专利名称：利用促细胞分裂原和抗原测定淋巴细胞活化的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及快速检测淋巴细胞的功能及其对促细胞分裂原或者特异抗原的反应的方法。具体而言，本方法可快速检测胞内成分优先ATP的存在，ATP作为免疫反应结果有所增加。
背景技术：
免疫系统是感染性疾病和癌症的控制中心。淋巴细胞是一类白细胞，为负责免疫系统活性的重要细胞类型。淋巴细胞分为两大主要类别，T淋巴细胞和B淋巴细胞。总体评价免疫系统具体为淋巴细胞的功能对于评价免疫缺损很是重要的，免疫缺损由遗传因素、感染性疾病例如HIV、移植后药物、紧张、衰老或营养缺乏导致。
淋巴细胞表达位于细胞表面的受体，其与特异抗原或表位结合。与抗原接触使得与抗原反应的淋巴细胞的种群扩展。检测免疫系统对特异抗原的反应，可用于诊断传染性疾病、对某些药剂的高敏感性、与免疫活性药物的接触或对接种的反应。
通过检测诸如血液、唾液或尿液的体液中特异抗体的水平可来评估B淋巴细胞的功能或其对特异抗原的反应。很难检测T淋巴细胞(T细胞)的功能或其对特异抗原的反应。许多原因使得检测T细胞的功能复杂化了。首先，T细胞有许多不同亚型，各具不同功能。这些亚型部分是根据特征细胞表面标记的表达分类，部分是根据各种功能分析包括细胞因子测试来分类。其次，T细胞只有在呈递细胞表面上的主要组织相容性抗原的情形下由其他细胞呈递时才会对抗原作出反应。再次，T细胞的许多功能依赖于与效应细胞的细胞-细胞接触，或者其功能相当局部化。
现有的检测免疫功能方法很烦锁、费时，并且不能很好地适用于临床实验室安装。目前使用的直接或间接检测免疫功能的方法包括基于对淋巴细胞或不同亚型计数的方法、基于检测淋巴细胞增生的方法，基于检测细胞毒素活性或细胞因子分泌的方法以及体内皮试或适用的转移方法。文献中详细叙述了这些方法(参见例如Groeneveld等，Joournal of the International Federation of Clinical Chemistry，684-94；1994；Clough和Roth，JAVMA 2061208-1216.1995)。
临床实验室最常用的方法是计算淋巴细胞或亚型的数目。已描述的各种技术包括免疫荧光显微镜技术、免疫细胞化学、酶联免疫测定以及流式细胞仪。特别地，流式细胞仪广泛用于临床实验室装置中，以及特别有利于检测细胞的复合种群中的目的亚型。例如，Recktenwald的美国专利号4,727,020描述了运用两个荧光通道检测亚群中特异标记有两种不同免疫荧光剂的细胞。Hansen等的美国专利号4,284,412叙述了运用荧光通道来检测血液中不同亚群细胞散射的正方和右方角的光线。流式细胞仪的主要缺点包括其需要复杂、昂贵的仪器，需要显著的“传递”时间，因为每个样品要经历许多人手工步骤，必须使用高级技术人员分析结果。临床实验室每天要测量许多患者的样品，一致、可靠的测定结果对于临床实验室十分重要，但这些缺点对于上述临床实验室来说尤其棘手。
Melnicoff等的美国专利号5,385,822和Jensen的美国专利号5,374,531公布了另一种流式细胞仪方法，用于计算淋巴细胞的数目，或计算细胞混合种群内淋巴细胞亚型的数目。这些专利中描绘的方法涉及到将可检测的报道物质偶联到生物膜上或将报道物质掺入细胞，然后分离亚型或目的种群，并检测报告物质。这些方法运用亲和层析来分离形成细胞复杂混合物的目的种群。尽管该技术在流式细胞仪上作了改进，但仍基于细胞计数技术。
所有细胞计数技术的主要困难在于它们不能检测特异细胞的功能及其对特异或非特异刺激物的反应，如特异抗原或促细胞分裂原。进而这些方法反映了细胞表面抗原的结合特性。此外，这些方法烦琐且重复性差。
对淋巴细胞应答直接检测包括淋巴增生分析、细胞毒性分析以及细胞因子检测。一般来说，这些方法需要从原始样品中分离出白细胞，接着与抗原或促细胞分裂原温育。特异亚型功能检测需要在实验前广泛操作。例如，需要抗原呈递细胞，这表示淋巴细胞要把额外细胞加回到培养物中。淋巴增生分析是基于反应细胞的分裂，并通常采用放射性同位素来完成。因为他们要评价细胞小种群的分裂并需要组织培养物，测试用3-10天完成，而且基于特殊技术和测试中所用试剂带来显著的不稳定性。细胞毒性测试也需要显著的细胞操作，并依赖于所用的特异条件带来同样的高度不稳定性。也可以进行细胞因子分析，但步骤很多，并在刺激细胞前分离目的亚型。McMichaels的美国专利号5,344,755描述了基于起初T淋巴细胞的免疫磁性分离而改进的细胞毒性分析方法，但这一方法仍需广泛操作效应细胞。美国专利号5,344,755提供了运用细胞因子检测方法来评价HIV阳性患者中免疫状况的示例，但其烦琐，需要多种步骤。这些方法需要分离关键细胞类型、长时间温育并在一些情况下使用放射性物质。基于这些原因，这些方法不适用于临床应用。
最近，运用流式细胞仪通过胞内细胞因子的表达来检测对抗原或促细胞分裂原刺激的应答(例如，美国专利5,445,393；5,656,446；5,843,659)。由于细胞因子通常由对刺激产生应答的细胞所释放，基于流式细胞仪的方法需要往培养基中添加布雷菲尔德菌素来抑制释放细胞因子，这样来进行非生理性分析测试。此外，细胞需要多重温育、离心步骤和洗涤以刺激、抑制细胞因子释放、通透细胞、结合细胞表面标记、固定并染色细胞，以通过流式细胞仪而可见。
细胞亲和层析运用蛋白包被的磁性颗粒或诸如聚苯乙烯颗粒的其他类型固相支持物，此方法是已知的，并在上述方法若干种中部分运用，参见美国专利号5,374,531、5,385,822和5,344,755。专利文献或其他中描绘了通过在固相支持物上的亲和层析分离来挑选生物群体的方法，参见例如美国专利号3,970,518、4,710,472、4,677,067、4,666,595、4,230,685、4,219,411、4,157,323；也参见，E.T.Menz等，Am.Biotech.Lab.(1986)；J.S.Kemshead等，Molec.Cell.Biochem.，6711-18(1985)；T.Leivestag等，Tissue Antigens，2846-52(1986)；以及J.S.Berman等，J.Immunol.，1382100-03(1987)。在执行这些方法过程中，结合分子(如单克隆抗体)通常结合到如磁性颗粒或塑料珠子的固相支持物上，并在特定条件下加入到样品中，所述条件导致结合到目的分析物上的特征决定簇。然后通过与磁场接触或过滤或某些其他合适的方法，将用固相支持物复合的细胞从未复合的细胞分离，这取决于固相支持物的性质。已有报道，应用这种技术在移植前从骨髓细胞中分离淋巴细胞亚群，以及消除移植后针对宿主的疾病。参见A.Butturini等，Prog.BoneMarrow Transpl.413-22(1987)。其他报道的运用此项技术的方法包括分离肿瘤细胞(参见Kemshead等，B.J.Cancer 54771-78(1986))，以及分离淋巴细胞亚群，用于随后的功能评价。
用固定化抗CD3加抗CD28共刺激对CD4淋巴细胞长期增生的影响已作了报道。参见B.L.Levine等，J.Immunol.1595921-5930(1997)。在这种情况下，树突细胞与T细胞之间的相互作用是模拟的，因为它提供了通过CD3复合物初始刺激信号和通过CD28受体的共刺激信号。(参见Garlie等，J.Immunotherapy 22(4)336-345(1999)。
通过磁性或其它固相亲和技术分离淋巴细胞，然后将其运用于功能分析中，便出现了几个问题。例如，淋巴细胞与结合分子间的相互作用。本身就诱导淋巴细胞功能的变化，这可使得后者所检测的变化�：�。此外，尤其如果分离特异细胞亚型，则不再出现T细胞应答所需的辅助细胞。进一步地，分离细胞从天然环境中移走，很难维持进一步组织培养物所需样品的无菌。
Weir的美国专利号5,773,232(在此以其全文引作参考)揭示了这些缺陷的方法。Weir描述了此发现，即活化T细胞展示了ATP水平的提升，以及T细胞群体活化的水平可通过检测ATP水平获得。然而，Weir的方法需要分析24小时。
拥有一种快速、灵敏检测T细胞活化的可得的方法并避免这些缺陷是很有益处的。
发明概述本发明提供了一种方便、可靠和快速分析淋巴细胞各种型或亚型的功能的方法。本发明方法包括把一群细胞置于至少一种诱导剂(例如促细胞分裂原或抗原，有或没有共刺激剂)中；通过附着于固相上的特异结合物质与存在于目的细胞亚型的细胞表面决定簇的相互作用的方法来分离所需细胞亚型；分解所分离的细胞；并且若细胞已对诱导剂应答，则检测增加的胞内成分。所有这些步骤在少于24小时发生，较好的少于3或4小时，最好的是少于1小时。
在本发明优先的实施方案中，淋巴细胞型或亚型的功能活性由特征细胞表面决定簇区分，以及含在混合细胞群中，并由下列方法检测将样品置于促细胞分裂原或抗原中，添加或不加刺激剂；将样品温育一段时间；通过细胞表面决定簇和连接到固相支持物上的特异结合物质之间的相互作用而使淋巴细胞的型或亚型结合到固相支持物上；洗涤细胞以去除未结合细胞以及介质中潜在的干扰物质；分解细胞；并检测溶液中的ATP水平。与已知标准对照作对比得到结果。或者，样品可分为2份或多份，其中至少一份未加入任何诱导剂温育，而第二部分添加有至少一种诱导剂温育。
本发明的一方面是测定淋巴细胞对促细胞分裂原的应答。在此情形下，淋巴细胞型对促细胞分裂原的应答是免疫功能或固有免疫性的总测定。本申请在免疫抑制药物或药剂的效果或病毒诱导的免疫抑制状态的检测中具有特殊的重要性。在此情形下，可以确定如T淋巴细胞的全型淋巴细胞的应答。或者，通过评价表达CD4细胞表面决定簇的T淋巴细胞亚型对促细胞分裂原的应答，可评价病毒如HIV的效果。
本发明的另一方面是确定淋巴细胞对抗原的应答，所述抗原包括但不限于感染性试剂、药物、化学物质、自身抗原、异源抗原或肿瘤抗原。本发明的这个方面特别在监测个体置于感染性疾病或药剂中很重要，或在诊断高敏感性、自身免疫疾病、器官移植耐受性或注射或癌症等方面很重要。本发明的这一方面利于监测疫苗效能，利于评估化学物质、药物以及工业化合物的免疫毒性。
本发明的另一方面在于来自包括功能性或基于分化的亚型的各种亚型的T淋巴细胞对至少一种透导剂的应答根据不同决定簇的表达可进行评估，所述决定簇特异于功能、分化或细胞表面的活性标记。在发明的这一方面，至少在样品中加入一种透导剂并温育一段时间。温育过后，通过细胞表面上决定簇和固定在支撑物上的特异结合物质，把细胞连接到固相支持物上来分离出目的细胞亚型。洗涤、溶解细胞并测定，作为活化的结果胞内成分水平增加了。
本发明方法高度灵敏，归功于胞内成分的测定，将淋巴细胞置于一种诱导剂，如ATP，或其它代谢中间体如NADP，或参与细胞周期调控的蛋白质如PCNA，则胞内成分水平快速提高。在优先的实施方案中，运用荧光素荧光素酶进行生物发光反应来检测ATP水平。ATP的生物发光测定是高度灵敏的测定。
本发明的另一方面在于方法所需的总时间一般少于24小时，优选3小时或更少，以及最优选1小时或更少(如30分钟)。与现有方法需要3-10天完成或Weir在美国专利5,773,232中所述的方法需要24小时完成相比较，相对短的时间期限是优势。
在本发明的另一优先的实施方案中，测定混合的细胞群体内所含的淋巴细胞型或亚型的功能活性是通过将样品置于促细胞分裂原或抗原中，同时置于固相支持物上，固相支持物含有固定化的特异结合物质，目的是通过细胞表面决定簇和与固相支持物相连接的特异结合物质之间的相互作用，使淋巴细胞型结合到固相支持物上，洗涤细胞去除未结合细胞及介质中潜在的干扰物，溶解细胞，并检测溶液中的ATP。其结果与已知标准对照，或者把样品分为两份或更多，其中至少一份与含有固定化特异结合物质的固相支持物温育，而另一份与不含有固定化特异结合物质的固相支持物温育。在本发明优选的实施方案中，固定化特异结合物质是诸如抗体的共刺激剂。
在本发明另一优先的实施方案中，通过包被特异肽重组分子或更复杂抗原(例全病毒或细菌或裂解液等)的磁性颗粒的方式来选择细胞的抗原特异亚型。在裂解之前，从其它细胞类群中去除这些抗原特异的细胞，并测定ATP含量，通过允许在没有非特异信号的情况下检测来克服低前体频率。
在本发明的一个实施方案中，提供了实施本发明方法的试剂盒。试剂盒通常含有诱导剂，具有适宜结合物质的固态物，检测ATP水平所需的试剂，适宜的稀释液和洗涤液，标准物或说明书，以及任选其它利于完成本发明方法的附属物如试管、磁性分离器、清洗器和移液器。
附图简述
图1表示在使用促细胞分裂原(植物凝集素)和抗原(破伤风类毒素)刺激后，血液样品的反应。时间过程表示实施例1的结果，并揭示出早至刺激后30分钟即可检测反应。NS＝无刺激物对照；PHA＝植物凝集素，1％；tetanus＝破伤风类毒素，1ug/mL。
图2表示在用植物凝集素刺激之前和之后全血样品的反应。2-24小时反应的时间过程显示实施例2的结果。NS＝无刺激对照；PHA＝植物凝集素，1％。
图3表示实施例3的分析结果，其中对破伤风类毒素的反应的测定是用固定化CD3/CD28抗体共刺激之后30分钟到3小时。◆＝NS(无刺激)对照；■＝1ug/mL破伤风毒素。
图4表示实施例4所述的分析结果，明显健康成年人(◆)以及HIV感染的供体(■)的T淋巴细胞反应的分布。
发明优选实施方案详述本发明提供了灵敏和有效的检测淋巴细胞的型或亚型(如T细胞或B细胞)的活化的方法，其由混合细胞群内细胞表面上所表达的某些特征决定簇来区分。具体而言，本发明特别提供了检测淋巴细胞对诱导剂反应的方法，所述诱导剂包括促细胞分裂原、抗原和共刺激物或其组合。
本发明方法涉及检测细胞激活后增长的细胞型或亚型的胞内成分。在本发明优选的实施方案中，胞内成分是ATP。众所周知，ATP水平是代谢活性的指征。参见例如，Kangas等，Med.Biol.61338-43(1984)和Lundin等，Enzymol.13327-42。ATP水平的测定已用来研究化疗药物和其他细胞系的药剂，并用以监测生物量和细胞数目的增长。运用萤火虫荧光素与荧光素酶的生物发光反应可很灵敏地检测ATP水平。参见例如，Leach和Webster，Meth.Enzymol.13351-70(1986)。已报道了对细菌或体细胞中ATP水平进行评估的许多方法。参见例如，美国专利号3,690,832、5,283,179、4,144,134、4,283,490、4,303,752，分别在此引作参考。反应细胞的代谢活性显著增长，且这种增长以ATP水平的显著增长反映出来。进而，可根据荧光素荧光素酶系统的灵敏度来检测ATP水平的小变化或少量细胞ATP水平的变化。参见Buttgereit等，Review Immunology Today，192(21)194-199(2000)。
本发明提到现主要存在对检测T细胞活化的改进方法的需求。本方法显示具有与迄今为止所用方法可比的或更高的灵敏度。这些方法也使得操作者在相对较短的时间内分析多种样品，减少实施方法使用昂贵仪器和高级专业技术人员，也不使用放射性物质。
抗原性T细胞激活应答通常比那些由促细胞分裂原刺激所提供的的应答要弱些。此外，免疫抑制或是免疫缺损的患者常显示对刺激物的T细胞应答减少。所以，提高对抗原刺激敏感性的方法提供了其他有用的诊断信息或免疫评估目的。目前，作为部分分析方法学，依赖于克隆细胞放大的测试提供了检测微弱抗原应答的方法。然而，由于增殖所需的测试周期很长(3-10天)，其对于大多数临床应用是不实用的。本发明提供的方法掺入T淋巴细胞的共刺激剂，以便评估T细胞活化的早期阶段。本方法不需要细胞分裂来检测胞内成分的显著水平。因此，可在相对短的温育或接触时间(例从约0.5至24小时)后检测反应，提供所需灵敏性的增加，并减少长的结果等待时间。在本发明优选的实施方案中，共刺激剂是抗体(例如抗-CD3和抗CD28)。在一些实施方案中，抗体是固定化的。
本发明方法可作为辅助或替换，用于临床实验室中所操作的方法和测试，以计算不同亚群的淋巴细胞数目。在此描述的方法以缩短的细胞计数分析时间整合了分析所需的灵敏性，所述分析花费较长时间。标准物的使用以及试剂盒的供给确保了临床实验室中测试所要求的重复性和一致性，所述试剂盒含有全部实施本发明必需的试剂。
本发明方法有许多优越于目前方法之处。特别是反应所需时间比其他化验时间显著缩短。试剂盒中化验所需材料的供给以及测试简变性导致各化验室的结果一致。进一步，可同时检测多重样品。方法简单、快速、灵敏并适于临床实验室安装。
诱导剂在发明的情形下，诱导剂是与淋巴细胞相互作用的物质，如此相互作用的结果是细胞状态中的变化。具体而言，“诱导剂”是指诱发静息淋巴细胞变成活化淋巴细胞并且还能诱导细胞中功能活性的物质。一般来说，诱导剂分成3类(1)促细胞分裂原，其与特殊亚型的所有淋巴细胞相互作用，并诱导活化，随后是应答细胞的增生；(2)抗原，其通过细胞有限亚群上的特异受体相互作用；以及(3)共刺激调节剂，其通过一种或多种细胞的众多种亚群的受体或结合蛋白而相互作用。
淋巴细胞的不同亚群的促细胞分裂原是众所周知的，并包括凝集素、生长因子以及淋巴因子、佛波酯以及其他生化物质，这些生化物质对本领域那些专业技术人员是已知的。优先的促细胞分裂原包括植物凝集素(PHA)和伴刀豆凝集素A(ConA)。
抗原通过细胞表面上的特异受体与较小淋巴细胞的亚型作用。各淋巴细胞在其细胞表面上具有特异抗原或分子的受体。对于B淋巴细胞来说，细胞表面受体是膜结合的抗体。对于T淋巴细胞来说，细胞表面受体是带有识别抗原的T细胞受体，所述受体在另一细胞表面上的主要组织相容性分子的情形下被呈递。免疫系统对特异外来入侵物的应答是基于通过这些细胞表面上的受体而识别抗原，以及基于作为这种相互作用的结果而出现的所得功能性活化。一般而言，与这些细胞表面受体结合的抗原是较大分子的少部分，其可包括感染剂的部分，诸如病毒、细菌、真菌及其类似物，还有药物、有机化学物以及无机化学物如硅烷，金属如铍，以及蛋白如肿瘤细胞蛋白，或衍生自植入或移植的器官中的蛋白质。优先的抗原包括HIV病毒外被糖蛋白的gp120蛋白(或其肽片段)；细菌的外表面蛋白如来自包柔式螺旋体的蛋白质A、B或C；二氧化硅；破碎灭活的Q热细胞；纯化的蛋白衍生物(PPD)；破伤风类毒素；或与所有T-细胞受体结合的葡萄球菌超抗原。
共刺激剂或调节剂通过与细胞上或细胞内的受体结合，或通过与各种胞内成分相互作用而发生作用。对于淋巴细胞，诸如细胞因子的分子和受体配体结合到细胞亚型的特异受体上，并可导致活化或抑制反应。诸如类固醇、药物和金属离子的小分子可穿透细胞膜，并结合到控制细胞功能的因子上。许多这些药剂包括环孢菌素和tacrolimus(FK506)是免疫抑制物，可抑制淋巴细胞反应。其他药剂包括霉酚酸、纳巴霉素、钙激活钾通道封阻物(克霉锉、卡律布道蝎毒素和nitrendipine)以及核苷酸类似物(AZT)，通过与线粒体的相互作用、信号传导途径和生化途径来影响细胞代谢。增强淋巴细胞反应的优先的共刺激剂包括白细胞素(IL-2、IL6、IL10、IL12、IL-la)、抗-CD3抗体、CD28-配体或抗-CD28抗体、以及CD49d-配体或抗-CD49d抗体。这些共刺激分子通过放大特异T细胞受体与特异抗原或促细胞分裂原之间的相互作用，来调节淋巴细胞反应，所述相互作用是通过增强的受体-配体结合、第二信号传导途径(肌醇三磷酸、钙释放通道)和生化信号(例如磷酸化作用)来实现。
靶细胞目的细胞亚型存在于试样中或不同起源的样本中，包括生物流体，如全血、尿液、大便、唾液、脑脊液、羊膜流体、组织提取物、灌洗流体、肿瘤活检、移植物活检或来自培养基。目的细胞属于人或动物起源。样品还包括来自不同生物起源的样本，它们经密度梯度离心或其它分离纯化方法已部分纯化，所述纯化方法用于分离部分纯化的细胞样品。
按照本发明方法，在分析含有目的细胞亚型的样品中，将悬浮在天然生物流体或合适生物或合成的介质中的细胞群起初置于促细胞分裂原或特异抗原中，加入或不加入刺激剂。换言之，可把细胞置于促细胞分裂原、抗原、促细胞分裂原和刺激制剂、或抗原和刺激剂中。抗原或促细胞分裂原与刺激剂组合使用可通过检测ATP信号而测定，ATP信号使所需反应最佳。
本领域中的那些专业技术人员将认识到，为减除目的细胞中的可检测反应，所需诱导剂的浓度在诱导剂之间发生变化。通过滴定药剂和检测使所需反应最佳的ATP信号可测定这种药剂的最佳浓度。
接触时间相对较短正是本发明的特殊方面。根据诱导剂或正被测定的诱导剂组合的性质，接触时间大约为2-30分钟到大约72小时或更长。在本发明优选的方案中，接触时间大为约4小时到约24小时。
诊断、治疗和研究目的中的特别兴趣是检测T-淋巴细胞和淋巴细胞亚型的反应，包括主要功能性亚型，如T辅助细胞，以及对促细胞分裂原或特异抗原的抑制物/细胞毒性细胞。对T淋巴细胞的特异亚型的反应的量化在某些生理条件下是重要的。例如，感染有人类免疫缺损病毒的个体，在其它细胞亚型失去活性前，就丧失CD4细胞群对促细胞分裂原和抗原的反应。同样，T细胞的亚类型对促细胞分裂原的反应在监测个体上是重要的，这些个体由于慢性应激、化疗或药物处理是潜在的免疫抑制。淋巴细胞亚型对特异抗原反应进行定量的重要性在于检测个体置于感染性药剂或药物或化合物，或确定对药物、化学物质或食物的高敏感性反应。除主要功能性亚型以外，其它目的细胞亚型包括不同分化期的细胞以及在与诱导剂或诱导剂组合最初相互作用之后不同时间点的细胞。
特征决定簇目的亚型通过特征细胞表面决定簇的表达加以区分。此外，相同亚型但处于不同分化期的细胞通过细胞表面上的特征决定簇的表达来区分。具有不同功能性活性的细胞或在与诱导剂初始相互作用后不同时间点的细胞也表达不同的细胞表面决定簇。
本发明中，术语“特征决定簇”表示鉴别或确定事物本质的元件。当参照使用本发明方法时，“决定簇”意思是在细胞表面上表达的以某种形式表征细胞的分子。细胞结合的决定簇包括，例如细胞膜的成分(如细胞膜结合蛋白、糖蛋白、脂类或糖脂，包括宿主细胞或病毒起源的表面抗原)、组织相容性抗原和膜受体。本发明范围内的特征决定簇包括CD69、CD25、CD26、CD27、CD28、CD49d、CD71和MHC I型和II型抗原。
决定簇是与特异结合物质相互作用的细胞的部分。通过细胞表面上的决定簇与附着与固相支持物上的特异性结合物质之间的特定相互作用的方法来分离细胞决定簇。此过程在此称为“亲和分离”。可与细胞表面决定簇相互作用的特异结合物质包括能识别决定簇的抗体和抗原合成复合物以及同源I型或II型受体配体(例如MHC I型四聚体和MHC II型二聚体)。
结合物质根据本发明方法，确定细胞亚型的存在或量化通过目的亚型的细胞和特异结合物质之间选择性的相互作用来完成。实施本发明所用的特异结合物质必须要展示对特征细胞决定簇的选择性识别。在分析具有特征细胞表面抗原的亚群和/或亚型的混合细胞群时，例如，特异结合物质可以是互补抗体，其免疫特异地识别目的抗原。根据这种选择性识别，特异结合物质能够选择性相互作用并且与目的亚型结合以形成复合体或聚合体，其从测试介质和其他不是目的的成分中用物理或化学方法分离。在一个优先的实施方案中，将含有T淋巴细胞和携带表面抗原CD4的单核细胞的血样置于包含CD4单克隆抗体的特异结合物质。
如在此所用的术语“抗体”包括单克隆抗体或多克隆免疫球蛋白和免疫反应的免疫球蛋白片段。其它类型的特异结合物质包括凝集素、激素、细胞因子、受体配体等。针对特异细胞表面决定簇的单克隆抗体在本发明的这种实施方案中具有特殊重要性。例如，淋巴细胞包含全血的亚群，可通过针对白细胞表面抗原的单克隆抗体来筛选。CD45抗原在所有淋巴细胞中均匀表达；然而，CD45抗原也在单细胞中表达。所以，若需要淋巴细胞的选择性结合，必须选择CD45单克隆抗体，其结合到每个淋巴细胞的结合位点比每个单细胞的结合位点要显著更多，或者与淋巴细胞比与单细胞的结合强度更高。
在特别优先的实施方案中，理想的是仅分离全血样品内的T辅助淋巴细胞。如上所述，利用针对T细胞表面抗原如CD4的单克隆抗体来完成，或利用主要与T辅助淋巴细胞反应的抗体的组合来完成。在本发明另一实施方案中，将已经活化的淋巴细胞与特异抗原接触，利用针对活化之后仅在细胞表面上表达的抗原的抗体来分离。这些抗体与下列细胞表面抗原的一种或组合反应CD25、CD69、CD71、CD45RO、CD45RA或MHC II型抗原。利用这些抗原分离导致分析信号的显著放大，这是因为只有表达这些标记的细胞才对抗原或促细胞分裂原的信号形成反应。
在本发明的另一实施方案中，特异结合物质是固定化的共刺激剂，将淋巴细胞与促细胞分裂原或抗原温育，加上固定化的共刺激剂/特异结合物质。例如，在本发明的一个实施方案中，将淋巴细胞置于抗原或诸如抗-CD3、抗-CD28的固定化抗体中，或置于同时二者一起。这种同时的共刺激导致特异抗原信号的增强。
特异结合物质可方便地固定在固相上或不可溶性流体相中，以促进从测试介质中分离。可使用各种固相支持物，例如聚苯乙烯、尼龙和琼脂糖珠，这些对于本领域专业技术人员来说是众所周知的。在本发明尤其优先的实施方案中，特异结合物质固定于多数磁珠上，其含铁磁、顺磁或抗磁物质。把特异结合物质加到珠上的技术对本领域专业技术人员是已知的。合适的技术包括交联、共价结合或物理吸收。或者，利用非固相的初级特异结合物质与次级或辅助性特异结合物质结合，后者能选择性与初级特异结合物质相互作用，并固定于固相上。用于此目的的代表性初级和辅助性特异结合物质为固定在固相上的可溶性鼠抗体/蛋白A；在另一物种中生成并固定于固相上的可溶性鼠抗体/抗-小鼠免疫球蛋白；固定于固相上的生物素酰化抗体/抗生物素蛋白。
下列情形下，其中在固相支持物上分离之前，被测样品衍生自培养物或由密度梯度离心而分离，简单的分离程序足够从剩余细胞群中分离出目的淋巴细胞的亚型。在更复杂样品如全血的情形下，有时有必要清洗复合物以去除捕获或非特异结合的细胞。各种溶液(如0.15M氯化铵、0.1M碳酸钾、0.1M EDTA、pH7.2)特异性溶解红细胞、血小板或其它潜在污染物对本领域那些专业技术人员是已知的。此外，含有其它物质如蛋白质、糖或盐的溶液，或属于特定pH值的溶液可用于减少其他细胞的非特异性结合，或用于消除或分解从目的细胞中分离出的细胞类型(例如含有10％FCS的Hank缓冲液尤其有用)。在分离和随后的清洗之后，如果需要，把介质从复合物中去除。
溶解在分离出目的细胞后，加入含有溶解淋巴细胞的物质的溶液，溶解所分离的细胞群。各种各样的溶液存在并对本领域专业技术人员是众所周知的。这些溶液包括蒸馏水、含如Triton-X或NP-40的去垢剂的溶液以及如HEPE的缓冲液，其含0.1M苯基氯化铝、pH7.4。重要的是选择的物质和溶液不会干扰体系测定ATP，不含有ATP，并且不降解ATP。
本发明显著特征正是在于接触样品直至细胞分解的时间最少，通常少于2小时，优选少于1小时。这一点很有意义，因为淋巴细胞与许多抗细胞表面抗原的抗体相互作用可导致反应。在确定特异细胞类型的功能方面一直是个突出问题，因为细胞类型的分离可诱导细胞活化。
ATP水平的测定细胞溶解后，测定溶液中ATP的水平。在优先的实施方案中，有镁离子存在下，加入含有萤光素和萤光素酶的溶液来测定ATP。ATP的测定还可通过其它方法包括免疫化学或生化反应。
胞内成分的测定是重要的，因为它消除了其他步骤以及任何标记过程带来的内在不稳定性。ATP的增加一直用作生物量增加的标记，但相对不灵敏，因为所有种群细胞显示ATP的基线水平。本发明有效果是因为在目的细胞群分离后进行ATP的测定。
试剂盒根椐本发明的另一方面，不同试剂与用于实施本发明方法的各种附属物一起方便地包装在测试试剂盒中，所述附属物包括稀释介质、固定细胞的固相支持物、溶解试剂、诱导剂以及洗涤缓冲液、一种或多种标准或其制备的说明书。测试试剂盒中所包括的试剂采用多种形式，并与合适的稀释剂一起干燥包装，或可以现配现用形式供应。根据本发明方法，用于评价T细胞反应的试剂盒是预见的。具体而言，本发明包括的试剂盒含有液体或冷干形式的抗原或促细胞分裂原、与用于分离预定细胞亚型的抗体偶联的顺磁珠、稀释样品的细胞培养介质、用于洗涤复合物的洗涤缓冲液以及操作分析的相关试剂。
提供下列实施例以进一步详细描述本发明。这些实例意在说明本发明方法的特殊应用，绝不应理解成限制本发明。
实施例实施例1.利用全血作为样品测定T-淋巴细胞对植物凝集素(PHA)和破伤风类毒素的反应从正常供体中获取血样，并收集在作为抗凝血剂的肝素中。把血样等分在RPMI 1640细胞培养介质(Biowhittaker，Aliquts，MD)中以1∶10稀释。复制物接受或者不添加任何物质、1％的促细胞分裂原PHA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或者终浓度为1ug/mL的抗原破伤风类毒素(University of Massachusetts Medical Center，Jamaica Plains，MA)。将样品37℃下温育。在各个时间点(30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时和5小时)移取100ul的样品，室温下，与包被有结合物质抗-CD4(Dynal，Oslo，Norway)(20ul)的顺磁珠温育30分钟。把细胞与珠子放置在安置的永磁旁边，以至磁场方向与重力方向垂直。清洗珠细胞复合物(在RPMI 1640中清洗3次)，并在去垢剂溶液中溶解。加入分析试剂(萤光素/萤光素酶)，用荧光计定量测量样品中ATP的含量。刺激样品中的ATP含量与未刺激样品对照，以确定活化水平。图1表示这种分析的结果。
结果显示30分钟后，在对PHA的反应中，与背景相比，ATP含量统计学上显著增加。此反应持续5小时。温育5小时后，在对破伤风类毒素的反应中，与背景相比，ATP含量增加显著。
本实施例表明本发明方法成功地检测到30分钟内在对促细胞分裂原的反应中T-淋巴细胞的亚型的活化。由抗原活化T-淋巴细胞的亚型，其检测在5小时内受到影响。
实施例2.在用植物凝集素(PHA)刺激后全血的反应从正常供体中获取血样，并收集到作为抗凝血剂的肝素中。把等分血液在RPMI 1640中以1∶10稀释。复制物接受或者不添加任何物质、或者终浓度1％的促细胞分裂原PHA。把样品在37℃温育。在各个时间点(2小时、4小时、6小时、8小时和24小时)移取100ul的样品，室温下，与包被有抗-CD4的顺磁珠(20ul)温育30分钟。将细胞与珠子放置在永磁旁边，以至磁场方向与重力方向垂直。清洗珠子细胞复合物(在RPMI 1640中清洗3次)，并用去垢剂溶液溶解。将分析试剂(萤光素/萤光素酶)加入到样品中，如上所述对ATP生产进行测定。图2表示这种分析的结果。在所有时间点可看到ATP与背景对照的增长。温育4小时后反应明显，高峰出现在8小时，以及刺激后24小时维持高水平。
本实施例证实可成功地利用本发明方法来检测淋巴细胞的亚型对促细胞分裂原的反应。实施例1和实施例2中所用的PHA是一样的；实施例1和实施例2表示不同的温育时间。
实施例3.T-淋巴细胞反应用抗原和抗体包被的顺磁性颗粒共刺激从正常供体中获取血样，并收集到作为抗凝血剂肝素中。把等分血样50uL在RPMI 1640中以1∶2稀释，然后放置到96孔微量滴定板上。复制物接受或者不添加任何物质、或者终浓度1ug/mL的抗原破伤风类毒素，加上抗-CD3/CD28包被的顺磁性珠(0.5uL)(Dynal，Oslo，Norway)。37℃下将样品温育各种时间(30分钟、1小时、2小时和3小时)。温育后，移去96孔条板并置于磁盘中。洗涤小珠细胞复合体(在含有1％BSA的缓冲液中清洗3次)，并溶解在低渗溶液中。移出50uL等分样品，放置在透明平板上，并加入分析试剂(萤光素/萤光素酶)。样品读数并测定相对光单位(Relative Light Unit)。然后从ATP校准曲线中计算出ATP的产量。
图3表示该分析的结果。正如可见，与背景相比，在30分钟时间点ATP增加，并持续到3小时时间点。该实施例证实本发明方法可成功地检测T-细胞活化，其产生自T-细胞与抗原的共温育，以及检测早至30分钟时间的共刺激物。
实施例4.T-淋巴细胞在HIV感染个体中的反应从正常供体和HIV感染的个体中获取血样，并收集到作为抗凝血剂的肝素中。把等分血样25uL在RPMI 1640中以1∶4稀释，并放置于96孔微量滴定板上。复制物接受或者不添加任何物质、或者终浓度10ug/mL的PHA。把样品37C下温育过夜。温育后，样品中加入包被有抗-CD4的磁珠(20uL)，并在室温温育30分钟。移去96孔条板并置于磁盘内。洗涤小珠细胞复合物(在含有1％牛血清白蛋白(BSA)(Intergen，Newark，NJ)的缓冲液中清洗3次)，并在低渗溶液中溶解。移出50uL的等分样品，放置在透明平板上，并加入分析试剂(萤光素/萤光素酶)。样品读数，并测定相对光单位。然后从ATP校准曲线中计算ATP的产量。
图4表示该分析的结果。正如可见，ATP对免疫抑制(HIV+)群的PHA的反应比对正常供体群的反应要低。
本实施例证实本发明方法可成功地检测或确证人体中的免疫抑制。
尽管本发明根据优选的实施方案进行了描述，但是本领域中的专业技术人员将意识到在附属权利要求的实质和范围内进行修改可实施本发明。因此，本发明方法不应限于上述的实施方案，而应进一步包括所有在此提供的说明书的实质和范围内的修饰或等同物。
权利要求
1.一种检测淋巴细胞活化的方法，其包括如下步骤将含有混合群的包括多数淋巴细胞亚型的细胞类型的样品与至少一种选自促细胞分裂原、抗原和共刺激物的诱导剂温育，其中各种亚型包括的淋巴细胞具有区分一种亚型与另一亚型的特征决定簇；从所述样品中分离选择的淋巴细胞亚型；溶解所述选择亚型中的淋巴细胞以释放选自ATP、NADP和PCNA的胞内成分；检测所述胞内成分的水平；以及从所述检测步骤中检测的所述胞内成分的水平中对所述选择的淋巴细胞亚型的淋巴细胞活化进行评价，其中执行所有步骤所需的总时间不超过1小时。
2.权利要求书1所述的方法，其中所述至少一种诱导剂含有共刺激物。
3.一种检测淋巴细胞活化的方法，其包括如下步骤将含有混合群的包括多数淋巴细胞亚型的细胞类型的样品与至少一种选自促细胞分裂原、抗原和共刺激物的诱导剂温育，其中各种亚型包括的淋巴细胞具有区分一种亚型与另一亚型的特征决定簇；从所述样品中分离选择的淋巴细胞亚型；溶解所述选择亚型中的淋巴细胞以释放选自ATP、NADP和PCNA的胞内成分；检测所述胞内成分的水平；以及从所述检测步骤中检测的所述胞内成分的水平中对所述选择的淋巴细胞亚型的淋巴细胞活化进行评价，其中执行所有步骤所需的总时间少于3小时。
4.权利要求书3所述的方法，其中所述至少一种诱导剂含有共刺激物。
5.一种检测淋巴细胞活化的方法，其包括如下步骤将含有混合群的包括多数淋巴细胞亚型的细胞类型的样品与至少一种选自促细胞分裂原、抗原和共刺激物的诱导剂温育，其中各种亚型包括的淋巴细胞具有区分一种亚型与另一亚型的特征决定簇；从所述样品中分离选择的淋巴细胞亚型；溶解所述选择亚型中的淋巴细胞以释放选自ATP、NADP和PCNA的胞内成分；检测所述胞内成分的水平；以及从所述检测步骤中检测的所述胞内成分的水平中对所述选择的淋巴细胞亚型的淋巴细胞活化进行评价，其中执行所有步骤所需的总时间少于4小时。
6.权利要求书5所述的方法，其中所述至少一种诱导剂含有共刺激物。
7.一种检测淋巴细胞活化的方法，其包括如下步骤将含有混合群的包括多数淋巴细胞亚型的细胞类型的样品与至少一种选自促细胞分裂原、抗原和共刺激物的诱导剂温育，其中各种亚型包括的淋巴细胞具有区分一种亚型与另一亚型的特征决定簇；从所述样品中分离选择的淋巴细胞亚型；溶解所述选择亚型中的淋巴细胞以释放选自ATP、NADP和PCNA的胞内成分；检测所述胞内成分的水平；以及从所述检测步骤中检测的所述胞内成分的水平中对所述选择的淋巴细胞亚型的淋巴细胞活化进行评价，其中执行所有步骤所需的总时间少于24小时。
8.权利要求书7所述的方法，其中所述至少一种诱导剂含有共刺激物。
全文摘要
本发明提供了在共刺激剂有或无的情况下，检测淋巴细胞功能及其对促细胞分裂原或对特异抗原反应的方法。本方法适用于检测淋巴细胞当其作为细胞亚群时的反应，也适用于检测淋巴细胞特异亚型、在其细胞表面具有特征决定簇的各亚群或亚群的亚型的功能。本发明也涉及到此方法使用的试剂盒。本发明方法利于筛选复合生物流体，如全血，是将流体样品与促细胞分裂原或抗原一起温育，加入或不加共刺激元素，用诸如亲和分离的方法分离出所选择的目的亚型，以及检测胞内成分优先是ATP的存在，其作为反应结果有所增加。
文档编号G01N33/569GK1488073SQ02802087
公开日2004年4月7日 申请日期2002年4月17日 优先权日2001年4月17日
发明者彼德·索通, 理查德·J·科瓦尔斯基, J 科瓦尔斯基, 彼德 索通 申请人:西莱克斯公司
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