专利名称：小反刍兽疫抗体检测的竞争elisa试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明公开了一种检测小反刍兽疫病毒抗体的竞争ELISA试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包含包被抗原反应液和单克隆抗体反应液构成的检测体系，属于生物技术领域。
背景技术：
小反刍兽疫是一种急性、烈性、接触性A类传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，发病率和致死率均非常高，为一种重大跨国传播的动物疫病。自1940年发现以来，该病先后在大多数非洲国家、阿拉伯半岛、以色列、叙利亚、伊拉克、约旦和土耳其等中东地区、以及南亚的印度半岛流行。以前由于我国不存在该�。远云溲芯糠浅Ｉ�。2007年7月26日，我国首次报道在西藏日土县热帮乡龙门卡村发生小反刍兽疫疫情，该病在我 国西藏地区的出现，对我国每年饲养量为3. 66亿只羊群(I. 96亿只山羊，I. 7亿只绵羊，2006年)构成严重威胁，控制和消灭该病在我国的蔓延和扩大是当前动物疫病的防控的主要任务，虽然及时采取有效手段扑灭了这次疫情，但也提醒我国必须加强相关研究以应对可能再次出现的疫情。因此，建立特异敏感的PPR诊断技术，对于本病的防制非常重要。我们必须加强对小反刍兽疫病毒的研究工作，特别是要加强小反刍兽疫的诊断技术，研发出具有快速、特异、敏感特性的诊断试剂盒，这对于控制小反刍兽疫在我国的流行和扩大，甚至彻底消灭该病都具有重要意义。N蛋白是构成核衣壳的主要成分，在病毒粒子和感染细胞中含量最丰富，分子量约为57. 7ku，由N基因编码。N基因只有I个开放阅读框(openreading flame，ORF)，编码525个氨基酸。小反刍兽疫病毒N蛋白C端在核衣壳表面，且可能与囊膜蛋白相连，其氨基酸序列与麻疹病毒属中其他病毒的同源性较低，只有17% 14%。N蛋白有4个主要区域氨基末段的I区、易变异的II区(123 144aa)、蛋白中部的III保守区以及IV区(421 525aa)。与麻疹病毒属其他成员相比，I区和III区比较保守，同源性约为75% 90%，而II区和IV区相对不保守，同源性只有17% 40%，研究发现针对N蛋白的单抗所识别的表位大多在IV区。N蛋白在病毒的复制和转录中有重要作用。新合成的mRNA翻译蛋白时，可以由转录转变为复制，新生RNA和N蛋白结合，此结合物就是下一次转录的模板。此外，由N蛋白组成的核衣壳包裹着RNA，使核糖核酸酶I不能破坏病毒RNA。采用小剂量纯化的原核表达的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠，发现N蛋白中有一个细胞毒性T细胞(CTL)位点，只有9个氨基酸，能够诱导机体产生受MHC I类分子限制的CTL反应。N蛋白在病毒蛋白中免疫原性最强，免疫活性部位位于C末端，在动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，但是此类抗体不能中和病毒。在F和H蛋白的诱导下，N蛋白的保护性免疫可显著增强。N蛋白在PPR血清学诊断中具有重要作用，常作为检测抗原。例如用昆虫细胞表达的重组N蛋白建立了间接ELISA方法；用PPRV的N蛋白制备的单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA法，用于检测病毒抗原；用N蛋白的单抗也可建立检测PPRV抗体的竞争ELISA方法，目前该方法广泛应用于PPR检测。
诊断方法研究进展除了传统的临床诊断方法，目前已经研究出多种针对PPRV的诊断技术，这些方法包括病毒中和试验(VN)、琼脂扩散(AGID)、免疫荧光抗体试验(IFAT)和对流免疫电泳(CIEP)等。随着免疫学和分子生物学的在动物疫病诊断中的应用和发展，目前已有PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)和其它分子生物学检测方法等多种PPR检测方法，其中间接竞争ELISA (cELISA)和PCR方法是OIE推荐的检测方法。病毒抗体检测方法间接ELISA(Indirect ELISA, iELISA)Balamurugan等(2007)建立的检测PPR血清抗体的iELISA,利用纯化的Sungri96PPR弱毒作为抗原。以标准cELISA试剂盒和iELISA同时检测1544份羊血清样品，与 cELISA相比，iELISA的相对特异性和敏感性分别达到95. 09%和90. 81% M VNT为对照检测658份羊血清样品，iELISA的相对特异性和敏感性分别为100% (388/388)和80%(216/270)。该研究结果表明建立的间接ELISA可快速检测大规模血清样本，比cELISA成本低，可替代cELISA用于PPRV抗体的血清流行病学调查。贾凤芹等研究利用原核表达的PPRV核衣壳蛋白(N)作为标准抗原，建立了 PPRV血清抗体检测方法。通过批内及批间重复性试验，重复变异系数CV%为3. 1%，并能与赤羽病、蓝舌病进行鉴别。竞争ELISA (complete ELISA, cELISA) 由于感染PPRV的动物血清中的抗体有相当一部分是针对N蛋白和H蛋白的，因此已经研制出许多针对PPRV和RPV的N、H蛋白的竞争ELISA试验方法，并且该方法已成为OIE的标准检测方法之一。Libeau G应用重组杆状病毒表达的N蛋白建立了 cELISA检测方法，单抗和待检血清抗体竞争性地结合抗原，用于检测PPRV抗体，这样可以提高试验的特异性。Saliki等1993年建立了针对PPRV H蛋白的阻断ELISA (B-ELISA)方法，与竞争ELISA原理基本一致,都是两种抗体竞争结合同一抗原表位。但是在cELISA方法中,样品和检测抗体同时与抗原结合，而B-ELISA是先将样品和抗原反应，然后再加入检测单抗，所用的时间要比cELISA方法长。Singh等于2004年又制备了一株针对PPRV H蛋白中和表位的单克隆抗体，建立了竞争ELISA的检测方法。与VNT相比，更加方便快捷。但也存在一些缺点，例如不能区分RPV与PRRV。其后韩国科学家Choi等(2005)又发展出了一种快速竞争ELISA (rapid cELISA)用来检测PPR。该方法是在包被了 PPRV重组核衣壳蛋白(rPPRV-N)的反应皿中，将血清与单抗混合孵育30min，然后对单抗进行定量。检验了 249个PPRV阳性血清和733个阴性血清样品，相对特异性与敏感性分别达到了 98. 5%和93. 4%。用该方法检测免疫了 RPV的高免血清，VNT彡I 512时，检测结果呈阳性，但显示的抗体滴度非常低，只有I : 2-1 16。如果VNT彡I 128，则检测结果呈阴性，说明该方法能较好的区分PPRV与RPV感染。Misbah Aslam等对琼脂糖凝胶免疫电泳方法(AGID)和cELISA两种血清学方法进行比较，发现与AGID相比，cELISA检测方法具有更高的特异性和敏感性。在对照正确的情况下，cELISA检测出的阳性样品用AGID法检测往往呈阴性
发明内容
为了快速诊断小反刍兽疫病情，本发明采用如下的技术方案“本发明一方面涉及一种小反刍兽疫重组N蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括采用上游引物5' CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT 3'和下游引物 N-DN :5'ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3'，分别在上下游引物5'端引入酶切位点EcoR I和Sal I ;通过RT-PCR方法从小反刍 兽疫细胞毒RNA中获得N基因的0RF，构建其原核表达载体PGEX-4T-1，将重组质粒转化BL-21宿主菌，进行小反刍兽疫重组N蛋白抗原表达并提取抗原。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于BL-21宿主菌在IPTG的诱导下进行表达。本发明还涉及将所制备的小反刍兽疫重组N蛋白抗原在制备小反刍兽疫抗体检测试剂盒中的应用本发明另一方面还设计一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒，包括采用上述方法所制备得到的小反刍兽疫重组N蛋白抗原、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A&B、终止液。在本发明的一个优选实施方式中，试剂盒的盒体内装有酶标板8X12孔，小反刍兽疫重组N蛋白抗原I μ g、封闭液4. 5ml,单抗反应液5ml,酶结合物5ml,阳性血清O. Iml,阴性血清O. Iml，浓缩洗涤液125ml (25倍)，底物5ml，终止液5ml。上述各种液体分别装在小瓶内，其中所述的酶标封闭液为I % BSA溶液(lg BSA加入100ml PBS pH7. 4);单抗反应液为适合倍数稀释的小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体；酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠酶标二抗；浓缩洗涤液为含O. 05%吐温-20的25倍浓缩的PBST液；底物为已加入H202的TMB溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的2mol/L H2S04溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为11 89。采用本发明的试剂盒能够分别检测不同病毒阳性血清，包括羊痘、羊口疮、亚洲I型口蹄疫、O型口蹄疫阳性血清，计算PI值均小于50%，检测结果都是阴性，说明本方法与这些病毒阳性血清不发生交叉反应，特异性较好。
具体实施例方式一.小反刍兽疫重组N蛋白抗原的制备设计N 基因引物，N-UP 5' CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT 3'，N-DN 5/ ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3'，分别在上下游引物5'端引入酶切位点EcoR I和SalI ;通过RT-PCR方法从小反刍兽疫细胞毒RNA中获得N基因的0RF，构建其原核表达载体PGEX-4T-1。将重组质粒转化BL-21宿主菌，在IPTG的诱导下进行高效表达并提取蛋白抗原。二 .针对PPRV N蛋白单克隆抗体的制备和鉴定I 材料I. I抗原、细胞系及试验动物抗原原核表达纯化的重组GST-N，PPRV疫苗株；细胞系SP2/0株骨髓瘤细胞，由兰州兽医研究所保存；试验动物清洁级5周龄雌性BALB/c小鼠，购自兰州生物制品研究所。I. 2 试剂弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、8-氮鸟嘌呤、HAT购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自中衫金桥公司；RPMI-1640培养液购自�？寺」荆惶ヅＱ�(FBS)，购自GIBCO公司；青霉素购自中诺药业有限公司，链霉素购自大连美罗药厂；酶标底物 TMB 购自 promega 公司；Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit,购自Roche公司；二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG2000)，购自Merck公司；各种型号细胞培养板，96孔酶标板，购自Costar公司；细胞冻存管购自CORNING公司。I. 3溶液及培养基50%PEG2000溶液称取 IOg PEG2000，10磅高压 25min，冷却至 50 60°C，加 IOmL 不完全培养基RPMI-1640,混勻，调pH至7. O 7. 4,分装于高压过的2mL eppendorf管,每管lmL，4°C保存备用。A贮存液(氨基蝶呤液)称取3.5mg Aminopterin，加高压过的三蒸水180mL,轻轻震荡至完全溶解,最后加水至200mL,0. 22 μ m滤器过滤,分装于高压过的2mLeppendorf管，每管ImL, -20°C保存备用。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100 X，H :10-4mol/L ；T :1. 6Χ 10_3mol/L):称取 0. 054g Hypoxanthine, O. 016g Aminopterin,加高压过的三蒸水 40mL,待溶解后
O.22 μ m滤器过滤,分装于高压过的2mLeppendorf管,每管ImL, _20°C保存备用。8-氮鸟嘌呤忙存液称取20mg 8-azaguanine,加IOmL水和约30 μ L氨水,待溶解后,0. 22 μ m滤器过滤,分装于高压过的2mL eppendorf管,每管ImL,-20°C保存备用。HAT选择培养液78% RPMI-1640培养液，I % A储存液，I % HT储存液，20%胎牛血清，混合均匀,4 °C保存备用。HT培养液79% RPMI-1640培养液，1% HT储存液，20%胎牛血清，混合均匀，4°C保存备用。细胞冻存液70% RPMI-1640培养液，20%小牛血清，10%二甲亚枫(DMSO)，4°C保存，混合均匀,4 °C保存备用。包被液(0.05mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9. 6) NaHC032. 9g，Na2C031. 5g，加双蒸水定容至 1000ml，调 pH 至 9· 6，4°C保存备用。PBS Na2HP04 ·12Η20 2. 9g、KCl O. 2g、KH2P040. 2g、NaCl 8g，溶解于950ml去离子水中，用NaOH调pH值至7. 2后用容量瓶定量至IOOOrnlPBST溶液在PBS溶液中加入再加0. 05% Tween-20，摇匀即可使用。酶标封闭液(0.8%明胶-PBS溶液)0.8g明胶加入IOOmL PBST (pH7. 4)于37°C水浴中溶解，保存于4°C备用。酶标终止液(2mol/L H2SO4溶液)双蒸水89mL，浓硫酸I lmL，将硫酸缓慢滴加至双蒸水中并不断搅拌。7. 5%碳酸氢钠溶液称取7. 5g碳酸氢钠粉末，加入90mL蒸馏水充分溶解，再定容至IOOmL,用0. 22 μ m滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口保存于4°C备用。20000U/mL双抗储备溶液在购买的80万单位青霉素瓶中加入高压过的三蒸水4mL, 100万单位链霉素瓶中加入高压过的三蒸水5mL，轻轻摇晃直至瓶内粉末完全溶解，分别取4mL加入32mL高压过的三蒸水中，用O. 22 μ m滤器过滤除菌，分装至高压灭菌的2mL离心管内，用封口膜封口后保存于_20°C备用。2 方法2. I最佳抗原包被量及阳性血清最佳稀释度的确定按方阵滴定试验方法进行，将小反刍兽疫病毒灭活后按I : 20、1 50,1 100、I 150,1 200进行稀释，在酶标板上按IOOyL/孔包被，阴性、阳性血清从左到右按I : 50、1 : 100、I 200、I 400、I 800、I 1600 稀释，酶标二抗按 I : 4000 稀释。然后根据测定的0D450nm值确定最佳抗原包被量及阳性血清稀释度。间接ELISA操作程序如下
(I)用包被液按上述梯度稀释初纯病毒液，酶标板的每孔中加入100 μ L稀释抗原,置湿盒内4°C过夜；(2)倒掉包被液，PBST洗板3次；(3)用PBST将阴性、阳性血清按上述梯度稀释，每孔加100 μ L，置湿盒中37°C孵育Ih，甩干后PBST洗涤；(4)用PBST将羊抗鼠IgG-HRP稀释I 4000，每孔加100 μ L。置湿盒中37。。孵育Ih,甩干后PBST洗漆；(5)每孔加入底物溶液TMB 100 μ L，置暗盒中37°C反应20min ；(6)每孔加入2M硫酸50 μ L，终止反应。(7)用酶标检测仪检测各孔0D450nm值。2. 2动物免疫将回收并测定浓度后的GST-N重组表达蛋白用灭菌PBS稀释到lmg/mL，取200 μ g蛋白溶液与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化。选取健康的六周龄雌性小鼠6只，待其适应环境两天后，在背部皮下分点注射200 μ L乳化后的蛋白，后腿肌肉各注射100 μ L。然后分别在首次免疫后弟15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫。三免后一周尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法确定每只小鼠的抗体水平。对免疫效果较好的小鼠融合前三天再次加强免疫一次，加强免疫时可用腹腔注射100 μ g不加佐剂的蛋白溶液。对免疫效果不理想的小鼠可以进行四免，免疫部位和方法与第三次相同。2. 3细胞融合2. 3. I复苏与培养骨髓瘤细胞在融合前两周左右，开始复苏和培养骨髓瘤细胞sp2/0株。(I)将超净台用酒精棉球擦拭干净，用紫外灯将超净台照射至少30min，同时打开超净台风机；(2)从液氮罐中取出冻存的SP2/0细胞冻存管，迅速放入盛有37°C水的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使冻存管内液体完全融化；(3)从烧杯中取出冻存管，1000r/min离心IOmin,用吸管轻轻吸取上清弃去；(4)加入约ImL不完全RPMI-1640，轻轻悬起细胞，移入准备好的细胞瓶内，再补充9mL完全RPMI-1640培养液；(5)轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞分布均匀，置37°C，含5% C02细胞培养箱内培养，24h后观察，待细胞贴壁后更换细胞培养液继续培养。在传代培养过程中如果出现细胞大小不均，细胞返祖等现象，可以用含有20ug/mL8-氮鸟嘌呤的完全培养液选择培养三代以上，以保持HGPRT缺陷型。在融合当天，将处于对数生长期，生长良好的SP2/0细胞吹打起来，移至灭菌离心管中，1000r/min离心lOmin，弃去上层培养基，收集细胞，加入20mL不完全RPMI-1640培养液洗涤一次，离心后将细胞重新悬�。锰ㄅ卫既旧剖寮剖钕赴赣�。2. 3. 2饲养细胞制备取8-10周龄健康BALB/c小鼠一只，眼球采血，分离阴性血清,待小鼠失血死亡后，浸泡于75%酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤，注意不要剪破腹膜，将腹部皮肤拉开固定在塑料板上，使腹膜充分暴露。用无菌的一次性注射器吸取3 4mL完全培养基注射到小鼠腹腔内，保持注射器 不动，用灭菌的小镊子轻揉腹部I 2min，再用注射器吸出腹腔内的培养液，此时培养液内含有巨噬细胞等可作为饲养细胞。调整培养基中饲养细胞的浓度，使其在I X 105个/mL左右，将调整好浓度的培养基放在灭菌的平皿内，备用。2. 3. 3脾细胞的制备取3天前加强免疫的BALB/c小鼠，眼球采血，分离血清作为阳性对照；将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上，用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏，用无菌小镊子将其取下，放入盛有不完全RPMI-1640培养液的无菌平皿中稍作清冼，剥离表面脂肪和结缔组织。然后放在高压过的200目铜网上剪碎，用高压过的注射器芯研磨脾脏，便研磨边滴加不完全RPMI-1640培养液，直至脾脏完全磨碎，再用约20mL不完全RPMI-1640培养液冲洗筛网，使脾细胞完全通过筛网进入烧杯中。1000r/m离心IOmin收集脾细胞备用。2. 3. 4细胞融合脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量I : 5 I : 10混合均匀，1000r/m离心IOmin，倒掉上清，轻弹管底使其疏松。在一干净的烧杯中加入37 °C蒸馏水，将含有混合细胞的离心管置于水浴中，在90s内加入800 μ L 37°C预热的PEG2000，边滴加边旋转离心管，静置lmin，再在5min内加入37°C预热的不完全RPMI-1640培养液，先慢慢滴入，然后加快，不可将底部细胞冲起，稀释完PEG后1500r/min离心lOmin，倒掉上清。将细胞沉淀重悬于20%胎牛血清的HAT选择培养液中，混合均匀，同时将制备好的饲养细胞按相同体积加入，再次混合均匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200 μ L，饱和湿度、5% C02、37°C培养。2. 3阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆2. 4. I阳性杂交瘤细胞孔的筛选融合后的细胞每隔2 4天更换一次培养基，更换的时候采用半换液方式，即弃去100 μ L培养基，再加入100 μ L新的HAT选择培养液。融合后7 8d时，开始观察细胞，标出有存活的杂交瘤细胞的细胞孔，待杂交瘤细胞长满孔底1/10以上时，取上清100 μ L作为一抗，用灭活的弱毒株病毒作为抗原，用间接ELISA检测方法筛选阳性克隆孔。2. 4. 2阳性杂交瘤细胞的亚克隆将间接ELISA检测阳性的细胞孔中的杂家瘤细胞吹起，并移入24孔细胞培养板中，待其长满后，重新吹起混匀并细胞计数。计数后，用含20%胎牛血清的HAT培养液将其稀释到10个细胞/mL，将此浓度的细胞悬液按照100 μ L/孔加入预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。筛选方法同上，同时要将每次克隆化后的剩余细胞扩大培养后冻存，以免丢失。经过3次亚克隆后，所有克隆化细胞孔内的上清经检测都呈阳性时，可以确定已经获得分泌单克隆抗体的细胞株。选取0D450nm值最高的几孔，扩大培养。2. 4. 3细胞冻存将形态良好，生长旺盛的杂交瘤细胞吹打均匀，1000r/min离心lOmin，收集细胞，用ImL细胞冻存液将细胞悬起，加入到细胞冻存管中，同时做好标记，将冻存管先放置于40C 30min，然后移至_20°C冷冻30min，再移至_70°C低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录。2. 5单克隆抗体腹水的制备
在接种阳性杂交瘤细胞株前一周，给每只8-12周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射
0.2mL液体石蜡。在此期间，对阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养。一周后，将扩大培养的细胞从细胞瓶中吹下，用高压过的PBS重悬,洗漆两次遍，1000r/min离心IOmin,苔盼兰染色计数，将细胞密度调至I 2X 106个/mL，每只小鼠腹腔注射O. 5mL细胞悬液。接种细胞后每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，行动困难时，将小鼠颈椎脱白处死，用无菌注射器从小鼠腹部吸出暗红色的液体，3000r/min离心20min，取清亮的上清分装、标记，-20°C保存备用。2. 6杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定2. 6. I抗体亚类的测定吸取杂交瘤细胞培养液上清200 μ L,用 Isostrip Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit抗体亚类试剂盒对单抗进行亚型鉴定。取杂交瘤细胞上清20 μ L,加入ρΗ7. 2的PBS 180yL做I : 10稀释；取该稀释液150 μ L加入含有兰色粉末的实验管中，轻轻震荡混勻，至兰色粉末完全融化；将Isotrip胶体金试纸条插入管底,5 IOmin内观
察结果。2.6.2腹水效价的测定为测定腹水中抗GST-N单克隆抗体效价，用初纯的I : 50倍稀释的小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1株作为包被抗原，将小鼠腹水作10倍梯度稀释，从I : 10
I 109倍，用间接ELISA方法检测腹水效价。同时用SP2/0细胞上清、正常小鼠腹水作阴性对照，病毒阳性血清做阳性对照，具体判定标准为P/N > 2. O时的腹水最大稀释倍数为腹水的ELISA效价。2. 6. 3单克隆抗体对热稳定性试验取粗纯的腹水用灭菌的PBS I 1000稀释，置561水浴中411、811、1211、2411、3611、48h，然后用间接ELISA检测其0D450值的变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。2. 6. 4单克隆抗体对酸碱稳定性试验酸稳定性试验将腹水用pH2. 2的盐酸溶液I : 10倍稀释，于4°C保存4h、8h、12h、24h、36h、48h，再用pH7. 2的PBS稀释到I 1000，ELISA检测其0D450值变化，根据试验数据绘制稳定性变化曲线。碱稳定性试验用包被液(pH9. 6的碳酸盐缓冲液)按上述方法进行碱稳定性试验。2. 6. 5单克隆抗体识别抗原表位的测定用间接ELISA相加法检测6株单克隆抗体的抗原表位。用初纯的病毒液I : 50倍稀释包被酶标板，先用间接ELISA法测定腹水中McAb与包被抗原反应达到饱和时的稀释度。然后进行间接ELISA相加实验，用上述浓度的抗原包被酶标板，现在酶标板上横向加入6株单抗腹水，反应2h后，再纵向依次加入上述腹水，反应2h后，0D450nm值记录为A1+2，在对照孔中只加入一株单抗的腹水，其值分别记录为Al A6，计算相加指数时，按照下列公式AI = [241+2/^1+42)-1]父100%，每组重复试验3次，取其平均值41值大于50%即可认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。3 结果3. I最佳抗原包被量及阳性血清稀释滴度的确定 方阵滴定试验测定0D450nm值结果见表I。从表I可见,初纯病毒抗原最佳稀释度为I : 50，阴性、阳性血清稀释度为I : 100。表IGST-N抗原包被量和阳性血清稀释滴度方阵试验结果
权利要求
1.一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒，包括制备得到的小反刍兽疫重组N蛋白抗原、N蛋白单克隆抗体、酶标板、阴性对照、酶联物、显色剂A&B、终止液，所述的小反刍兽疫重组N蛋白抗原的制备方法包括采用上游引物5, CGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAGCT3 '和下游引物 N-DN 5 ' ACGCGTCGACTTAGCTGAGGAGATCCTTGT3 '，分别在上下游引物 端引入酶切位点EcoR I和Sal I ;通过RT-PCR方法从小反刍兽疫细胞毒RNA中获得N基因的0RF，构建其原核表达载体PGEX-4T-1，将重组质粒转化BL-21宿主菌，进行小反刍兽疫重组N蛋白抗原表达并提取小反刍兽疫重组N蛋白抗原。
2.根据权利要求I所述的一种小反刍兽疫抗体检测的竞争ELISA试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括小反刍兽疫重组N蛋白单克隆抗体，其中所述的N蛋白单克隆抗体的制备方法包括以重组N蛋白免疫小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,通过筛选获得可稳定分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，以该细胞株小鼠腹腔注射进行制备N蛋白单克隆抗体。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒的盒体内装有酶标板8X12孔，小反刍兽疫重组N蛋白抗原I μ g、封闭液4. 5ml，单抗反应液5ml，酶结合物5ml，阳性血清O. Iml,阴性血清O. 1ml，浓缩洗涤液125ml (25倍)，底物5ml，终止液5ml。上述各种液体分别装在小瓶内，其中所述的酶标封闭液为1% BSA溶液(lg BSA加入IOOml PBSPH7.4);单抗反应液为适合倍数稀释的小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体；酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠酶标二抗；浓缩洗涤液为含O. 05%吐温-20的25倍浓缩的PBST液；底物为已加入H202的TMB溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的2mol/LH2S04溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为11 89。
4.根据权利要求I所述的制备方法所制备得到的小反刍兽疫重组N蛋白抗原。
5.根据权利要求2所述的制备方法所制备得到的小反刍兽疫重组N蛋白单克隆抗体。
6.权利要求4所述的小反刍兽疫重组N蛋白抗原和/或权利要求5所述的小反刍兽疫重组N蛋白单克隆抗体在制备小反刍兽疫抗体检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测小反刍兽疫病毒抗体的竞争ELISA试剂盒，所述试剂盒包含包被抗原反应液和单克隆抗体反应液构成的检测体系，属于生物技术领域。该试剂盒采用原核表达的小反刍兽疫Nigeria 75/1株N蛋白作为包被抗原，N蛋白单克隆抗体为竞争抗体，依据竞争ELISA原理检测羊血清中小反刍兽疫病毒的抗体。本发明的试剂盒可快速而特异地检测血清中小反刍兽疫病毒抗体，同时还具有规模性生产单克隆抗体的优势，反应特异性好，灵敏度高，其操作简单、成本低廉，反应结果稳定可靠、易于观察，非常适用于羊的进出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的大批样品的筛查，易于大范围推广应用。
文档编号G01N33/68GK102967710SQ201210278970
公开日2013年3月13日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者才学鹏, 窦永喜, 蒙学莲, 毛立, 李辉, 骆学农 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所
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