专利名称：灰树花多糖中淀粉含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及灰树花多糖提取物的测定方法，尤其涉及灰树花深层液体发酵液多糖提取物中非活性成分淀粉含量的定量测定方法。
本发明的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，由以下步骤组成1)除去脂溶性成分取烘干磨碎的待测多糖样品，分别称0.5～2克于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，再加入30ml乙醚，如此重复离心3次；2)除去可溶性糖类干扰物质向上述弃去上清液后的离心杯中加入50～60℃的80％乙醇30ml，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向离心后的杯中加入40～50℃蒸馏水30ml，在40～50℃恒温水浴中振荡60分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，再加入30ml蒸馏水，如此重复离心3次；3)酶法分解淀粉向步骤2)弃去上清液后的离心杯中加入5ml蒸馏水，湿润并搅拌分离出的样品，再加入80～90℃蒸馏水40ml，搅匀后，置沸水浴中处理50～60分钟使淀粉糊化；之后冷却至50℃，加入1％的糖化酶液10ml，并立即加入pH4～6的磷酸盐缓冲液25ml，再加入甲苯5～7滴，混匀，封口，置于45～48℃条件下保温20～24小时进行淀粉酶解；4)淀粉酶解检测取上述淀粉酶解液1滴加入碘溶液1滴进行酶解效果检测，若显蓝色、红色或紫色，即为淀粉酶解不完全，应再重复步骤3)的酶法分解淀粉，直至加碘溶液检测不显蓝色、红色或紫色为止，即为淀粉酶解完全；
5)淀粉酶解液处理将上述完全酶解的淀粉酶解液冷后，用6molL-1NaOH中和至中性，然后边搅动边逐滴加入饱和Pb(0Ac)2溶液，直至淀粉酶解液无白色絮状沉淀为止；再向淀粉酶解液中逐滴加入饱和的硫酸钠溶液，直至不产生白色沉淀为止；以4000-5000转/分钟离心5-10分钟，将上清液转移入容量瓶，调节pH为9.1～9.6，以测定需求量定容；6)斐林法测定还原糖含量取步骤5)中处理后的淀粉酶解液为样品，按GB5009.7-85《食品中还原糖的测定方法》直接滴定法，测定样品中可溶性糖的含量。
其中，上述步骤1)或2)所述的振荡时间是8～12分钟。
其中，上述步骤2)所述80％乙醇的温度是55～58℃。
其中，上述步骤2)所述加入的蒸馏水和恒温水浴的温度均为45～50℃。
其中，上述步骤3)所述磷酸盐缓冲液的pH为4.8～5.6。
其中，上述步骤3)所述进行淀粉酶解的温度是45℃，时间是20小时。
其中，上述步骤5)所述处理后的淀粉酶解液pH为9.3～9.5。
其中，上述步骤6)所述的食品中还原糖的测定方法包括如下步骤①标定碱性酒石酸铜溶液吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml(甲、乙液各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)；②样品溶液预测吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积；③样品溶液测定吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品溶液，使在2min内加热至沸，趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积。
采用本发明进行灰树花多糖产品中淀粉含量的测定，具有可操作性强、测定结果稳定可靠、测定结果的变异系数小、误差小、重现性高等优点。实验显示，根据样品中淀粉含量不同，变异系数一般在5％～10％范围内。可满足常规实验室对分析测试的要求以及相关企业对产品质量的控制要求。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
2)除去可溶性糖类干扰物质向上述弃去上清液后的离心杯中加入57℃的80％乙醇30ml，充分振荡15分钟，以5000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向弃去上清液后的离心杯中加入50℃蒸馏水30ml，在50℃恒温水浴中振荡60分钟，以5000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，再加入30ml蒸馏水，如此重复离心3次；3)酶法分解淀粉向步骤2)弃去上清液后的离心杯中加入5ml蒸馏水，湿润并搅拌分离出的样品，再加入90℃蒸馏水40ml，搅匀后，置沸水浴中处理55分钟使淀粉糊化；之后冷却至50℃，加入1％的糖化酶液10ml，并立即加入pH 5.2的磷酸盐缓冲液25ml，再加入甲苯5滴，混匀，封口，置于45℃条件下保温20小时进行淀粉酶解；4)淀粉酶解检测取上述淀粉酶解液1滴加入碘溶液1滴进行酶解效果检测，至结果为加碘溶液检测不显蓝色、红色或紫色为止，即为淀粉酶解完全；5)淀粉酶解液处理将上述完全酶解的淀粉酶解液冷后，用6molL-1NaOH中和至中性，然后边搅动边逐滴加入饱和Pb(OAc)2溶液，直至淀粉酶解液无白色絮状沉淀为止；再向淀粉酶解液中逐滴加入饱和的硫酸钠溶液，直至不产生白色沉淀为止；以4000转/分钟离心10分钟，取上清液转移入250ml容量瓶，调节pH为9.3，定容，设为V2；6)斐林法测定还原糖含量取步骤5)中处理后的淀粉酶解液为样品，按GB5009.7-85《食品中还原糖的测定方法》直接滴定法，测定样品中可溶性糖的含量。
①标定碱性酒石酸铜溶液吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值V0，计算每10ml(甲、乙液各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)；②样品溶液预测吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积；③样品溶液测定吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品溶液，使在2min内加热至沸，趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积V1。
同时，以同方法做试剂空白试验。
结果计算淀粉％＝V0*C/(1000mV1)*0.9*100％(式中淀粉含量以葡萄糖计)灰树花活性多糖中淀粉含量的测定实施例分析结果见附表1。
其中m1——10ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各5ml)相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量，mg；m——样品质量，g；V0——10ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各5ml)消耗的标准葡萄糖溶液体积，ml；V2——定容体积，mlV1——测定样品时平均消耗样品溶液体积，ml。
实施例21)除去脂溶性成分取烘干磨碎的待测多糖样品(编号为2号)，称0.943克、1.0392克、0.85克、0.9977克、0.9023克、0.9383克分别放于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡15分钟，以4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，再加入30ml乙醚，如此重复离心3次；2)除去可溶性糖类干扰物质向上述弃去上清液后的离心杯中加入50℃的80％乙醇30ml，充分振荡10分钟，以5000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向弃去上清液后的离心杯中加入40℃蒸馏水30ml，在45℃恒温水浴中振荡60分钟，以4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，再加入30ml蒸馏水，如此重复离心3次；3)酶法分解淀粉；向步骤2)弃去上清液后的离心杯中加入5ml蒸馏水，湿润并搅拌分离出的样品，再加入80℃蒸馏水40ml，搅匀后，置沸水浴中处理60分钟使淀粉糊化；之后冷却至50℃，加入1％的糖化酶液10ml，并立即加入pH 4.8的磷酸盐缓冲液25ml，再加入甲苯7滴，混匀，封口，置于48℃条件下保温24小时进行淀粉酶解；4)淀粉酶解检测取上述淀粉酶解液1滴加入碘溶液1滴进行酶解效果检测，至结果为加碘溶液检测不显蓝色、红色或紫色为止，即为淀粉酶解完全；5)淀粉酶解液处理将上述完全酶解的淀粉酶解液冷后，用6molL-1NaOH中和至中性，然后边搅动边逐滴加入饱和Pb(OAc)2溶液，直至淀粉酶解液无白色絮状沉淀为止；再向淀粉酶解液中逐滴加入饱和的硫酸钠溶液，直至不产生白色沉淀为止；以4800转/分钟离心7分钟，取上清液转移入250ml容量瓶，调节pH为9.5，定容，设为V2；6)斐林法测定还原糖含量取步骤5)中处理后的淀粉酶解液为样品，按GB5009.7-85《食品中还原糖的测定方法》直接滴定法，测定样品中可溶性糖的含量。
①标定碱性酒石酸铜溶液吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值V0，计算每10ml(甲、乙液各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)②样品溶液预测吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积；③样品溶液测定吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品溶液，使在2min内加热至沸，趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积V1。
同时，以同方法做试剂空白试验。
结果计算淀粉％＝V0*C/(1000mV1)*0.9*100％(式中淀粉含量以葡萄糖计)灰树花活性多糖中淀粉含量的测定实施例分析结果见附表2。
权利要求
1.一种灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，由以下步骤组成1)除去脂溶性成分取烘干磨碎的待测多糖样品，分别称0.5～2克于6个离心杯中，分别加入30ml乙醚，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，再加入30ml乙醚，如此重复离心3次；2)除去可溶性糖类干扰物质向上述弃去上清液后的离心杯中加入50～60℃的80％乙醇30ml，充分振荡5～15分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，如此重复离心3次；然后再向弃去上清液后的离心杯中加入40～50℃蒸馏水30ml，在40～50℃恒温水浴中振荡60分钟，以4000～5000转/分钟离心5～10分钟，弃去上清液，再加入30ml蒸馏水，如此重复离心3次；3)酶法分解淀粉向步骤2)离心弃去上清液后的杯中加入5ml蒸馏水，湿润并搅拌分离出的样品，再加入80～90℃蒸馏水40ml，搅匀后，置沸水浴中处理50～60分钟使淀粉糊化；之后冷却至50℃，加入1％的糖化酶液10ml，并立即加入pH4～6的磷酸盐缓冲液25ml，再加入甲苯5～7滴，混匀，封口，置于45～48℃条件下保温20～24小时进行淀粉酶解；4)淀粉酶解检测取上述淀粉酶解液1滴加入碘溶液1滴进行酶解效果检测，若显蓝色、红色或紫色，即为淀粉酶解不完全，应再重复步骤3)的酶法分解淀粉，直至加碘溶液检测不显蓝色、红色或紫色为止，即为淀粉酶解完全；5)淀粉酶解液处理将上述完全酶解的淀粉酶解液冷后，用6molL-1NaOH中和至中性，然后边搅动边逐滴加入饱和Pb(OAc)2溶液，直至淀粉酶解液无白色絮状沉淀为止；再向淀粉酶解液中逐滴加入饱和的硫酸钠溶液，直至不产生白包沉淀为止；以4000-5000转/分钟离心5-10分钟，将上清液转移入容量瓶，调节pH为9.1～9.6，以测定需求量定容；6)斐林法测定还原糖含量取步骤5)中处理后的淀粉酶解液为样品，按GB5009.7-85《食品中还原糖的测定方法》直接滴定法，测定样品中可溶性糖的含量。
2.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤1)或2)所述的振荡时间是8～12分钟。
3.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤2)所述80％乙醇的温度是55～58℃。
4.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤2)所述加入的蒸馏水和恒温水浴的温度均为45～50℃。
5.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤3)所述磷酸盐缓冲液的pH为4.8～5.6。
6.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤3)所述进行淀粉酶解的温度是45℃，时间是20小时。
7.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤5)所述处理后的淀粉酶解液pH为9.3～9.5。
8.如权利要求1所述的灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其特征在于，步骤6)所述的食品中还原糖的测定方法包括如下步骤①标定碱性酒石酸铜溶液吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml(甲、乙液各5ml)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)；②样品溶液预测吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积；③样品溶液测定吸取斐林试剂甲液及乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品溶液，使在2min内加热至沸，趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体积。
全文摘要
本发明公开一种灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其方法包括脂溶性成分除去，可溶性糖类干扰物质除去，酶法分解淀粉，淀粉酶解检测，淀粉酶解液处理，斐林法测定还原糖含量等步骤。本发明的方法具有可操作性强、测定结果稳定可靠、测定结果的变异系数小、误差小、重现性高等优点。
文档编号G01N31/16GK1474183SQ0313896
公开日2004年2月11日 申请日期2003年8月1日 优先权日2003年8月1日
发明者隋方功, 宋爱荣, 张玉娜, 吕银燕 申请人:莱阳农学院
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