专利名称：用抗体阵列选择乳腺癌治疗药物的制作方法
用抗体阵列选择乳腺癌治疗药物相关申请的交叉参考本申请是2009/2/24提交的PCT申请PCT/US2009/035013的后续部分，该 PCT申请要求2008/2/25提交的美国临时申请序列号61/031,319、2008/10/24提交的 美国临时申请序列号61/106,404、2008/10/24提交的美国临时申请序列号61/108,384、 2008/11/25提交的美国临时申请序列号61/117,908、以及2008/12/23提交的美国临时 申请序列号61/140,558的优先权，通过引用将这些申请的内容全文纳入本文用于所有目 的。
背景技术：
细胞的信号转导过程负责各种生物学功能，包括细胞分裂和死亡、代谢、免疫 细胞活化、神经传递和感知觉等等。因此，细胞正常信号转导的错乱可导致许多疾病状 态，例如糖尿病、心脏病、自身免疫病和癌症。一种经充分特征鉴定的信号转导途径是MAP激酶途径，其负责转导表皮生长因 子(EGF)的信号从而促进细胞增殖(参见，
图1)。EGF能结合连接酪氨酸激酶的跨膜受 体，即通过EGF结合可活化表皮生长因子受体(EGFR)。EGF与EGFR结合活化了该受 体胞质结构域的酪氨酸激酶活性。该激酶活化的一种结果是EGFR的酪氨酸残基自身磷 酸化。被活化EGFR上的磷酸化酪氨酸残基为含有SH2结构域的衔接蛋白，例如GRB2 的结合提供了停泊位点。作为衔接蛋白，GRB2的功能还能通过GRB2上的SH3结构域 结合鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS。形成EGFR-GRB2-S0S复合物而导致SOS活化(能 促进除去Ras中的GDP)鸟嘌呤核苷酸交换因子。GDP除去后，Ras才能结合GTP而被 活化。活化后，Ras结合并活化一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶-RAF激酶-的蛋 白激酶活性。然后活化蛋白激酶级联反应从而导致细胞增殖。概括地说，RAF激酶随 后磷酸化活化另一种丝氨酸/苏氨酸激酶MEK。活化的MEK磷酸化活化促分裂原活化 的蛋白激酶(MAPK)。MAPK进一步磷酸化的靶标是40S核糖体蛋白S6激酶(RSK)。 MAPK磷酸化RSK可导致RSK激活，进而磷酸化核糖体蛋白S6。MAPK的另一已知靶 标是各种癌症中对细胞增殖至关重要的基因_突变的原癌基因c-Myc。MAPK还能磷酸 化激活另一种蛋白激酶MNK，进而磷酸化转录因子CREB。MAPK也能间接调节Fos基 因的转录，而该基因还编码参与细胞增殖的另一种转录因子。通过改变这些转录因子的 水平和活性，MAPK将EGF的最初胞外信号转换成对细胞周期进程至关重要的基因转录 改变。鉴于信号转导途径在细胞生长中所起的核心作用，信号转导组分的突变和其它 改变导致细胞增殖途径异常激活而产生许多癌症并不令人惊奇。例如，EGFR的过表达 或过度活化与许多癌症，包括多形性成胶质细胞瘤、结肠癌和肺癌相关。这促进开发了 针对EGFR的抗癌药物，包括用于肺癌的吉非替尼(gefitinib)和埃洛替尼(erlotinib)，以 及用于结肠癌的西妥昔单抗(cetuximab)。西妥昔单抗是单克隆抗体抑制剂的一个例子，它能结合EGFR的胞外配体结合结构域，阻止其配体结合活化EGFR酪氨酸激酶。相反，吉非替尼和埃洛替尼是抑制位 于胞内的EGFR酪氨酸激酶的小分子。没有这些激酶活性，EGFR的酪氨酸残基不能自 身磷酸化，而这是下游衔接蛋白，例如GRB2结合的先决条件。通过中断细胞中的信号 级联反应(细胞生长依赖该途径)，减少了肿瘤的增殖和迁移。此外，其它研究显示约70%的人黑色素瘤和较低比例其它肿瘤的Raf基因中含 有导致MAPK途径持久活化的点突变(V599E)(参见，例如Davies等，Nature，417 949-954 (2002))。这些结果提示特定信号转导途径中的突变可能是某些类型肿瘤特征性 的，而信号转导途径的这种特异性改变可能是化疗干预有希望的靶点。鉴于不同的癌症治疗，特别是癌症化疗可能分别通过阻断或活化参与细胞增殖 或死亡的细胞信号转导途径而直接或间接起作用，那么可将某特定形式癌症中的某给定 信号转导途径的活化用作各种癌症治疗方法效力是否良好的指标。因此，除了满足这些 要求外，本发明提供了潜在抗癌治疗对个体患者效力的评估方法。因此，本发明提供了 协助医师为各患者选择剂量合适和时间合适的癌症治疗的方法。发明简述本发明提供检测肿瘤细胞(例如，乳腺肿瘤的循环细胞)中信号转导途径诸组分 活化状态的组合物和方法。可利用实施本发明获得的信号转导途径诸组分活化状态的信 息进行癌症的诊断、预后和设计癌症治疗方法。本发明一方面提供选择治疗乳腺肿瘤合适抗癌药物的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药物后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药物一起培 育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；和(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药物时所产生的参比活化 状态，确定该抗癌药物是否适于治疗该乳腺肿瘤。在一个优选实施方式中，选择治疗乳腺肿瘤合适抗癌药物的方法包括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药物一起培 育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药物时所产生的参比活化 状态；和(e)当一种或多种分析物测得的活化状态比参比活化状态实质性降低时，表明该 抗癌药适合治疗乳腺肿瘤。在一些实施方式中，本发明的方法可用于帮助或辅助筛选治疗乳腺肿瘤的合适 抗癌药。在其他实施方式中，本发明的方法可用于促进对治疗乳腺肿瘤合适抗癌药的筛选。在另一方面，本发明提供鉴定乳腺肿瘤对抗癌药治疗反应的方法，所述方法包 括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；和(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药时所产生的参比活化状 态，鉴定该乳腺肿瘤是否对该抗癌药有反应或无反应。在一优选实施方式中，鉴定乳腺肿瘤对抗癌药治疗反应的方法包括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；(d)比较一种或多种分析物的活化状态与缺乏抗癌药时所产生的参比活化状态； 和(e)当一种或多种分析物测得的活化状态比参比活化状态实质性降低时，表明该 乳腺肿瘤对于用该抗癌药治疗有反应。在一些实施方式中，本发明的方法可用于帮助或辅助鉴定乳腺肿瘤对抗癌药治 疗的反应。在其他实施方式中，本发明的方法可用于促进对某抗癌药治疗有反应的乳腺 肿瘤的鉴定。在还有另一方面，本发明提供预测患乳腺肿瘤对象对抗癌药治疗有无反应的方 法，所述方法包括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；和(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药时所产生的参比活化状 态，预测该对象对该抗癌药治疗有反应的可能性。在一优选实施方式中，预测患乳腺肿瘤对象对抗癌药治疗有无反应的方法包 括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离肿瘤细胞与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(C)用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液进行试验，检 测细胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚在固体支持物 上；
(d)比较一种或多种分析物的活化状态与缺乏抗癌药时所产生的参比活化状态； 和(e)当一种或多种分析物的活化状态比参比活化状态实质性降低时，表明该对象 对该抗癌药治疗可能有反应。在一些实施方式中，本发明的方法可用于帮助或辅助预测对象对抗癌药治疗有 反应的可能性。在其他实施方式中，本发明的方法可用于促进对象可能对抗癌药治疗有 反应的预测。在还有一方面，本发明提供具有优秀动态范围的阵列，其包含多个束缚于固体 支持物上的系列稀释捕捉抗体，各系列稀释捕捉抗体是对应于细胞提取物中信号转导途 径组分的一种或多种分析物或其他蛋白质(如细胞核激素受体)的特异性抗体。本文所 述的可寻址阵列尤其可用于测定涉及乳腺癌信号转导分子和其他蛋白质的表达和/或活 化状态。在另一方面，本发明提供了一种检测截短受体存在(或不存在)的方法，所述方 法包括以下步骤(a)将细胞提取物与多个全长受体胞外域(ECD)结合区的特异珠一起培育；(b)从细胞提取物中除去多个珠，从而除去全长受体形成缺乏全长受体的细胞提 取物；(c)将不含全长受体的细胞提取物与多个捕捉抗体一起培育，其中所述多个捕捉 抗体是截短受体胞内域(ICD)结合区的特异性抗体，该多个捕捉抗体被束缚在固体支持 物上，从而形成多个被捕获的截短受体；(d)将该多个被捕获截短受体与相应截短受体的特异性检测抗体一起培育，形成 多个可检测的被捕获截短受体；(e)将多个可检测的被捕获截短受体与信号放大对第一和第二成员一起培育，产 生放大的信号；和(f)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。在一相关方面，本发明提供了一种检测截短受体存在(或不存在)的方法，所述 方法包括以下步骤(a)将细胞提取物与多个全长受体胞外域(ECD)结合区特异珠一起培育；(b)从所述细胞提取物中除去多个珠，从而除去全长受体形成缺乏全长受体的细 胞提取物；(c)将不含全长受体的细胞提取物与多个捕捉抗体一起培育，其中所述多个捕捉 抗体是截短受体胞内域(ICD)结合区的特异性抗体，该多个捕捉抗体被束缚在固体支持 物上，从而形成多个被捕获的截短受体；(d)将该多个被捕获截短受体与检测抗体一起培育形成多个可检测的被捕获的截 短受体，所述检测抗体包含相应被截短受体的特异性多个活化状态非依赖性抗体和多个 活化状态依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助分子标记，活化状态依赖性抗体用信号 放大对的第一成员标记，所述辅助分子能产生传送给信号放大对第一成员并与之反应的 氧化剂；
(e)将多个可检测的被捕获的截短受体与信号放大对第二成员一起培育，产生放 大的信号；和(f)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。本领域技术人员从以下详述和附图可以明白本发明的其它目的、特征和优点。附图简要说明图1显示了可用于实施本发明的参与细胞增殖的信号转导途径的例子。描述了 细胞用于将丝裂信号转变成细胞增殖的EGFR/MAPK/ERK途径的诸组分。图2显示了本发明的一个实施方式，其中，本文所述的邻近试验可检测磷酸化 EGFR(pEGFR)和磷酸化HER-2 (pHER_2)，其灵敏度为一个细胞。图3显示了本文所述的邻近试验检测HER-2为高特异性试验，可检测一个细胞 水平细胞表达的HER-2。图4是用本发明可寻址阵列选择癌症治疗期间药物的示意图。图5显示了包含受体酪氨酸激酶途径诸组分，例如EGFR/MAPK/ERK途径诸组 分稀释抗体的可寻址阵列的示意性例子。四种不同稀释度的抗体一式3份被固定在可寻 址阵列上。图6显示了包含肿瘤血管生成中被活化的信号转导途径诸组分的稀释抗体的可 寻址阵列的示意性例子。以四种不同稀释度的抗体一式3份被固定在可寻址阵列上。图7显示了包含肿瘤血管生成中被活化的信号转导途径诸组分的稀释抗体的另 一种可寻址阵列的示意性例子。四种不同稀释度的抗体一式3份被固定在可寻址阵列 上。图8显示了包含肿瘤血管生成中被活化的受体酪氨酸激酶途径和信号转导途径 诸组分的稀释抗体的可寻址阵列的示意性例子。四种不同稀释度的抗体以一式3份被固 定在可寻址阵列上。图9显示了包含肿瘤血管生成中被活化的受体酪氨酸激酶途径和信号转导途径 诸组分的稀释抗体的另一种可寻址阵列的示意性例子。系列稀释的抗体一式3份被固定 在可寻址阵列上。图10显示了 5份乳腺癌样品和6份正常样品EGFR磷酸化的相对水平。数据也
显示于表40。图11显示了 5份乳腺癌样品和6份正常样品HER-2磷酸化的相对水平。数据 也显示于表41。图12显示了 5名乳腺癌患者的Veridex CellSearch 系统的CTC染色图像。对 照细胞系是A431 (EGFR阳性)和SKBr3 (HER-2阳性)。图13显示，可用能与附着于聚苯乙烯珠或多聚葡聚糖的ErbB2胞外域结合的抗 体来除去患者样品中的全长HER-2 (ErbB2)。图14显示了本发明检测截短受体如p95ErbB2的一个实施方式。SA =链霉亲和 素；HRP =辣根过氧化物酶；TSA =酪酰胺信号扩增。图15显示，用抗ErbB2(HER_2)胞外域(ECD)的抗体包被预处理珠，几乎完全 除去了全长ErbB2信号而不影响ErbB2胞内域(ICD)信号。图16显示，APMA((4-氨基苯基)醋酸汞)处理提高了 BT-474细胞的p95ErbB2磷酸化。图17显示，异调蛋白(heregulin)提高了 T47D细胞的p95ErbB2磷酸化。图18显示了对于选择适合特定患者乳腺癌的治疗方法，可用本发明方法影响临 床实践的几个(干预)点。图19显示了本发明试验模式的一个实施方式，该试验依赖于连有酶的两种额外 检测抗体的共同定位，以随后引导各靶蛋白的结合。图20显示了 pHER-Ι和pHER_2试验的灵敏度为单个细胞。图21显示了用EGF或HRG B处理后各细胞系的ErbB表达/活化。图22显示了用EGF或HRG β刺激得到的T47D ErbB RTK状态。图23显示了 ErbB途径阵列的一个示范性实施方式。发明详述I.引言如上所述，参与细胞增殖信号转导途径的活化和参与细胞死亡途径的灭活是许 多不同类型癌症分子特征的非限制性例子。在许多情况中，特定信号转导途径及其诸组 分的活化可作为某给定类型癌症的分子特征。这些活化的组分还可为治疗干预提供有用 的靶点。因此，了解治疗之前、期间和之后癌细胞内特定信号转导系统的活化水平可为 医师提供用于选择合适治疗进程的高度相关信息。此外，随治疗进展持续监测癌细胞中 的信号转导途径活化状态可为医师提供治疗效果的额外信息，例如，当癌细胞通过进一 步变异导致同一或另一信号转导途径活化因而对治疗耐受时，可提醒医师是否继续特定 治疗或改用另一治疗方法，。因此，本发明提供用特异性的多重高通量试验，检测肿瘤组织或肿瘤外细胞， 例如实体瘤的稀少循环细胞中多种失调信号转导分子的表达和活化状态的方法和组合 物。本发明还提供选择合适的治疗药物(单一药物或药物组合)以下调或关闭失调信号 转导途径的方法和组合物。因此，利用本发明将有利于为癌症患者设计个性化的治疗。通过测定单个细胞水平的信号转导途径是否活化而能检测和鉴定循环肿瘤细胞 是本发明的重要优点。“微小转移”的肿瘤细胞(播散的肿瘤细胞)常见于各种癌症早期 阶段的患者血液中，也见于转移癌。血液中肿瘤细胞的数量取决于肿瘤的阶段和类型。 虽然通�？苫竦迷⑿灾琢龅幕罴煅罚蠖嗍屏鑫薹ɑ罴欤沟眉讯哉庵种� 瘤样品进行分子分析。在肿瘤转移期间，大多数侵袭性肿瘤细胞离开原发性肿瘤，通过 血液和淋巴系统转移到达远端部位。因此，血液中的循环肿瘤细胞代表了肿瘤细胞中最 具侵袭性的均质细胞群。然而，血液中转移性肿瘤细胞的数量常常极低，从每毫升血液 含1个到数千个细胞不等。能够分离这种稀少细胞和检验其信号转导途径及利用该信息 更有效地治疗癌症是本发明的目的之一。在一些实施方式中，本发明的多重高通量免疫试验能以单个细胞水平检测实体 瘤循环细胞中一种或多种信号转导分子的活化状态。事实上，对信号转导分子，如EGFR 的检测灵敏度可达到约100个10_21摩尔(zeptomole)，线性动态范围约为100个10_21摩尔 到约100毫微微摩尔(femtomole)。因此，稀少循环细胞中多种信号转导分子活化状态的 单细胞检测有助于癌症预后和诊断以及设计个性化的靶向治疗。稀少循环细胞包括实体瘤转移或微小转移的实体瘤循环细胞。循环肿瘤细胞、
18癌症干细胞和迁移至肿瘤(因趋化作用)的细胞，例如循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、 循环前血管原髓样细胞和循环树突细胞是与实体瘤相关的循环细胞的一些例子。通常在分离这种循环细胞后不久，优选在约24、6或1小时内，更优选在约30、 15或5分钟内提取感兴趣的信号转导分予以保留它们的原位活化状态。也可将分离的细 胞与通常为纳摩尔到微摩尔浓度的一种或多种生长因子一起培育约1-30分钟，以恢复或 刺激信号转导分子活化(参见，例如Irish等，Cell, 118 217-228(2004))。如本文更详细解释的那样，为评估用于某患者个体的可能抗癌治疗，可将其分 离的细胞与不同剂量的一种或多种抗癌药一起培育。然后用生长因子刺激数分钟(例 如，约1-5分钟)或数小时(例如，约1-6小时)。用和不用抗癌药来差异激活信号转导 途径有助于为各患者个体选择合适剂量的合适癌症治疗方法。也可分离抗癌药治疗期间 患者样品的循环细胞用一种或多种生长因子刺激以确定是否应改变治疗。因此，本发明 方法有利于帮助临床医生为每位患者提供剂量正确时间正确的正确抗癌药。就乳腺癌而言，目前的检测选项并不令人满意，因为对乳腺癌患者原发和转移 性肿瘤的治疗都是根据获自疾病早期活检样品时的诊断。具体说，由于实际上不能获得 转移癌患者的活检样品，对乳腺癌早期和转移阶段的治疗性干预都仅仅根据对取自疾病 早期活检样品的初步诊断。然而，乳腺肿瘤会随时间和治疗而演变，因此对乳腺肿瘤的 时序监测是优化乳腺癌患者治疗方法的关键。例如，受体酪氨酸激酶ErbB(HER)家族一 个或多个成员活化状态的改变可能会影响对复发的治疗选择。实际上，常见原发与转移 癌症之间的HER-2状态不一致，因为高达37%的乳腺癌患者从HER-2-阴性原发性肿瘤 转变为HER-2-阳性转移癌。此外，由于HER-1/2活化，患者可能会重新耐受激素治疗 或对激素治疗产生获得性耐受。在一些情况下，由于存在表达p95HER_2的肿瘤细胞， 患者可能会重新耐受ErbB-靶向治疗或对ErbB-靶向治疗产生获得性耐受。结果，由于 目前的技术缺乏灵敏度和特异性，不能用于监测患者的治疗，不能利用信号转导途径模 式来指导对个体治疗的决策，因此临床上迫切需要能帮助医师在适当时间处方给予合适 的癌症治疗药物的试验。与目前使用的乳腺癌检测选项相反，本发明方法通过采用例如血液循环肿瘤细 胞(CTC)和/或细针抽吸物(RNA)等样品，对实体乳腺肿瘤作“实时活检”而能够监 测乳腺癌患者疾病的所有阶段。一个非限制性例子是，本文所述的乳腺癌试验可用于疾 病早期患者的乳腺癌初步诊断。采用本文所述的单一检测或邻近0双重检测试验，通过 对有和没有抗癌药时特定信号传导途径活化状态模式的分析，可以指导选择合适的癌症 治疗。由于治疗性干预可根据疾病任何阶段获得的样品用本文所述的单一检测或邻近双 重检测试验分析，因此本发明方法也可有利地用于监测疾病的发展或消退。因此，通过 实时诊断和对特定信号传导途径分子活化状态的分析，可指导对乳腺癌早期或转移阶段 合适的癌症治疗药物的选择。本发明的方法可有利地解决癌症治疗中的关键问题并为乳腺癌患者提供更高的 护理标准，因为它(1)灵敏度高(例如，检测所有的和磷酸化的信号转导分子如EGFR 和HER-2时可实现单个细胞检测，(2)特异性高(例如，三抗体邻近试验检测磷酸化信号 转导分子的特异性高)，(3)可对转导途径的概况进行分析(例如，可检测患者的CTC或 FNA中特定信号转导分子的活化状态)，和(4)减轻了获得患者样品带来的问题(例如，很少的肿瘤细胞就可试验检测)。尽管任何样品都可用于本文所述的新试验，但CTC特 别有效，因为它们代表了最具侵袭性的肿瘤细胞，已知每种肿瘤都会排出CTC，它们可 能是残余肿瘤或难以触及转移肿瘤的唯一来源，并且可出现在血液中。因此，本发明的 方法能够连续采集乳腺肿瘤组织的样品，得到肿瘤细胞随时间和治疗方法而变的有价值 信息，为医师提供快速监测变化的癌症途径特征的方法。总之，本发明方法有利地提供了对癌症患者(如乳腺癌患者)的精确选择和监 测，采用基于多种抗体的单一检测或邻近试验对容易获得的肿瘤细胞进行转导途径概况 的分析，而最可能有益于靶向治疗。II.定义除非另有规定，本文所用的以下术语具有归于它们的含义。术语“癌症”包括特征是异常细胞不受控制生长的疾病类型的任何成员。该术 语包括所有已知的癌症和肿瘤病症，无论其特征是恶性、良性、软组织或是实体，以及 所有阶段和等级的癌症，包括转移前和后癌症。不同类型癌症的例子包括但不限于乳 腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)；消化道和胃肠道癌，例如结肠直肠癌、胃肠道间质 瘤、胃肠类癌肿瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和胃癌；食道癌；胆囊 癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌(appendix cancer)；乳腺癌；卵巢癌；肾癌(例如，肾细胞 癌)；中枢神经系统癌；皮肤癌；淋巴瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨肉瘤；和血癌。本文 所用的“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。在一个优选实施方式中，所述乳腺肿瘤为对象 的侵袭形式或原位形式导管癌或小叶癌。在另一个优选实施方式中，所述乳腺肿瘤为对 象的复发或转移乳腺癌。术语“分析物”包括测定其存在、含量和/或身份的任何感兴趣分子，通常是 大分子，例如多肽。在某些例子中，分析物是实体瘤循环细胞的一种细胞组分，优选信 号转导分子。本文所用的术语“系列稀释液”包括一系列浓度递降的特定样品(例如，细胞 裂解液)或试剂(例如，抗体)。一般通过以下过程产生系列稀释液混合测定量的起 始浓度样品或试剂与稀释液(例如，稀释缓冲液)产生较低浓度的样品或试剂，重复该过 程足够次数获得所需数量的系列稀释液。可将样品或试剂系列稀释至少2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、或 1000-倍而产生包含 至少 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 25、 30、35、40、45、或50种浓度递降的样品或试剂的系列稀释液。例如，为制造包含起始 浓度为1毫克/毫升的捕捉抗体试剂的2-倍系列稀释液，可将一定量起始浓度的捕捉抗 体与等量稀释缓冲液混合，产生浓度为0.5毫克/毫升的捕捉抗体，重复该过程获得浓度 为0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.0625毫克/毫升、0.0325毫克/毫升等的捕捉 抗体。术语“优秀的动态范围”在本文中指该试验能够检测少至1个细胞或多至数千 细胞中的特异性分析物。例如，本文所述免疫试验能用捕捉抗体浓度的系列稀释液有效 地检测约 1-10,000 个细胞(例如，约 1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、 1000、2500、5000、7500或10,000个细胞)中感兴趣的特定信号转导分子，因此具有高
的动态范围。
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术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括细胞中胞外信号或刺激转变成 反应过程的蛋白质和其它分子，转导过程通常涉及细胞内的生物化学反应有序序列。信 号转导分子的例子包括但不限于受体酪氨酸激酶，例如EGFR(例如，EGFR/HER-1/ ErbBU HER_2/Neu/ErbB2、HER_3/ErbB3、HER_4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-1、 VEGFR-2/FLK-l/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如，PDGFRA、 PDGFRB)、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受 体-相关受体)、CSF-1R、FGFR 1-4、HGFR1-2、CCK4、TRK A-C> MET、RON、 EPHA 1-8, EPHB 1-6、AXL> MER、TYR03、TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 卜2、 RET、c-ROS> V-钙粘蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(退行发育性淋巴瘤激 酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3、RTK 106以及受体酪氨酸激酶的截短形式如 p95ErbB2 ；非受体酪氨酸激酶，例如 BCR-ABL、Src> Frk、Btk> Csk、Abl> Zap70、 Fes/Fps、Fak> Jak、Ack和LIMK ；酪氨酸激酶信号转导级联组分，例如Akt、MAPK/ ERK、MEK、RAF> PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、PI3K、Ras (例 如，K-Ras、N-Ras> H-Ras) > Rho> RacU Cdc42、PLC、PKC> p70S6 激酶、p53、 细胞周期蛋白 Dl、STATU STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、 ROCK、IP3、TSP-U NOS> PTEN、RSK 1-3、JNK、c_Jun、Rb、CREB> Ki67 和桩蛋 白；核激素受体如雌激素受体(CR)、孕酮受体(PR)、雄激素受体、糖皮质激素受体、 盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类视色素受体、甲状腺激素受体和孤 儿受体；核受体辅激活物和抑制物，分别例如AIBl (在乳腺癌-1中扩增)和核受体辅阻 遏物I(NCOR);以及它们的组合。本文所用的术语“循环细胞”包括实体瘤转移或微小转移的肿瘤外细胞 (extratumoral cell)。循环细胞的例子包括但不限于循环肿瘤细胞、癌症干细胞和/或 迁移至肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环前血管原髓样细胞、 循环树突细胞等)。本文所用的术语“样品”包括获自患者的任何生物学样本。样品包括但不限 于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如，外周血单个核细胞)、导管洗出液、 乳头抽吸物、淋巴(例如淋巴结的弥散性肿瘤细胞)、骨髓抽吸物、唾液、尿液、粪便 (即，排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、细针抽吸物(例如通过随机乳晕缘细针抽吸 获得)、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)，如肿瘤活检(例如，针吸活检)或 淋巴结活检(例如前哨淋巴结活检)样品和它们的细胞提取物。在一些实施方式中，样 品是全血或其组分，例如血浆、血清或细胞沉淀。在优选的实施方式中，采用本领域已 知的技术分离全血中的实体瘤循环细胞或其细胞组分而获得样品。在其它实施方式中， 样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织样品，例如获自乳腺的实体瘤。“活 检”指取出组织样品以供诊断或预后评估的过程，也指组织样品本身。可将本领域已知 的任何活检技术应用于本发明的方法和组合物。所用的活检技术通常取决于待评估的组 织类型和肿瘤大小及类型(即，实体瘤或悬浮细胞(即，血液或腹水))等因素。代表性 活检技术包括切除活检、切开式活检、针吸活检(例如，芯针活检、细针抽吸活检等)、 手术活检和骨髓活检。活检技术的描述可参见，例如Harrison' s Principles of Internal Medicine(内科学哈里森原理)，Kasper等编，第16版，2005，第70章，以及整个第V部分。本领域技术人员将明白，可通过活检技术来鉴定给定组织样品中的癌细胞和/或 前癌细胞。术语“对象”或“患者”或“个体”通常包括人，但也可包括其它动物，例如 其它灵长类、啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。“阵列"或"微阵列"包括固定或束缚于固相支持物上的分散和/或系列稀释 捕捉抗体，所述固相支持物例如有玻璃(例如，玻璃载玻片)、塑料、芯片、针、滤膜、 珠(例如，磁珠，聚苯乙烯珠，等等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素，聚偏二氟乙 烯(PVDF)等膜)、纤维束或任何其他合适的基材。捕捉抗体一般通过共价或非共价相 互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)而固定或束缚 于固体支持物上。某些情况下，捕捉抗体包含能与结合于固相支持物的捕获剂相互作用 的捕获尾。本发明试验所用的阵列通常包含偶联于固体支持物表面的不同已知/可寻址 位置的多个不同捕捉抗体和/或不同浓度的捕捉抗体。术语"捕捉抗体"意指包括对样品中一种或多种感兴趣分析物如实体瘤循环细 胞的细胞提取物具有特异性(即，结合、被结合或形成复合体)的固定抗体。在优选的 实施方式中，捕捉抗体束缚于阵列中的固体支持物上。用于将各种信号转导分子固定在 固体支持物上的合适捕捉抗体可购自加利福尼亚州泰姆库拉市奥普斯特公司(Upstate， Temecula，CA)、加利福尼亚州卡马里奥市生物资源公司(Biosource，Camarillo, CA)、 马萨诸塞外丨丹弗斯市细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technologies，Danvers， ΜΑ)、明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司(R&D Systems，Minneapolis, MN)、加 利福尼亚州弗里蒙特市LV公司(Lab Vision，Fremont, CA)、加利福尼亚州圣克鲁斯市 圣克鲁斯生物技术公司(Santa Craz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、密苏里州圣路易斯 市西格玛公司(Sigma，St.Louis, MO)和加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司(BD Biosciences, San Jose, CA)。本文所用的术语“检测抗体”包括含有可检测标记的对样品中感兴趣的一种 或多种分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的抗体。该术语还 包括对于感兴趣的一种或多种分析物具有特异性的抗体，该抗体可被包含可检测标记的 另一种抗体结合。可检测标记的例子包括但不限于生物素/链霉亲和素标记、核酸 (例如，寡核苷酸)标记、化学反应活性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记和它们 的组合。用于检测各种信号转导分子中任何一种活化状态和/或总量的合适的检测抗 体可购自加州特默库拉奥普斯特公司(Upstate，Temecula, CA)、加州卡玛利奥的生物 源公司(Biosource，Camarillo, CA)、马萨诸塞州丹维斯的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ)、明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&D Systems, Minneapolis, MN)、加州弗里蒙特的实验室视觉公司(Lab Vision，Fremont, CA)、加州桑塔库兹的桑塔库兹生物技术公司(Santa Craz Biotechnology，Santa Cruz, CA)、密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis, MO)、以及加州圣何塞的BD 生物科技公司(BD Biosciences，San Jose，CA)。一个非限制性的例子是，抗EGFR、 c-KIT、c-Src> FLK-I、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK、PTEN、Raf 和 MEK 等 信号转导分子各种磷酸化形式的磷酸化特异性抗体可购自桑塔库兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。
术语“活化状态依赖性抗体”包括对样品中感兴趣的一种或多种分析物的 特定活化状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的检测抗体。在 优选的实施方式中，所述活化状态-依赖性抗体能检测一种或多种分析物，例如 一种或多种信号转导分子的磷酸化、遍在蛋白化和/或复合状态。在一些实施方 式中，利用活化状态依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶EGFR家族诸成员的磷酸化 和/或EGFR家族成员之间形成的异质二聚体复合物。适合用活化状态依赖性抗 体检测的活化状态(括号中所列)的非限制性例子包括EGFR(EGFRvIII、磷酸 化(p-)EGFR、EGFR She、遍在蛋白化(u_)EGFR、p-EGFRvIII) ； ErbB2 (p95 截短的(Tr)_ErbB2、p_ErbB2、p95 Tr_p_ErbB2、Her-2 She、ErbB2 : PI3K、 ErbB2 EGFR、ErbB2 : ErbB3、ErbB2 : ErbB4) ； ErbB3 (p_ErbB3、ErbB3 : PI3K、 p-ErbB3 PI3K、ErbB3 She) ； ErbB4 (p_ErbB4、ErbB4 She) ； ER (p-ER(S118, S167) ； IGF-lR(p-IGF-lR, IGF-IR IRS, IRS PI3K, p-IRS, IGF-IR PI3K) ； INSR(p-INSR) ； KIT (p-KIT) ； FLT3 (p-FLT3) ； HGFRI (p-HGFRI)； HGFR2 (p-HGFR2) ； RET (p-RET) ； PDGFRa (p-PDGFRa) ； PDGFRP (p-PDGFRP)； VEGFRI (ρ-VEGFRI，VEGFRI PLCg, VEGFRl Src) ； VEGFR2 (p_VEGFR2， VEGFR2 PLCy, VEGFR2 Src, VEGFR2 硫酸肝素，VEGFR2 VE-钙粘蛋白)； VEGFR3 (p-VEGFR3) ； FGFRl (p-FGFRl) ； FGFR2 (p-FGFR2) ； FGFR3 (p-FGFR3)； FGFR4 (p-FGFR4) ； Tiel (p—Tiel) ； Tie2 (p-Tie2) ； EphA (p-EphA) ； EphB (ρ-EphB)； NFKB 禾口 / 或 IKB(p_IK(S32)，p—NFKB (S536)，p-P65 IKBa) ； Akt(p_Akt(T308， S473) ) ； PTEN(p-PTEN) ； Bad (p-Bad (S 11 2 , S136) , Bad 14-3-3)； mTor(p-mTor(S2448)) ； p70S6K(p-p70S6K(T229, T389)) ； Mek(p-Mek(S217, S221)) ； Erk (p-Erk(T202，Y204)) ； Rsk-1(p_Rsk_1(Τ357，S363))； Jnk(p-Jnk(T183, Y185)) ； P38 (p-P38 (T180, Y182)) ； Stat3 (p-Stat-3 (Y705，S727))； Fak(p-Fak(Y576)) ； Rb (p-Rb (S249, T252，S780)) ； Κ 67 ； p53 (p-p53 (S392, S20))； CREB (p-CREB(S133)) ； c_Jun (p-c-Jun (S63)) ； cSrc (p-cSrc (Y416))；和桩蛋白(ρ-桩 蛋白(Υ118))。术语“活化状态非依赖性抗体”包括对样品中感兴趣的一种或多种分析物具有 特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)而无论它们的活化状态的检测抗体。例 如，活化状态非依赖性抗体可检测一种或多种分析物，例如一种或多种信号转导分子的 磷酸化和非磷酸化形式。术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸及其聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的 主链残基或连接键的核酸，可以是合成的、天然产生的和非天然产生的，具有与参比 核酸相似的结合特性。这种类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、胺基磷酸酯 (phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2 ‘ -O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸 (PNA)。除非另有限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，具有与参比 核酸相似的结合特性。除非另有表述，特定核酸序列还暗示包括其保守性修饰的变体和 互补序列以及明确示出的序列。术语“寡核苷酸”指RNA、DNA、RNA/DNA杂交的单链寡聚物或聚合物和/
23或其模拟物。在某些情况中，寡核苷酸由天然产生(即，未修饰)的核碱基、糖和核苷 间(主链)连接键构成。在某些其它例子中，寡核苷酸包含修饰的核碱基、糖和/或核 苷间连接键。本文所用的术语“错配基序”或“错配区”指寡核苷酸中与其互补序列不100% 互补的部分。寡核苷酸可含有至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区。错配区可以 是连续的，或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸隔开。错 配基序或区域可包含一个核苷酸或可包含2、3、4、5或更多个核苷酸。短语“严格杂交条件”指寡核苷酸与其互补序列杂交，但不与其它序列杂交的 条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中会有差异。较长的序列在较高温度下特 异性杂交。有关核酸杂交的广泛指南可参见Tijssen，《生物化学和分子生物学技术-与核 酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Probes)中的“杂交原理和核酸试验策略综述” Overviewofprinciplesofhybridizationand the strategy of nucleic acid assays) (1993)。选择的严格条件通常比具体序列在规定的离子 强度和pH时的热解链温度(Tm)低约5-10°C。1 是在规定的离子强度、pH和核酸浓 度下，与靶序列互补的50%探针与靶序列杂交达到平衡时的温度(由于存在过量的靶序 列，Tm时，平衡时有50%的探针被占据)。还可加入去稳定剂例如甲酰胺来获得严格条 件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。术语“实质上相同”或“实质性相同”的两条或多条核酸，指例如采用序列 比较算法或通过手工比对和目测观察进行比较和比对时，在比较窗口或指定区域具有的 最大对应性，含有相同或相同特定百分比的核苷酸(即，在特定区有至少约60%，优选 至少约65%、70%, 75%, 80%, 85%, 90%或95%相同性)的两条或多条序列或子序 列。当文中示出该定义时，还类似地指某序列的互补序列。优选在至少长约5、10、15、 20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸的区域具有实质相同性。所用术语"培育"与“接触”和“暴露”含义相同，不暗指任何具体的时间或 温度要求，除非另有说明。III.实施方式描述在一个实施方式中，本发明提供采用特异性的多重高通量试验，检测衍生自肿 瘤组织的肿瘤细胞或实体瘤循环细胞中的多种失调信号转导分子表达和活化状态的方 法。本发明还提供选择合适治疗药物的方法和组合物，以下调或关闭一种或多种失调的 信号转导途径。因此，可根据收集到的某给定患者肿瘤中活化的信号转导蛋白所提供的 特定分子特征，采用本发明实施方式来帮助设计个性化治疗。实体瘤循环细胞包括实体瘤转移或微小转移的细胞，包括癌症干细胞或迁移至 肿瘤的细胞(例如，因趋化作用)，例如内皮祖细胞、循环内皮细胞、周质细胞、循环前 血管原髓样细胞、树突细胞等等。含有循环细胞的患者样品可获自任何可得的生物学液 体(例如，全血、血清、血浆、痰、支气管灌洗液、尿液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、 细针抽吸物等)。在某些情况中，将全血样品分成血浆或血清组分和细胞组分(即，细胞 沉淀)。细胞组分通�：泻煜赴�、白细胞和/或实体瘤循环细胞，例如循环肿瘤细胞 (CTC)、循环内皮细胞(CEC)、循环内皮祖细胞(CEPC)、癌症干细胞(CSC)、淋巴结的 弥散性肿瘤细胞和它们的组合。血浆或血清组分通�：惺堤辶龅难废赴头诺暮怂�(例如，DNA、RNA)和蛋白质。通常采用一种或多种分离方法分离患者样品中的循环细胞，所述方法包 括，例如免疫磁性分离(参见，例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95 4589-4594(1998) ； Bilkenroth 等，Int.J.Cancer，92: 577-582(2001))、宾夕法尼州亨廷 顿谷的伊缪尼康公司(Immunicon，Huntingdon Valley, PA)的CellTrack 系统、微流体 分离(参见，例如 Mohamed 等，IEEE Trans.Nanobiosci.，3 251-256(2004) ； Lin 等，第 5147号摘要，第97届AACR年会，华盛顿，哥伦比亚特区，(2006))、FACS(参见，例 如 Mancuso 等，Blood，97: 3658-3661(2001))、密度梯度离心(参见，例如 Baker 等， Clin.CancerRes.，13 4865-4871 (2003))和消除法(参见，例如 Meye 等，Int.J.Oncol., 21 521-530(2002))。为保留原位活化状态，宜在分离细胞后不久，优选在96、92、48、24、6或1 小时内，更优选在约30、15或5分钟内提取信号转导物。还优选将分离的细胞与通 常纳摩尔到微摩尔浓度的生长因子一起培育约1-30分钟以恢复或刺激信号转导分子活 化(参见，例如Irish等，Cell, 118 217-228 (2004)) 0 刺激性生长因子包括表皮生长 因子(EGF)、异调蛋白(HRG)、TGF-a、PIGF > 血管生成素(Ang)、NRGU PGF > TNF-a、VEGF > PDGF > IGF、FGF > HGF >细胞因子等等。为评估用于患者个体的潜 在抗癌治疗药物，将分离的细胞与各种剂量的一种或多种抗癌药一起培育然后用生长因 子刺激。生长因子刺激可进行数分钟或数小时(例如，1-5分钟或1-6小时)。用和不 用抗癌药的信号转导途径活化差异有助于为各患者个体选择合适剂量的合适癌症治疗药 物。在分离、抗癌药物处理和/或生长因子刺激后，可用本领域已知的技术裂解细胞提 取信号转导分子。优选在生长因子刺激后约1-360分钟之间开始细胞裂解，更优选在两 个不同时间间隔(1)在生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)在生长因子刺激后约30-180 分钟之间开始细胞裂解。或者，可将裂解液保存于-80°C待用。在一些实施方式中，抗癌药包括能干扰癌细胞中活化信号转导途径组分功能的 药物。这种药物的非限制性例子包括表1所列那些。表 权利要求
1.一种选择用于治疗乳腺肿瘤的合适抗癌药物的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药物后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离乳腺肿瘤细胞后将其与抗癌药一起 培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)采用包括一种或多种分析物特异性捕捉抗体的多个系列稀释液的试验来检测细胞 提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚于固体支持物上；和(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药物时产生的参比活化状态， 确定该抗癌药是否适于治疗该乳腺肿瘤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳腺肿瘤来自患有乳腺导管癌或小叶 癌的对象。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述导管癌是浸润性导管癌或原位导管癌。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小叶癌是浸润性小叶癌或原位小叶癌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包括乳腺肿瘤的循环细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离法，分离样品中的循环 细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品选自全血、血清、血浆、导 管洗出液、乳头抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自循环肿瘤细胞、循 环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、播散的肿瘤细胞和它们的组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织分离的细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是原发性肿瘤或转移性肿 瘤组织。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织的细针抽吸物样 品分离的细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述的分离细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自单克隆抗体、酪氨酸 激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体选自群司珠单 抗(赫赛汀 )、阿仑单抗(Campath )、贝伐单抗(Avastin )、西妥昔单抗(Erbitux )、吉 姆单抗(Mylotarg )、帕尼妥莫单抗(Vectibix )、利妥昔单抗(Rituxan )、托西莫单抗 (BEXXAR )和它们的组合。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自吉 非替尼(Iressa )、苏尼替尼(Sutent )、埃洛替尼(Tarceva )、拉帕替尼(Tykerb )、卡那替 尼(Cl 1033)、塞玛昔尼(SU5416)、瓦塔拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉芬尼(BAY 43-9006)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec )、来氟米特(SU101)、凡达它尼(ZACTIMA ； ZD6474)；和它们的组合。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自培美曲塞 (ALIMTA )、吉西他滨(Gemzar )、西罗莫司(雷帕霉素)、雷帕霉素类似物、钼化合物、碳钼、顺钼、沙钼、紫杉醇(Taxd )、多西他赛(Taxotere )、他西络莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)和它们的组合。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述激素治疗剂选自芳香酶抑制 剂、选择性雌激素受体调节剂、类固醇、非那雄胺、促性腺素释放素、其药学上可接受 的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、以及它们的组合。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述放疗剂选自47Sc、64Cu,67Cu、 89Sr, 86Y, 87Y、90Y、105Rh, 111Ag, 111Iik 117mSn、149Pm, 153Sm, 166Hck 177Lu, 186Re, 188Re、211At, 212Bi和它们的组合。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包含多个信号转 导分子。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多个信号转导分子选自受体酪 氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号转导级联组分、核激素受体、核受体辅 激活物、核受体抑制物、和它们的组合。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多个信号转导分子选自 EGFR(ErbBl)、Her_2 (ErbB2)、p95ErbB2、Her_3 (ErbB3)、Her_4 (ErbB4)、Raf、 SRC、Mek、NFkB-IkB> mTor、PI3K、VEGF> VEGFR-I、VEGFR-2、VEGFR-3、 Eph-a、Eph-b、Eph_c、Eph_d、cMet、FGFR > cKit、Flt_3、Tie-1> Tie_2、Flt_3、 cFMS、PDGFRA、PDGFRB> Abl> FTL 3、RET、Kit、HGFR、FGFRU FGFR2、 FGFR3、FGFR4、IGF-1R、ER、PR、NCOR、AIBU 和它们的组合。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多个信号转导分子选自ErbBl、 ErbB2、P95ErbB2、ErbB3、ErbB4、VEGFR-I、VEGFR-2, VEGFR-3, ER、PR、禾口它 们的组合。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自磷酸化状态、遍在 蛋白化状态、复合状态和它们的组合。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相支持物选自玻璃，塑料，芯 片，针，滤膜，珠，纸，膜，纤维束，以及它们的组合。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体束缚于可寻址阵列中的固 体支持物上。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验的步骤(C)包括(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；(ii)将该多个被捕获分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体一起培育，形 成多种可检测的被捕获的析物；(iii)将多个可检测的被捕获分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育，产生 放大的信号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体包含结合对的第一成员。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述结合对第一成员是生物素。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第一成员包含该结合对 的第二成员。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述结合对第二成员是链霉抗生物素蛋白。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第一成员是过氧化物酶。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶 (HRP)。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第二成员是酪酰胺试剂。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺产 生活化的酪酰胺而产生放大信号。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，直接检测活化的酪酰胺。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，通过加入信号检测试剂检测活化的酪酰胺。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的荧光团。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的过氧化物酶与显色试剂的组合。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述显色试剂是3，3'，5，5'-四甲 基联苯胺(TMB)。
41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验的步骤(C)包括(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；( )将多个被捕获分析物与检测抗体一起培育，形成多个可检测的被捕获分析物，所 述检测抗体包括相应分析物的特异性多个活化状态依赖性抗体和多个活化状态非依赖性 抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助分子标记，活化状态依赖性抗体用信号放 大对第一成员标记，所述辅助分子能产生传送给信号放大对第一成员并与之反应的氧化 剂；(iii)将所述多个可检测的被捕获分析物与信号放大对第二成员一起培育，产生放大 的信号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述非活化状态依赖性抗体用辅助分子 直接标记。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体通过偶连于 该活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸与偶连于辅助分子的互补寡核苷酸之间的杂交，被 辅助分子标记。
44.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体用信号放大对第一成员直接标记。
45.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体通过偶联于该 活化状态依赖性抗体的结合对第一成员与偶联于信号放大对第一成员的结合对第二成员 之间的结合，被信号放大对第一成员标记。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述结合对第一成员是生物素。
47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述结合对第二成员是链霉抗生物素蛋白。
48.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述辅助分子是葡萄糖氧化酶。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和活化状态非依赖性 抗体偶联于巯基活化的葡聚糖分子。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述巯基活化的葡聚糖分子的分子量为 500kDa。
51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第一成员是过氧化物酶。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶 (HRP)。
54.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第二成员是酪酰胺试剂。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺产 生活化的酪酰胺而产生放大信号。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，直接检测活化的酪酰胺。
58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，通过加入信号检测试剂检测活化的酪酰胺。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的荧光团。
60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的过氧化物酶与显色试剂的组合。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述显色试剂是3，3'，5，5'-四甲 基联苯胺(TMB)。
62.一种鉴定乳腺肿瘤对抗癌药治疗的反应的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离乳腺肿瘤细胞后将其与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(C)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液的试验来检测细 胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚于固体支持物上； 和(d)比较所述一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药时产生的参比活化状 态，鉴定该乳腺肿瘤是否对该抗癌药有反应。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述乳腺肿瘤获自患有乳腺导管癌或小 叶癌的对象。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述导管癌是浸润性导管癌或原位导管癌。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述小叶癌是浸润性小叶癌或原位小叶癌。
66.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述细胞包括乳腺肿瘤的循环细胞。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离法，分离样品中的循 环细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述样品选自全血、血清、血浆、 导管洗出液、乳头抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
69.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自循环肿瘤细胞、 循环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、播散的肿瘤细胞和它们的组合。
70.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织分离的细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是原发性肿瘤或转移性肿 瘤组织。
72.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织细针抽吸物样品 分离的细胞。
73.如权利要求62所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离的细胞。
74.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自单克隆抗体、酪氨 酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
75.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包含多个信号转 导分子。
76.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自磷酸化状态、遍 在蛋白化状态、复合状态和它们的组合。
77.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自下组玻璃，塑 料，芯片，针，滤膜，珠，纸，膜，纤维束，以及它们的组合。
78.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体束缚于可寻址阵列的固体 支持物上。
79.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述试验的步骤(C)包括(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；(ii)将多个被捕获分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体一起培育，形成多个可检测的被捕获分析物；(iii)将多个可检测的被捕获的分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育，产 生放大的信号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
80.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述试验的步骤(C)包括(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；( )将多个被捕获分析物与检测抗体一起培育，形成多个可检测的被捕获分析物，所 述检测抗体包含相应分析物的特异性多个活化状态依赖性抗体和多个活化状态非依赖性 抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助分子标记，活化状态依赖性抗体用信号放大 对的第一成员标记，所述辅助分子能产生传送给信号放大对第一成员并与之反应的氧化 剂；(iii)将多个可检测的被捕获分析物与信号放大对第二成员一起培育，产生放大的信 号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
81.一种预测乳腺肿瘤对象对癌药治疗反应的方法，所述方法包括(a)给予抗癌药后分离乳腺肿瘤细胞，或者分离乳腺肿瘤细胞后将其与抗癌药一起培育；(b)裂解分离的细胞产生细胞提取物；(c)采用包括一种或多种分析物的特异性捕捉抗体的多个系列稀释液的试验来检测细 胞提取物中该一种或多种分析物的活化状态，其中所述捕捉抗体束缚于固体支持物上； 和(d)比较一种或多种分析物测得的活化状态与缺乏抗癌药时产生的参比活化状态，预 测该对象对该抗癌药治疗反应的可能性。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述乳腺肿瘤来自患乳腺导管癌或小叶 癌的对象。
83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述导管癌是浸润性导管癌或原位导管癌。
84.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述小叶癌是浸润性小叶癌或原位小叶癌。
85.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述细胞包括乳腺肿瘤的循环细胞。
86.如权利要求85所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离法，分离样品中的循 环细胞。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述样品选自全血、血清、血浆、 导管洗出液、乳头抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
88.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述循环细胞选自循环肿瘤细胞、 循环内皮细胞、循环内皮祖细胞、癌症干细胞、播散的肿瘤细胞和它们的组合。
89.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织分离的细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是原发性肿瘤或转移性肿瘤组织。
91.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织细针抽吸物样品 分离的细胞。
92.如权利要求81所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离细胞。
93.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自单克隆抗体、酪氨 酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
94.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包含多个信号转 导分子。
95.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自磷酸化状态、遍 在蛋白化状态、复合状态和它们的组合。
96.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自玻璃，塑料， 芯片，针，滤器，珠，纸，膜，纤维束，以及它们的组合。
97.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述捕捉抗体束缚于可寻址阵列的固体 支持物上。
98.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述试验在步骤(C)中包括(i)将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；(ii)将多个被捕获分析物与相应分析物的特异性活化状态依赖性抗体一起培育，形成 多个可检测的被捕获分析物；(iii)将多个可检测的被捕获分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育，产生 放大的信号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
99.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述试验的步骤(C)包括ω将细胞提取物与捕捉抗体的多个系列稀释液一起培育，形成多个被捕获的分析物；( )将多个被捕获分析物与检测抗体一起培育，形成多个可检测的被捕获分析物，所 述检测抗体包含相应分析物的特异性多个活化状态依赖性抗体和多个活化状态非依赖性 抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助分子标记，活化状态依赖性抗体用信号放 大对第一成员标记，所述辅助分子能产生传送给信号放大对第一成员并与之反应的氧化 剂；( )将所述多个可检测的被捕获分析物与信号放大对的第二成员一起培育，产生放 大的信号；和(iv)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
100.—种具有优秀动态范围的阵列，其包含多个束缚于固体支持物上的系列稀释捕 捉抗体，其中各系列稀释捕捉抗体是细胞提取物中信号转导途径组分的一种或多种相应 分析物的特异性抗体。
101.如权利要求100所述的阵列，其特征在于，所述信号转导途径参与细胞增殖。
102.如权利要求101所述的阵列，其特征在于，所述捕捉抗体包括选自能与 IGF1R、cMET、ErbBl、ErbB2、p95ErbB2、ErbB3、ErbB4、She、PI3K、Erk、Rsk、 Akt、p70S6K、ER、PR、NCOR和AIBl的一个或多个成员反应的抗体。
103.如权利要求100所述的阵列，其特征在于，所述信号转导途径参与肿瘤血管生成。
104.如权利要求103所述的阵列，其特征在于，所述捕捉抗体包括选自能与She、 PI3K、Erk、Rsk、Akt、p70S6K、VEGFR-I、VEGFR-2、Tie 2、V-钙粘蛋白 _R2 复合 物、PDGFRA、和PDGFRB的一个或多个成员反应的抗体。
105.一种检测截短受体存在的方法，所述方法包括以下步骤(a)将细胞提取物与多个全长受体胞外域(ECD)结合区特异性珠一起培育；(b)从细胞提取物中除去多个珠，从而除去全长受体，形成缺乏全长受体的细胞提取物；(C)将不含全长受体的细胞提取物与多个捕捉抗体一起培育，形成多个被捕获的截短 受体，其中所述多个捕捉抗体是所述截短受体胞内域(ICD)结合区的特异性抗体，所述 多个捕捉抗体束缚于固体支持物上；(d)将多个被捕获截短受体与相应截短受体的特异性检测抗体一起培育，形成多个可 检测的被捕获截短受体；(e)将多个可检测的被捕获截短受体与信号放大对的第一和第二成员一起培育，产生 放大的信号；和(f)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
106.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述截短受体是p95ErbB2。
107.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述全长受体是ErbB2(HER-2)。
108.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述多个胞外域(ECD)结合区特异 性珠包含链霉抗生物素蛋白-生物素对，其中所述链霉抗生物素蛋白附着于珠，生物素 附着于抗体。
109.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述抗体是全长受体ECD结合区的 特异性抗体。
110.如权利要求105所述的方法，其特征在于，通过裂解乳腺肿瘤循环细胞产生所述 细胞提取物。
111.如权利要求110所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离法，分离样品中的 循环细胞。
112.如权利要求111所述的方法，其特征在于，所述样品选自全血、血清、血 浆、导管洗出液、乳头抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
113.如权利要求105所述的方法，其特征在于，通过裂解分离自肿瘤组织的细胞产生 所述细胞提取物。
114.如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是原发性肿瘤或转移性 肿瘤组织。
115.如权利要求113所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织细针抽吸物样 品分离的细胞。
116.如权利要求111或113所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离 的细胞。
117.如权利要求116所述的方法，其特征在于，所述分离细胞用生长因子刺激之前与抗癌药一起培育。
118.如权利要求117所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自单克隆抗体、酪 氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
119.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述多个可检测的被捕获截短受体活 化状态是可询问的。
120.如权利要求119所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自磷酸化状态、 遍在蛋白化状态、复合状态和它们的组合。
121.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述检测抗体包含结合对的第一成员O
122.如权利要求121所述的方法，其特征在于，所述结合对第一成员是生物素。
123.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第一成员包含结合对第二成员。
124.如权利要求123所述的方法，其特征在于，所述结合对第二成员是链霉抗生物素蛋白。
125.如权利要求124所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第一成员是过氧化物酶。
126.如权利要求125所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶 (HRP) ο
127.如权利要求125所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第二成员是酪酰胺试剂。
128.如权利要求127所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
129.如权利要求128所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺 产生活化的酪酰胺而产生所述放大信号。
130.如权利要求129所述的方法，其特征在于，直接检测活化的酪酰胺。
131.如权利要求129所述的方法，其特征在于，通过加入信号检测试剂检测活化的酪 酰胺。
132.如权利要求131所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的荧光团。
133.如权利要求131所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的过氧化物酶与显色试剂的组合。
134.如权利要求133所述的方法，其特征在于，所述显色试剂是3，3'，5，5'-四 甲基联苯胺(TMB)。
135.—种检测截短受体存在的方法，所述方法包括(a)将细胞提取物与多个全长受体胞外域(ECD)结合区的特异性珠一起培育；(b)从细胞提取物中除去多个珠，从而除去全长受体，形成缺乏全长受体的细胞提取物；(C)将不含全长受体的细胞提取物与多个捕捉抗体一起培育，其中所述多个捕捉抗 体是截短受体胞内域(ICD)结合区的特异性抗体，所述多个捕捉抗体束缚于固体支持物 上，形成多个被捕获的截短受体；(d)将多个被捕获截短受体与检测抗体一起培育，形成多个可检测的被捕获截短受 体，所述检测抗体包含相应截短受体的特异性多个活化状态依赖性抗体和多个活化状态 非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助分子标记，活化状态依赖性抗体用信号放大 对的第一成员标记，所述辅助分子能产生传送给信号放大对第一成员并与之反应的氧化 剂；(e)将所述多个可检测的被捕获截短受体与信号放大对第二成员一起培育，产生放大 的信号；和(f)检测信号放大对第一和第二成员产生的放大信号。
136.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述截短受体是P95ErbB2。
137.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述全长受体是ErbB2(HER-2)。
138.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述多个胞外域(ECD)结合区特异 性珠包含链霉抗生物素蛋白-生物素对，其中链霉抗生物素蛋白附着于珠，生物素附着 于抗体。
139.如权利要求138所述的方法，其特征在于，所述抗体是全长受体ECD结合区的 特异性抗体。
140.如权利要求135所述的方法，其特征在于，通过裂解乳腺肿瘤循环细胞而产生所 述细胞提取物。
141.如权利要求140所述的方法，其特征在于，通过免疫磁性分离法，分离样品中的 循环细胞。
142.如权利要求141所述的方法，其特征在于，所述样品选自全血、血清、血 浆、导管洗出液、乳头抽吸物、淋巴、骨髓抽吸物、尿液、唾液、细针抽吸物和它们的组合。
143.如权利要求135所述的方法，其特征在于，通过裂解分离自肿瘤组织的细胞产生 所述细胞提取物。
144.如权利要求143所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织是原发性肿瘤或转移性 肿瘤组织。
145.如权利要求143所述的方法，其特征在于，所述细胞是从肿瘤组织细针抽吸物样 品分离的细胞。
146.如权利要求141或143所述的方法，其特征在于，用生长因子体外刺激所述分离 的细胞。
147.如权利要求146所述的方法，其特征在于，所述分离细胞用生长因子刺激之前与抗癌药一起培育。
148.如权利要求147所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗和它们的组合。
149.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体用辅助分 子直接标记。
150.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化状态非依赖性抗体通过偶连 于该活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸与偶连于辅助分子的互补寡核苷酸之间的杂交， 被辅助分子标记。
151.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体用信号放大 对第一成员直接标记。
152.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述活化状态依赖性抗体通过偶联于 该活化状态依赖性抗体的结合对第一成员与偶联于信号放大对第一成员的结合对第二成 员之间的结合，用信号放大对第一成员标记。
153.如权利要求152所述的方法，其特征在于，所述结合对第一成员是生物素。
154.如权利要求152所述的方法，其特征在于，所述结合对第二成员是链霉抗生物素 蛋白。
155.如权利要求135所述的方法，其特征在于，所述辅助分子是葡萄糖氧化酶。
156.如权利要求155所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和活化状态非依赖 性抗体偶联于巯基活化的葡聚糖分子。
157.如权利要求156所述的方法，其特征在于，所述巯基活化的葡聚糖分子的分子量 为 500kDa。
158.如权利要求155所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)。
159.如权利要求158所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第一成员是过氧化物酶。
160.如权利要求159所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶 (HRP) ο
161.如权利要求159所述的方法，其特征在于，所述信号放大对第二成员是酪酰胺试剂。
162.如权利要求161所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
163.如权利要求162所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶氧化生物素_酪酰胺 产生活化的酪酰胺而产生放大信号。
164.如权利要求163所述的方法，其特征在于，直接检测活化的酪酰胺。
165.如权利要求163所述的方法，其特征在于，通过加入信号检测试剂检测活化的酪 酰胺。
166.如权利要求165所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的荧光团。
167.如权利要求165所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉抗生物素蛋 白-标记的过氧化物酶与显色试剂的组合。
168.如权利要求167所述的方法，其特征在于，所述显色试剂是3，3'，5，5'-四 甲基联苯胺(TMB)。
全文摘要
本发明提供检测肿瘤细胞中信号转导途径诸组分活化状态的组合物和方法。利用本发明获得的信号转导途径诸组分活化状态的信息可进行癌症的诊断、预后和设计癌症治疗方法。
文档编号G01N33/50GK102016581SQ200980114742
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月24日 优先权日2008年2月25日
发明者B·内里, J·哈维, L·刘, P·金, R·巴罕姆, S·辛格, X·刘 申请人:普罗米修斯实验室股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
