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专利名称：一种基于uplc-ms技术诊断乙型肝炎的模型的制作方法
技术领域：
本发 明属于生物技术领域，是一种可用于诊断乙型肝炎的模型，为乙型肝炎的诊断提供了实验基础。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(hePatitis B)简称乙型肝炎、乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。因其可能通过性生活传播，国际上将其列入性传播疾病。临床表现多样化，包括急性、慢性、淤胆型和重症型肝炎，容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌。本病在中国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上，HBsAg阳性率约为10-15%。是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及青壮年。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化， 少数病人可转变为原发性肝癌。代谢组学(metabonomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。 UPLC-MS (超高效液相色谱-质谱联用)技术是代谢组学的分析技术之一。色谱主要是让混合物由流动相携带通过一根长长的内壁涂有薄薄的一层液膜(液态固定相)的毛细柱。由于混合物的不同组分与固定相的结合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各个组分会逐个地洗脱出来而达到分离的目的。质谱则是先将物质离子化，变为气态离子混合物，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的。具有较高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。本发明利用代谢组学中UPLC-MS这一技术，建立了一种可用于诊断乙型肝炎的模型，为乙型肝炎的诊断提供了实验基础。

发明内容
本发明利用Waters ACQUITY UPLC-MS系统，检测乙型肝炎患者和健康人血清的代谢物轮廓，利用软件分析乙型肝炎与正常人血清中不同的代谢产物，发现新的乙型肝炎相关性有机物，用于诊断乙型肝炎。本发明将乙型肝炎和健康人血清分别利用Waters公司UPLC-MS系统上机检测，得到原始数据，从机器附带的质谱库中找出相匹配的化合物。采用峰面积归一化方法进行数据校正，数据校正后运用统计学的方法计算每种化合物在不同组样品中差异的显著性，以P 值0. 05为阈值，判断P值小于阈值的化合物为检测含量有显著性差异的化合物，筛选出在两组中有显著差异的Peak。然后进行PCA分析，PCA是可以将分散在η维变量上的代谢指纹图谱信息集中到某几个综合指标(主成分)上的统计分析方法。通过这个分析可以初步判断样品之间的关系，并可以判断是否有个别样品的数据偏离较大而需要被剔除掉。最后确定出差异的标志性代谢峰有3个，其质荷比分别为m/Z203、m/Z250、m/Z996。利用这3种代谢物，将受检人血清中相应的物质的浓度与本发明模型的平均浓度逐一进行比对，可为乙型肝炎的诊断提供指导。模型的检测方法如下1.样品采集分别采集乙型肝炎组和正常对照组外周静脉血，离心后，取上清液置于_80°C保存2.色谱条件优化包括色谱流动相的选择，流动相梯度条件的优化，以及色谱柱温度和最佳流速的优化，以达到最佳的分离效果。3.质谱条件优化包括离子源类型的选择及其参数的设定，使得峰图更加优化。4.预实验及上样检测取预处理后的血清样品注入进样孔，进行相关系数的设置。5.测试报告的分析获得的原始数据经数据校正后，运用统计学方法找出含量明显差异的物质，运用 PCA分析，将偏离较大的物质剔除掉，最后得到标志性差异代谢物。


图1三个峰在各样本中的峰高灰色直线左侧为正常组，灰色直线右侧为乙型肝炎组。peak2. 78表示m/z250的代谢物，peak9. 526表示m/z996的代谢物，Peak2. 409表示m/z203的代谢物。图2发现的三个特征峰对正常组(normal)和乙型肝炎组(hePatitis B)的分类图中圆圈为正常组，棱形为乙型肝炎组。
具体实施例方式1.材料1. 1样品采集分别使用抗凝管采集正常组和乙型肝炎组外周静脉血anl，在4°C冰箱中静置 30min后离心(4000rpm，5min).取200ul上清液分装于低吸附离心管中，_80°C冰箱中保存，1. 2所需主要试剂与仪器甲醇、醋酸铵溶液、甲酸、丙酮等均购自上海化学试剂公司。ACQUITY UPLC-MS系统购自Waters公司。2.方法2.1高丰度蛋白的去除样品室温下融化，加入1. Oml的甲醇，涡旋混勻Imin后，超声波萃取2min。形成的悬浮液再离心14000rpm，IOmin, 10°C。最后取200ul上清液分装于LC-MS进样瓶中。2. 2样品吹干
将进样瓶置于液氮吹干仪中吹干。2. 3预实验取20ul的样品量进行预实验，调整相关系数，得到最佳的质谱图。2. 4正式实验将样品一个一个地注入UPLC-MS系统，打出图谱，得到原始数据。2. 5数据分析对原始数据进行校正，以0. 05的ρ值为阈值，运用统计学方法找出差异明显的物质，利用PCA分析，将偏差较大的物质剔除掉，最后得到3种标志性差异代谢物分别为m/ Z203、m/Z250、m/Z996。利用这3种物质，将受检人血清中相应的物质的浓度与本发明模型逐一进行比对，可为乙型肝炎的诊断提供辅助指导。实验实例取受检者血清，经检验得到其代谢产物图谱，得到质荷比分别为m/Z203、m/Z250、 m/z996的三种特异代谢物的峰高，与本实验中的对应样品的平均峰高进行比较，若峰高近似为本模型平均峰高的2倍，则为乙型肝炎组，否则为正常组。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.用于乙型肝炎诊断的模型，其特征在于由超高效液相色谱-质谱联用系统检测的代谢物图谱，经过软件统计分析得到乙型肝炎患者多个特异代谢物的峰高，所说的特异代谢物的质荷比分别为m/z203、m/z250、m/z996。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，是一种可用于诊断乙型肝炎的模型。本发明运用超高效液相色谱-质谱联用系统，检测正常人及乙型肝炎患者的外周血清样品，找出与乙型肝炎患者差异显著的特异代谢产物，根据正常人中三种特定代谢产物的峰高平均值，建立一个诊断模型。只要将检测人血清中三种相应的代谢产物的峰高与本发明的模型进行比较分析，就可以初步用于乙型肝炎诊断。
文档编号G01N30/88GK102207496SQ20101025811
公开日2011年10月5日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者曾华宗 申请人:上海聚类生物科技有限公司