白质配体、抗体等生物体相关物质的结合容量难以降低。另一方面，如果比表面积为150m2/g以下，则填充剂的强度优异，在高流速下，填充剂难以被破坏，柱压力的上升得到抑制。本发明中的“比表面积”是指将具有利用水银孔隙率计得到的细孔径为10 5000nm的细孔的载体的表面积除以载体的干燥重量而得到的值。
在本实施方式中，构成亲和色谱用填充剂的载体具有优选为100 400nm、更优选为200 300nm的体积平均细孔径。在这里，如果体积平均细孔径为IOOnm以上，则高流速下的结合容量下降得到抑制。另一方面，如果体积平均细孔径为400nm以下，则不管流速如何，结合容量的下降都得到抑制。本发明中的“体积平均细孔径”是指利用水银孔隙率计得到的细孔径为10 5000nm的细孔的体积平均细孔径。在满足上述范围的粒径、比表面积、及细孔径分布时，成为纯化对象溶液的流路的载体间的间隙及载体内的细孔径、与纯化对象分子的结合表面积的平衡得到最优化，高流速下的结合容量被维持在高水平。作为载体的材质，例如是具有亲水性表面的聚合物，例如是在外表面(以及在存在的情况下也在内表面)具有羟基(-0H)、羧基(-C00H)、氨基羧基(-CONH2、或N取代型)、氨基(-NH2、或N取代型)、环氧基、低聚基团或聚乙烯氧基的聚合物。聚合物在一个实施方式中是聚(甲基)丙烯酸酯、聚(甲基)丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物之类的合成聚合物。该合成聚合物可以通过例如J. MATER. CHEM 1991，I (3)，371-374中记载的方法等公知的方法容易地制造。或者，也可使用T0Y0PEARL (东曹公司)之类的市售品。另一实施方式中的聚合物为葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰、琼脂糖等多糖类。该多糖类可以通过公知的方法容易地制造,例如参照日本专利第4081143号记载的方法。或者,也可以使用Sepharose (GEHealthcare Bio Sciences公司)之类的市售品。在其它实施方式中，也可以是二氧化娃、氧化锆等无机载体。在本实施方式的亲和色谱用填充剂中，作为载体使用的多孔性粒子的一个具体例，例如可以举出多孔性有机聚合物粒子，该多孔性有机聚合物粒子含有20 50重量％的交联性乙烯基单体、3 80重量％的含环氧基的乙烯基单体及20 80重量％的含二醇基的乙烯基单体的共聚物(其中，将各单体的合计量设为100重量％)，粒径为20 80μπι，比表面积为50 150m2/g,体积平均细孔径为100 400nm。应予说明，用水银孔隙率计测定构成本实施方式的亲和色谱用填充剂的载体时的细孔径为10 5000nm的细孔的浸入体积(细孔体积)优选为I. 3 2. 5mL/g。I. I. 2.与配体的结合
作为载体与蛋白质配体的结合方法，一般可以使用将蛋白质固定于载体的方法来进行。例如，使用具有羧基的载体，并使该羧基与利用N-羟基琥珀酸酰亚胺活化的蛋白质配体的氨基进行反应的方法；使用具有氨基或羧基的载体，并在水溶性碳化二亚胺等脱水缩合剂的存在下使之与蛋白质配体的羧基或氨基反应而形成酰胺键的方法；使用具有羟基的载体，并用溴化氰等卤化氰使之活化而与蛋白质配体的氨基反应的方法；或将载体的羟基进行甲苯磺酰化或Tresyl化，并与蛋白质配体的氨基反应的方法；以及利用双环氧化物(bisepoxide)、表氯醇等将环氧基导入载体中，并使之与蛋白质配体的氨基、轻基或硫醇基反应的方法；使用具有环氧基的载体，并使之与蛋白质配体的氨基、羟基或硫醇基反应的方法等。在本发明中使用的蛋白质配体是由后述通式(I)表示的配体，优选使用通过该蛋白质配体中的氨基与载体所具有的环氧基结合，从而使蛋白质配体与载体结合的方法。优选结合有配体的载体可以含有取代2，3-二羟基丙基作为开环环氧基。该开环环氧基可通过使上述载体与配体结合后，使剩余的环氧基开环而得到。优选在使用含有上述载体的本发明的填充剂之前，该载体的环氧基实质上被全部开环。 环氧基开环而生成的开环环氧基即醇性羟基发挥以下作用将载体表面进行亲水化、防止蛋白质等的非特异吸附、并在水中提高载体的韧性、防止高流速下的载体的破坏。作为载体中的环氧基的开环方法，例如可举出在水溶剂中利用酸或碱在加热或室温下搅拌的方法。另外，也可用巯基乙醇、硫代甘油等具有巯基的封端剂，单乙醇胺等具有氨基的封端剂来使环氧基开环。最优选的开环环氧基是利用硫代甘油使多孔载体中所含的环氧基进行开环而得到的开环环氧基。硫代甘油作为原料与巯基乙醇等相比毒性低，加成有硫代甘油的环氧开环基与利用具有氨基的封端剂的开环基相比具有非特异吸附低，而且动态结合量变高这样的优点。根据需要，可以在载体与配体之间导入任意长度的分子(间隔区)。作为间隔区的例子，可举出聚亚甲基链、聚乙二醇链、糖类等。I. 2.配体I. 2. I.免疫球蛋白结合蛋白质用于本发明的亲和色谱用填充剂的蛋白质配体可以是由上述通式(I)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。通过使该免疫球蛋白结合蛋白质(以下，也称为“蛋白质I”)例如与载体的环氧基反应，从而可使之与载体结合。在上述通式(I)中，由R表示的氨基酸序列是由含有4 20个组氨酸连续的部位的4 300个氨基酸残基构成的氨基酸序列。R所含的氨基酸残基数优选为8 100个，R所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数优选为4 8个。另外，在上述通式(I)中，R2是由含有蛋白A的Z区域(序列号I)或其片段或者它们的变异体的50 500个氨基酸残基构成的、能够与免疫球蛋白结合的氨基酸序列。由R2表示的氨基酸序列所含的氨基酸残基数优选为120 480个。在上述通式(I)中，由R表示的氨基酸序列以及由R2表示的氨基酸序列中的至少一方可以含有区域t，上述区域t由含有选自赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸中的I种氨基酸的I 50个氨基酸构成。在这种情况下，上述氨基酸序列中可含有多个相同或不同的区域t。另外，在上述通式(I)中，R-优选为由下述通式(2)表示的基团。
R1T-.....(2)(式中，R1表示由含有4 20个组氨酸连续的部位的4 100个氨基酸残基构成的氨基酸序列(在这里，在R1中，上述组氨酸连续的部位的末端与r结合)，r表示由7 200个氨基酸残基构成的任意的氨基酸序列)在上述通式(2 )中，由R1表示的氨基酸序列所含的氨基酸残基数优选为4 25个，R1所含的组氨酸连续的部位的组氨酸数优选为4 8个，由r表示的氨基酸序列所含的氨基酸残基数优选为10 50个。另外，上述通式(2)所示的r表示的氨基酸序列中可以含有TEV剪切部位。在本发明中，“TEV剪切部位”是指能够由TEV(烟草蚀纹病毒，Tobacco Etch Virus)蛋白酶作为特异性剪切部位进行识别的氨基酸序列，但不要求实际上能够由TEV蛋白酶所剪切。另 夕卜，在r表示的氨基酸序列中可含有TEV区域的变异体(与是否能够用该TEV蛋白酶剪切无关地，与TEV剪切部位的氨基序列具有70%以上、优选为90%以上的同源性)。构成蛋白质I的氨基酸残基的总个数为54 800,使之与载体结合时，优选为80 600。I. 2. I. I.免疫球蛋白结合区域在上述通式(I)中，R2表示包含免疫球蛋白结合区域的氨基酸序列。该氨基酸序列包含选自蛋白A的Z区域(Z区域)、其片段(Z片段)、以及它们的变异体中的至少I个氨基酸序列。关于Z区域,被记载于Nilsson B.等,Protein engineering, 1987年，第I卷,2号，107-113页)。Z区域由用序列号I表示的氨基酸序列构成。Z片段是指具有Z区域的氨基酸序列的一部分的片段，例如优选为具有Z区域的氨基酸序列的90%以上的片段，更优选为具有95%以上的片段。另外，Z区域的变异体是指例如与Z区域的氨基酸序列具有90%以上的同源性的变异体，优选为具有95%以上的同源性的变异体。优选Z区域的变异体为与Z区域相比耐碱性得到改良的变异体。在这种情况下，Z区域的变异体与Z区域相比耐碱性是否得到改良可用后述实施例记载的方法进行确认。作为Z区域的变异体，例如可举出具有专利第4391830号中记载的序列的蛋白质。例如，在专利第4391830号的权利要求I中举出了一种蛋白质,该蛋白质含有由序列号I规定的2个以上的重复单元(Z区域)，且23位的氨基酸残基为苏氨酸。另外，在本发明中，上述R2可将Z区域或其片段(Z片段)、或者它们的变异体单独含有或进行组合而含有2个以上(优选为4 10个)。优选上述R2由选自Z区域、Z片段、以及它们的变异体中的至少I个、或它们中的2个以上或者4 10个的组合构成。I. 2. I. 2.蛋白质I的制造作为用于制造蛋白质I的标准技术，例如可利用在Frederick M.Ausbel等的Current Protocols In Molecular Biology、Sambrook等编集的Molecular Cloning (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 3riedition, 2001)等中记载的公知的基因重组技术。即，将含有编码目标改性蛋白质(蛋白质I)的核酸序列的表达载体转化到大肠杆菌等宿主细胞，将该宿主细胞用恰当的液体培养基进行培养，从而可由培养后的宿主细胞大量且经济地获得蛋白质I。作为优选的表达载体，可以使用可在细菌内复制的已知载体中的任一种，例如可举出美国专利第5，151，350号说明书中记载的质粒、由Sambrook等编集的Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)等中记载的质粒。另外，为了通过向宿主中导入核酸而使宿主转化，可以利用在该技术领域中已知的任何方法，例如可利用由Sambrook等编集的Molecular Cloning (Cold Spring HarborLaboratory Press, 3rd edition, 2001)等中记载的公知的方法。培养经转化的细菌并将所表达的蛋白质回收的方法已由本领域技术人员所熟知，在本发明的实施例中也有例示。S卩，本发明的另一实施方式的核酸将免疫球蛋白结合蛋白质或其等功能变异体进行编码。在本发明中，免疫球蛋白结合蛋白质的“等功能变异体(functional variant)”是指如下免疫球蛋白结合蛋白质利用部分氨基酸的添加、削除、取代、氨基酸残基的化学修饰等得到改性，与改性前的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列保持70%以上、优选为90%以上的同源性，并且在免疫球蛋白结合活性上，可以作为与改性前的免疫球蛋白结合蛋白质同等的蛋白质进行操作。即，作为上述核酸，包含编码本说明书中的蛋白质I的核酸。另外，如上所述，蛋白质I可以是含有I个以上(优选为2 12个，更优选为4 10个)免疫球蛋白结合区域的蛋白质。编码这样的蛋白质的恰当的表达质�？梢杂帽痉⒚� 的实施例中所示的各种方法制作，可以容易地制造包含I个以上免疫球蛋白结合区域的蛋白质。例如，具有在后述实施例中所示的序列号2的氨基酸序列的蛋白质(SP4Z)或由在序列号2中缺失、取代或添加有I个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质适合作为本发明中使用的免疫球蛋白结合蛋白质。I. 2. I. 3.作用效果根据本实施方式的填充剂，对碱性条件下的清洗(例如使用了 O. 01 O. 2M的氢氧化钠等碱性液的清洗)具有高耐性。作为其理由，虽然未必清楚，但考虑如下理由通过将组氨酸连续的部位添加到Z区域，载体与Z区域的结合位置与没有组氨酸连续部位的情况不同；以及在固定化后的Z区域发生某种结构变化而使耐碱性变高等。I. 3.离析免疫球蛋白的方法对本发明的一个实施方式的离析免疫球蛋白的方法进行说明。本实施方式的离析免疫球蛋白的方法包括用上述本发明的亲和色谱用填充剂使免疫球蛋白吸附至该填充剂的工序(第一工序)，使该免疫球蛋白溶出的工序(第二工序)，以及用碱性液清洗该填充剂的工序(第三工序)。 在第一工序中，使含有免疫球蛋白的溶液在免疫球蛋白吸附于该填充剂的蛋白质配体的条件下在填充有上述亲和色谱用填充剂的柱等中流动。在这里，上述含有免疫球蛋白的溶液只要是含有免疫球蛋白的任意溶液即可，例如可举出血清等来自生物体的试样、杂交瘤细胞培养基的上清等。作为上述免疫球蛋白吸附的条件，例如可举出免疫球蛋白浓度O. I 10g/L、溶液的pH5 9、柱中的滞留时间O. 5 50分钟、温度O 40°C。在该第一工序中，溶液中的免疫球蛋白以外的物质中的大部分不被吸附而通过柱。通常，为了除去一部分弱保持的物质，将填充剂用含有NaCl等盐的中性缓冲液、例如磷酸二氢钠/磷酸氢二钠溶液、枸橼酸/磷酸氢二钠溶液、盐酸/三(羟甲基)氨基甲烷溶液、HEPES/氢氧化钠溶液等进行清洗。在第二工序中，使pH2 5的适当缓冲液、例如枸橼酸/枸橼酸钠溶液、乙酸/乙酸钠溶液、盐酸/甘氨酸溶液等流动而使免疫球蛋白溶出。在第三工序中，用碱性液清洗(CIP清洗)填充剂。作为在本实施方式的离析免疫球蛋白的方法中使用的碱性液，例如可举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、三乙胺、四丁基氢氧化铵等。实施例2.实施例以下，举出实施例，进一步具体说明本实施方式的亲和色谱用填充剂。另外，以下记载是概括性地表示本发明的方式，在没有特别原因的情况下，本发明不由该记载所限定。2. I.合成例I (多孔粒子的合成)将甲基丙烯酸缩水甘油酯(Mitsubishi Rayon公司制)8. 2g、三轻甲基丙烧三甲基 丙烯酸酯(Sartomer公司制)65. 9g和单甲基丙烯酸甘油酯(日油公司制)90. 6g溶解于2-辛酮(东洋合成工业公司制)245. Sg和苯乙酮(和光纯药工业公司制)62g中，添加2,2’ -偶氮二异丁腈(和光纯药工业公司制)2g,制备有机单体溶液。接着,在4240g的纯水中添加聚乙烯醇(可乐丽公司制PVA_217)8. 5g、十二烧基硫酸钠(花王公司制EMAL 10G)0. 43g和硫酸钠(和光纯药工业公司制)21. 3g，搅拌一晚，制备水溶液。接着，将得到的水溶液投入7L可拆式烧瓶内，安装温度计、搅拌桨以及冷却管，安置于温水�。诘障拢�600rpm开始搅拌。继而，利用温水浴加热可拆式烧瓶，在水溶液的温度达到85°C时，利用滴液漏斗将上述有机单体溶液添加至该水溶液，进行5小时的搅拌。接着将反应液冷却后，将该反应液移至5L的聚丙烯制瓶中，静置到粒子漂�。嘤嗟乃酉路轿《掀�。进而，在该反应液中加入丙酮，使粒子沉降。接着，将反应液静置3分钟，利用倾析除去丙酮。将该操作重复2次后加入水，使粒子沉降。进而，静置3分钟，进行倾析。将该操作重复2次，清洗粒子。进而，用丙酮再次置换粒子的分散液，风干一晚后，用真空干燥机进行干燥，得到多孔粒子(以下记为PB) 90g。PB的平均粒径为43 μ m，比表面积为83m2/g。2. 2.合成例2 (蛋白质配体的制作)2. 2. I.免疫球蛋白结合蛋白质的制作2. 2. I. I.免疫球蛋白结合蛋白质表达载体的构建用下述步骤(i) (iv)构建免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)表达载体。图2是说明SP4Z载体(SP4Z-pETMll)的构建方法的图。( i )步骤 I将编码单体Z区域的DNA作为起始物质，构建具有NcoI剪切部位和EcoRI剪切部位的单体Z区域载体(A-pETMll)。2. 2. I. 2. SPlZ-pETMll载体(有终止密码子的单体Z区域载体)的构建将SPZK DNA (序列号3)作为模板，使用引物153 (序列号5)作为正向引物，并且使用引物156 (序列号8)作为反向引物，实施PCR。引物153和引物156中各自包含NcoI剪切部位和SacI的限制性内切酶剪切部位。PCR的条件如下所述。阶段I :94°C I分钟I个循环，阶段2 :94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 2. 5分钟(25个循环)，阶段3 72°C 10分钟I个循环，然后保持在4°C。
PCR 生成物用 PCR 纯化试剂盒(illustra GFX-96PCR Purification Kit ；GEHealthcare Bio Sciences公司制)纯化,用1%琼脂糖TAE凝胶进行100V、45分钟的电泳。将得到的条带用凝胶提取试剂盒(illustra GFX PCR DNA Band Purification Kit ；GEHealthcare Bio Sciences公司制)纯化。接着，进行利用NcoI限制性内切酶和SacI限制性内切酶剪切的 pETMlI 载体(European Molecular Biology Laboratory)与 PCR 生成物的连接。利用限制性内切酶的消化反应是用New England Biolabs制NcoI限制性内切酶和SacI限制性内切酶，在37°C进行I小时，用电泳纯化后，用凝胶提取试剂盒纯化。连接反应是利用T4DNA连接酶(Invitrogen制)在室温下进行一整夜的。将用连接得到的载体用DH5a感受态细胞(Biomedal Life Science公司制)转化，将得到的转化体用含有卡那霉素的LB培养基于37°C培养一整夜，从一部分培养基中提取质粒，用DNA序列分析仪(3730 DNA Sequencer ；Applied Biosystems制)确认了插入的DNA片段的序列是正确的。2. 2. I. 3. A-pETMll载体(无终止密码子的单体Z区域载体)的构建 代替引物153、156，使用引物153作为正向引物，并且使用引物154 (序列号6)作为反向引物，与实验2. 2. 1.2.同样地构建A-pETMll载体。应予说明，DNA片段的插入是利用pETMll的NcoI剪切部位和EcoRI剪切部位的。(ii)步骤 2接着，在A-pETMll载体中再附加一个Z区域而构建具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的2聚体Z区域载体(AB-pETMll)。2. 2. I. 4. SP2Z-pETMll载体(有终止密码子的2聚体Z区域载体)的构建将SPZK DNA (序列号3)作为模板，使用引物155 (序列号7)作为正向引物，并且使用引物156作为反向引物，用PCR制备具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的单体Z区域的DNA，并插入到A-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位。实验是在与实验2.2. 1.2.相同的条件下进行的。2. 2. I. 5. AB-pETMll载体(无终止密码子的2聚体Z区域载体)的构建将SPZK DNA(序列号3)作为模板，使用引物155作为正向引物，并且使用引物157(序列号9)作为反向引物，用PCR制备具有EcoRI剪切部位和SacI剪切部位的无终止密码子的单体Z区域的DNA，并插入到A-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位来构建AB-pETMll载体。实验是在与实验2. 2. I. 2.相同的条件下进行的。(iii)步骤 3接着，在AB-pETMll载体中进一步再附加一个Z区域，构建具有SacI剪切部位和HindIII剪切部位的3聚体Z区域载体(ABC-pETMll)。2. 2. I. 6. SP3Z-pETMll载体(有终止密码子的3聚体Z区域载体)的构建将SPZK DNA (序列号3)作为模板，使用引物158 (序列号10)作为正向引物，并且使用引物161 (序列号13)作为反向引物，用PCR制备具有SacI剪切部位和XhoI剪切部位的单体Z区域的DNA，并插入到AB-pETMll的EcoRI剪切部位和SacI剪切部位。实验是在与实验2. 2. I. 2.相同的条件下进行的。2. 2. I. 7. ABC-pETMll载体(无终止密码子的3聚体Z区域载体)的构建将SPZK DNA(序列号3)作为模板，使用引物158作为正向引物，并且使用引物159(序列号11)作为反向引物，用PCR制备具有SacI剪切部位和HindIII剪切部位的无终止密码子的单体Z区域的DNA，并插入到AB-pETMll的SacI剪切部位和HindIII剪切部位来构建ABC-pETMll载体。实验是在与实验2. 2. I. 2.相同的条件下进行的。(iv)步骤 4最后，在ABC-pETMl I载体中附加第4个Z区域，构建具有Hindi 11剪切部位和XhoI剪切部位的SP4Z-pETMll载体。2. 2. I. 8. SP4Z-PETM11载体(有终止密码子的4聚体Z区域载体)的构建将SPZK DNA (序列号3)作为模板，使用引物160 (序列号12)和引物161，用PCR制备具有HindIII剪切部位和XhoI剪切部位的单体Z区域的DNA，并插入到ABC-pETMl I的HindIII剪切部位和XhoI剪切部位来构建SP4Z-pETMll载体。实验是在与实验2. 2. I. 2.相同的条件下进行的。
2. 2. I. 9. SP4Z的表达及纯化将得到的SP4Z-pETMll载体导入到E. coli (BL21株)细胞(STRATAGENE制)中，在18°C下添加ImM的IPTG(异丙基-β -D-硫代半乳糖批喃糖苷；Sigma_Aldrich制),孵育15小时，使其表达重组型免疫球蛋白结合蛋白质(蛋白质I)。诱导之前，将上述细胞于37°C孵育到吸光度(( 600)达到约0.6。蛋白质表达后，回收细胞，在pH8. O的Tris缓冲液中进行破碎。得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)由Ni亲和色谱(Ni-NTA (三乙酸胺)粒子，QIAGEN公司制)进行纯化。纯化的免疫球蛋白结合蛋白质由阴离子交换色谱(Q-Sepharose FF,GE Healthcare Bio Sciences 公司制)进一步纯化。由 SDS 凝胶电泳确认的免疫球蛋白结合蛋白质的纯度为96质量％。另外，得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)由飞行时间型质谱(MALDI-T0F/MS)分析确认分子量。将上述制备的免疫球蛋白结合蛋白质SP4Z的氨基酸序列示于图I。应予说明，在图I中，R和R2对应于上述通式(I)中的R和R2，R1和r对应于上述通式(2)中的R1和r。r中的下划线部分表示TEV剪切部位。另外，图I中的Z片段具有除去了由序列号I表示的Z区域的C末端的氨基酸残基APK的氨基酸序列。2. 2. 2. SP4ZwoHis 的制作在50mM Tris盐酸、O. 5mM EDTA (乙二胺四乙酸)和ImM DTT (二硫代苏糖醇)的缓冲液(ρΗ8· O) 15mL 中加 SP4Z 150mg、MobiTEV 蛋白酶(MoBiTec 公司)900U，在 30°C下搅拌12小时，剪切SP4Z的TEV剪切部位。使由TEV蛋白酶剪切的SP4Z通过Ni-NTA柱(容量4mL),回收SP4Z的组氨酸连接子被剪切的粗制SP4Zw0His。得到的粗制SP4Zw0His由阴离子交换色谱(Q-Sepharose FF, GE Healthcare Bio Sciences 公司制)在 ρΗ7· 5 的 HEPES 缓冲液中进一步纯化。将该蛋白质IwoHis通过离心浓缩器(Vivaspin20, Sartorius公司制)浓缩后，在IOmM HEPES缓冲液(pH7. 5)中透析12小时，制备了 SP4ZwoHis (序列号4)。2.3.合成例3 (免疫球蛋白结合蛋白质向粒子的固定化)2.3.1.固定化例 I制备I. ImL的PB、20mg的SP4Z分散于IOmL的O. IM磷酸缓冲液(pH6. 8)而得至Ij的混合液后，加入2. Ig的硫酸钠，在25°C下进行24小时的颠倒混和，使SP4Z与PB (甲基丙烯酸缩水甘油酯·三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯·甘油单甲基丙烯酸酯共聚多孔粒子)进行结合。将生成的粒子过滤后，与5M硫代甘油IOmL混合，在30°C下反应4小时，将剩余的环氧基封端，用PBS/0. 05%Tween20清洗后，用PBS清洗，得到I. ImL的SP4Z结合多孔粒子(SP4Z-PB)。2.3.2.固定化例 2在固定化例I中代替SP4Z而使用SP4Zw0His，除此以外，与固定化例I同样进行，得到了 I. Iml 的 SP4ZwoHis 结合多孔粒子(SP4ZwoHis_PB)。2.3.3.固定化例 3在固定化例I 中代替 PB 而使用 Epoxy-activated Sepharose6B (GE HealthcareBio Sciences公司制),除此以外,与固定化例I同样进行，得到I. Iml的SP4Z结合琼脂糖粒子(蛋白质1-AG)。 2.3.4.固定化例 4在固定化例I 中代替 PB 而使用 Epoxy-activated Sepharose6B (GE HealthcareBio Sciences公司制)，代替SP4Z而使用SP4ZwoHis，除此以外，与固定化例I同样进行，得到 I. Iml 的 SP4ZwoHis 结合琼脂糖粒子(SP4ZwoHis_AG)。2.4.试验例2. 4. I.测定例I (免疫球蛋白G (IgG)动态结合容量的测定)将SP4Z-PB、SP4ZwoHi s_PB、SP4Z-AG、SP4ZwoHi s_AG 分别填充于内径 0. 5cm 的柱中直至床高5cm。将各柱用20mM磷酸缓冲液(pH7. 4)平衡化后，使含有人多克隆IgG (5mg/mL)的20mM磷酸缓冲液(pH7. 4)以线性流速60cm/小时流动，在用吸光度检测器的情况下溶出液中的人多克隆IgG突破(Breakthrough) 10%时的人多克隆IgG吸附量，用填充剂体积除上述人多克隆IgG吸附量，求出填充剂的每单位体积的动态结合容量。将结果示于表
Io[表I]
填充剂IgG动态结合容量(mg/mL)~
SP4Z-PB37
SP4ZwoHis-PB33
SP4Z-AG24
SP4ZwoHis-AG182. 4. 2.测定例2 (耐碱性的测定)将测定例I中使用的填充有各填充剂的柱设置于低压色谱系统(AKTAprimeplus ；GE Healthcare Bio Sciences公司),使O. IM氢氧化钠IOml在柱内流动。将柱从装置取下，密闭后，在室温中放置一定时间后，与测定例I同样地测定线性流速60cm/小时下的人多克隆IgG的结合容量。求出将用O. IM氢氧化钠处理之前的人多克隆IgG结合量设为100%时的结合容量维持率。将其结果示于图3。
根据图3，结合了具有组氨酸连接子的免疫球蛋白蛋白质(SP4Z)的填充剂(SP4Z-PB、SP4Z-AG)与结合了不具有组氨酸连接子的免疫球蛋白蛋白质的填充剂(SP4ZWoHis-PB、SP4ZWoHis-AG)相比，碱接触时间变长，但结合容量的维持率下降小。因此，确认由上述通式(I)表示的蛋白质配体被固定化的填充剂的耐碱性优异。本发明不限于上述实施方式，可以进行进一步的各种变型。另外，本发明包括与实施方式中说明的构成实质上相同的构成(例如功能、方法和结果相同的构成、或者目的和结 果相同的构成)。另外，本发明包括将实施方式中说明的构成的非本质的部分置换而得的构成。另外，本发明包括与实施方式中说明的构成发挥相同作用效果的构成或能够实现相同目的的构成。另外，本发明包括在实施方式中说明的构成中附加了公知技术的构成。
权利要求
1.一种亲和色谱用填充剂，是由下述通式(I)表示的蛋白质配体被固定于载体的亲和色谱用填充剂， R-R2.....(I) 式中，R表示由含有4 20个组氨酸连续的部位的4 300个氨基酸残基构成的氨基酸序列，R2表示由含有蛋白A的Z区域或其片段或者它们的变异体的50 500个氨基酸残基构成的、可与免疫球蛋白结合的氨基酸序列；这里，R与R2的C末端或N末端结合。
2.根据权利要求I所述的亲和色谱用填充剂，其中，所述通式(I)表示的蛋白质配体中的氨基被固定于具有环氧基的所述载体。
3.根据权利要求2所述的亲和色谱用填充剂，其中，所述载体含有取代2，3-二羟基丙基作为开环环氧基。
4.一种离析免疫球蛋白的方法，包括如下工序 使免疫球蛋白吸附于权利要求I 3中任一项所述的亲和色谱用填充剂的工序， 使该免疫球蛋白溶出的工序，以及 用碱性液清洗该填充剂的工序。
全文摘要
本发明提供耐碱性优异的亲和色谱用填充剂以及离析免疫球蛋白的方法。本发明的亲和色谱用填充剂是由下述通式(1)表示的蛋白质固定于载体的填充剂。R-R2·····(1)(式中，R表示由含有4～20个组氨酸连续的部位的4～300个氨基酸残基构成的氨基酸序列，R2表示由含有蛋白A的Z区域或其片段或者它们的变异体的50～500个氨基酸残基构成的、可与免疫球蛋白结合的氨基酸序列。这里，R与R2的C末端或N末端结合)。
文档编号G01N30/88GK102834415SQ20118001456
公开日2012年12月19日 申请日期2011年3月23日 优先权日2010年3月24日
发明者田守功二, 福田哲夫, 宫路正昭, 王勇, 安陪毅由, 冈野友亮, 籾山昌辉, 河合孝广 申请人:Jsr株式会社
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