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专利名称：一种快速检测索拉非尼化疗药物相关基因表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼化疗药物相关基因KDR、PDGFRAmRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界毎年新诊断的肝癌患者约60多万例，其中近50%发生在中国，而肝癌的发病率仍在不断上升。目前肝细胞癌因其较强的侵袭性和缺乏系统有效地治疗方案，使其成为ー种致命性疾病。就我国目前的肝癌发病现状来说，不仅患者的诊断率非常低，而且病程晩期的患者生存率也很低，几乎不足10%。手术切除和肝移植仍然是一小部分早期病人的唯一治愈方法，而既往进行的有关晩期HCC全身化疗、抗雄激素治疗、干扰素治疗等II、III期临床研究均未得到令人满意的結果。因而，对于晩期肝癌难以寻找到ー种能够彻底治愈的治疗手段，但是近年来，肿瘤的分子靶向治疗逐渐成为肝癌治疗的新方向和新选择，给已失去治疗机会的患者带来了新的希望。血管生成广泛存在于肿瘤的发生与发展。血管生成过程间接通过血管内皮细胞分泌的基质降解蛋白酶，从而进ー步促进了肿瘤的侵袭与转移。促血管生成相关因子可以通过促进血管生成进而刺激肿瘤的形成、生长和増殖，故而成为了治疗HCC靶标的优先选择。目前已知的血管生长相关分子和信号途径主要包括血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)-2，血小板衍生的生长因子(TOGF)，血管生成素-2(Ang-2);其他调节因子，如c-RET和mTOR通过影响下游信号通路亦间接影响血管生成。肝癌是ー种高度血管化的肿瘤，这表明其对血管抑制剂作用敏感性极强。一些内源性促血管生成因子在肝癌组织中均有表达，大量研究表明他们在肝癌的发病机制中发挥重要作用。如局部治疗后肿瘤组织VEGF mRNA表达水平升高与病人药物疗效不好、预后差关系密切；同时在某些肝癌中，FGF-2在组织中的mRNA表达水平增高与肿瘤微血管密度及术后复发率相关性较大；而血管生成素基因mRNA表达水平与肿瘤门静脉直径，浸润程度，微血管密度及预后差呈现明显的正相关。Raf激酶是MEK/ERK级联通路中的关键调节酶，在HCC中它通过激活Raf/MEK/ERK通路上调信号传导而发挥其促肝癌细胞増殖的作用。索拉非尼(sorafenib)是ー种同时针对肿瘤细胞与肿瘤血管系统的ロ服多激酶抑制剂，它具有双重抗肿瘤作用，一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长；另一方面通过抑制VEGF和TOGF而阻断肿瘤新生血管的形成，从而发挥其双重抑制、多靶点阻断的抗HCC作用。综上所述，以血管相关分子作为靶标的多激酶抑制剂-索拉非尼必然可为肝癌的有效治疗提供新的策略。大量的临床研究显示索拉非尼药物的疗效与肿瘤组织中KDR(VEGFR2)和I3DGFRA基因的mRNA表达水平密切相关，KDR和I3DGFRAmRNA 基因高表达的患者对该药物敏感，反之表达水平低的患者表现耐药(Yamamoto H，Oda Y，Kawaguchi K，et al.し-kit and PDGFRA mutations in extragastrointestinal stroma丄tumor(gastrointestinal stromal tumor of the soft tissue). Am J Surg Pathol 2004 ；28:479-88)。因此，KDR、H)GFRA mRNA基因表达水平的检测适应了肝癌个体化治疗的需求，对肝癌靶向药物选择具有重要指导意义。目前尚无文献报告有关检测KDR和PDGFRAmRNA表达量的试剂盒
发明内容
本发明的目的在于提供ー种能快速、简便、敏感、特异的检测索拉非尼化疗药物相关基因KDR、PDGFRA mRNA表达量的试剂盒。本发明提供了ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDR、PDGFRmRNA表达量的试剂盒，包含KDR、I3DGFR基因引物和Taqman荧光探针，以及内參基因GAPDH引物和Taqman荧光探针；KDR 基因上游引物序列为5’ -CTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAA-3’ (如 SEQ ID NO 1所示)；KDR 基因下游引物序列为5’-AAATGGGATTGGTAAGGATGACA-3’ (如 SEQ ID NO 2 所示)；KDR 基因 Taqman 荧光探针FAM 5’ -AGACACAGGAAATTAC-3’ TAMRA (如 FAM-SEQ IDNO 3-TAMRA 所示);PDGFRA 基因上游引物序列为5’ -CCTCATGGACGACCACCAA-3’ (如 SEQ ID NO 4 所示)；PDGFRA 基因下游引物序列为5’-TCAGCCAAGCACCTCACTGT-3’ (如 SEQ ID NO 5 所示)；PDGFRA 基因 Taqman 荧光探针6FAM 5，-CTCTGCTGGCAGGCA-3，TAMRA (如 6FAM-SEQID NO 6-TAMRA 所示);GAPDH 基因上游引物序列为5 ’ -CAAGGCTGTGGGCAAGGT-3 ’(如 SEQ ID NO : 7 所示)；GAPDH 基因下游引物序列为5 ’ -GGCCATGCCAGTGAGCTT-3 ’(如 SEQ ID NO : 8 所示)；GAPDH 基因 Taqman 荧光探针6FAM 5，-ATCCCTGAGCTGAACG-3，TAMRA (如 6FAM-SEQID NO 9-TAMRA 所示)所述的试剂盒还包括进行突光定量PCR所需的试剂,具体包括第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液、RNA提取试剂。其中的第一链cDNA合成试剂为25mmol/L MgCl2 4 yl，IOX逆转录酶缓冲液2u 1,10mmol/L dNTP 2u I, RNA 酶抑制剂 0. 5u I, Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV 逆转录酶 15U,无RNase去离子水。其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有KDR、PDGFRA总RNA样品为阳性对照。其中的PCR反应液包括10XPCR反应混合液、0. 25pmol/u I的引物、0. 3pmol/u I的荧光探针、2. 5 4. OmM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4mM 的 dNTPs、0. 2 IU 的 UNG酶、0. 3 0. 6mM dUTP。通常取I 2 的模板。用本发明的试剂盒检测KDR、PDGFRA基因mRNA表达量首先获取临床肿瘤组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成第一链cDNA ;然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值結果。分别计算KDRJDGFRA及GAPDH基因的CT值，两者之差即为ACt值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。本发明试剂盒的优点和有益效果如下
(I)敏感荧光PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一歩完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。(4)快速速度快、高通量，可在3 4小时完成。


图IA为荧光实时定量RT-PCR检测KDR标准品的荧光曲线图。图IB为根据KDR标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。图2A为荧光实时定量RT-PCR检测PDGFRA标准品的荧光曲线图。 图2B为根据I3DGFRA标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。图3A为荧光实时定量RT-PCR检测GAPDH标准品的荧光曲线图。图3B为根据GAPDH标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。
具体实施例方式现结合实施例和附图对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例I :本发明试剂盒的制备(I)本发明试剂盒组成如下①Trizol :快速提取癌组织RNA ；②第一链cDNA合成试剂盒(RT-PCR);包括25mmol/L MgCl24u I, IOX逆转录酶缓冲液l,10mmol/L dNTP 2u I, RNA 酶抑制剂 0. 5 y 1，Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV 逆转录酶15U,无RNase去离子水；③引物包括目的基因KDR、H)GFRA和内參基因GAPDH及荧光探针，具体如下KDR基因引物序列KDR 基因上游引物序列为5’ -CTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAA-3’ ；KDR 基因下游引物序列为5’ -AAATGGGATTGGTAAGGATGACA-3’ ；KDR 基因 Taqman 荧光探针FAM 5’ -AGACACAGGAAATTAC-3’ TAMRA ；I3DGFRA基因引物序列PDGFRA 基因上游引物序列为5’ -CCTCATGGACGACCACCAA-3’ ；PDGFRA 基因下游引物序列为5’ -TCAGCCAAGCACCTCACTGT-3’ ；PDGFRA 基因 Taqman 荧光探针6FAM 5’ -CTCTGCTGGCAGGCA-3’ TAMRA ；
GAPDH基因引 物序列GAPDH 基因上游引物序列为5’ -CAAGGCTGTGGGCAAGGT-3’ ；GAPDH 基因下游引物序列为5’ -GGCCATGCCAGTGAGCTT-3’ ；GAPDH 基因 Taqman 荧光探针6FAM 5’ -ATCCCTGAGCTGAACG-3’ TAMRA上述引物序列、探针序列由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有KDR和TOGFRA总RNA样品为阳性对照。⑤PCR反应液10XPCR反应混合液、0. 25pmol/u I的引物、0. 3pmol/u I的探针、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、2U 的 Taq 酶、0. 2 0. 4mM 的 dNTPs、0. 2 IU 的 UNG 酶、0. 3 0. 6mMdUTP、通常取I 2ul的模板、反应总体积通常为20 Ul (以上所有的浓度都是指终浓度)PCR扩增程序的设定在lightcycler2. 0仪器上通常是先50°C 10s，95°C IOmin,然后95°C 15秒60°C Imin，循环45次。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测KDR、PDGFRA mRNA的表达量以检测30例肝癌石蜡切片标本组织结果为例。检测流程首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。获取临床肝癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA ;配置PCR反应液进行荧光定量PCR。在LightCycler数据分析系统中读出CT值結果。分别计算TUBB3及GAPDH基因的CT值，两者之差即为A Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提癌和癌旁组织总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0. 1% DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取I上述RNA液在70°C保温IOmin随后加入25mmol/L MgCl2 4iU，10X 逆转录酶缓冲液 2iil，10mmol/L dNTP 2 yl，RNA 酶抑制剂 0. 5 yl，01igo(dT)150. 5u g, AMV逆转录酶I. 5U，补加DEPC处理水至总体积20iU，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA第一链。③反应结束后，加热至99°C 5min以灭活逆转录酶。加20 y I无菌水混匀置冰箱-20°C保存。④荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 ill :含2X PCR反应混合液10. 0 yl，TUBB3引物浓度0. 2 ii mol/L,探针浓度0. 3 y mol/L, cDNAl. 0 yl，超纯水补齐。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件95°C IOmin预变性，95°C 15s, 60°C Imin扩增45个循环，仪器自动收集荧光信号。⑤数据收集处理和分析将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出目的基因相对于管家基因(GAPDH)的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于I. 50为高表达，比值小于0. 50为低表达表I :肝癌组织中KDR基因和TOGFRA基因mRNA表达水平检测
权利要求
1.ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDRJDGFR mRNA表达量的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括KDRJDGFR基因弓I物和Taqman荧光探针，以及内參基因GAPDH引物和Taqman荧光探针； KDR基因上游引物序列如SEQ ID NO 1所示； KDR基因下游引物序列如SEQ ID NO 2所示； KDR 基因 Taqman 荧光探针如 FAM-SEQ ID NO :3_TAMRA 所示； PDGFRA基因上游引物序列如SEQ ID NO 4所示； PDGFRA基因下游引物序列如SEQ ID NO 5所示； PDGFRA 基因 Taqman 荧光探针如 6FAM-SEQ ID NO 6-TAMRA 所示； GAPDH基因上游引物序列如SEQ ID NO 7所示； GAPDH基因下游引物序列如SEQ ID NO 8所示； GAPDH 基因 Taqman 荧光探针如 6FAM-SEQ ID NO 9-TAMRA 所示。
2.根据权利要求I所述的ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDR、PDGFR mRNA表达量的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和RNA提取试剂。
3.根据权利要求2所述的ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDR、PDGFR mRNA表达量的试剂盒，其特征在于其中的第一链cDNA合成试剂为25mmol/L MgCl24u 1,10X 逆转录酶缓冲液 2iil，10mmol/L dNTP 2 yl，RNA 酶抑制剂 0. 5 yl，Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV逆转录酶15U,无RNase去离子水。
4.根据权利要求2或3所述的ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDR、PDGFR mRNA表达量的试剂盒，其特征在于其中的阴性对照是去离子水，阳性对照是含有KDR、PDGFRA总RNA的样品。
5.根据权利要求2或3所述的ー种利用荧光定量PCR技术检测索拉非尼相关基因KDR、PDGFR mRNA表达量的试剂盒，其特征在于其中的PCR反应液包括=IOXPCR反应混合液、0. 25pmol/u I 的引物、0. 3pmol/u I 的荧光探针、2. 5 4. OmM 的 MgCl2、2U 的 Taq 酶、0. 2 0.4mM 的 dNTPs、0. 2 IU 的 UNG 酶、0. 3 0. 6mM dUTP。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，在多种肿瘤组织中可见KDR和PDGFRA高表达，而索拉非尼通过抑制KDR和PDGFR等活性，一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长；另一方面通过抑制VEGF和PDGF而阻断肿瘤新生血管的形成，从而发挥其双重抑制、多靶点阻断的抗HCC作用。检测KDR、PDGFR mRNA水平能帮助医生预测使用这类药物的疗效和患者临床结局，具有重要的临床意义。本发明目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测索拉非尼化疗药物相关基因KDR和PDGFRA表达量的试剂盒。本发明的试剂盒采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR技术检测KDR、PDGFR mRNA水平，特异性和敏感度均显著提高，速度快、高通量，可在3～4小时完成。
文档编号G01N21/64GK102618656SQ20121011355
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘辉, 吴孟超, 周伟平, 汪珍光, 顾方明 申请人:中国人民解放军第二军医大学