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专利名称：用于诊断胃病或胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断的试剂盒，尤其涉及一种通过测定受试者胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II的浓度并与设定的cut-off值比较来诊断胃病或早期胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法及应用，属于胃病或胃癌的诊断或检测领域。
背景技术：
胃蛋白酶原(PG)是一种门冬氨酸蛋白酶前体，是分子质量为42kDa的单链多肽，包括3个二巯键，等电点为3. 7。人类PG依其电泳迁移率可以分为7个组分，较快移向阳性的1-5组分的免疫原性近似，称为胃蛋白酶原I (PG I)，主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6-7被称为胃蛋白酶原II (PG II)，除由胃体和胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PG II。胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的基因位点、免疫反应性及生化特性上均存在一定差异。不同种的PG的产生似乎与以下几种因素相关结构基因的数量、个体等位基因的差异以及翻译后的修饰。胃蛋白酶原无活性，在胃内盐酸作用下，或在酸性条件下，通过自身催化，从N端水解42个氨基酸残基后而转变为有活性的胃蛋白酶。胃蛋白酶为内切酶，可分解大部分蛋白质为标和胨，产生的多肽或氨基酸较少。在PG转变成胃蛋白酶的过程中，分子量由42kDa降为35kDa，等电点由3. 7降为-I，主细胞中的PG贮存在细胞顶部的分泌颗粒中，当细胞受到刺激时，通过胞吐作用大部分释入腺腔，只有1%进入血液循环。在正常人血清中的PG I浓度是PGII的6倍。由于胃几乎是PG的唯一来源，并且在分泌阶段的分泌量会发生变化，因此，血清PG I和PGII不仅反映了胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。胃酸分泌过多的浅表性胃炎和H pylori感染的胃炎，PG I和PG II的分泌会增加；而在慢性严重萎缩性胃炎，当主细胞减少时PG I含量下降；当萎缩性胃炎伴有肠化、胃窦腺假幽门腺化生，PG II含量会随之增高。当肠上皮化生(intestinal metaplasia, IM)、不典型增生时，PG I分泌会减少，PG I/PG II也会发生变化，因此，血清PG可作为监测胃粘膜变化的一个可靠的标志物。高浓度的PG I还作为十二指肠溃疡及其并发症的危险性的一个亚临床指征，也可以作为观察H pylori感染根除治疗疗效的一个指标。胃粘膜萎缩和肠上皮化生(特别是不完全型结肠化生)及异型增生是胃癌的癌前病变，对CAG患者尤其是伴有肠化和异型增生者进行病情监测，对于早期胃癌的发现意义重大。日本和中国胃癌患者的总数几乎占到全球胃癌患者总数的一半。胃癌的筛查工作始于60年代胃癌高发的日本，当时采用胃肠双重对比造影-胃镜-病理检查阶梯式的筛查方法，人力物力花费较大。自1991年开始，日本先后以血清PGI < 50ng/ml并PGI/GPII比值
<3.0和PGI < 70ng/ml并PGI/PGII比值< 3. 0作为胃癌筛查的初筛指标，历经5年共检测血清样本25415例，检出胃癌43例(0. 17% )，其中早癌32例(74%)。另以血清GPI、<70ng/ml并GPI/GPII比值< 3. O为胃癌筛检的Cut-off值，其灵敏度84. 6 %，特异度73. 5%，阳性预测值0. 81%，阴性预测值99. 9%。继后十年中已有13万余人接受了血清PG法胃癌筛查，检出胃癌患者123人，检出率0. 13%。中国专家组于1997-1999年在中国胃癌高发区采用两轮筛选法进行胃癌筛查，以胃镜病理组织学诊断为标准比较评价了两种初筛方法钡剂-X线双对比照影和血清胃蛋白酶原I/II含量检测。结果显示，在接受血清胃蛋白酶原I/II(PGI/PGII)检测的1750人中，分别以 PGI ( 50+PGI/PGII 彡 3 和 PGI ( 70+PGI/GPII 比值彡 3 为初筛 Cut-off 值，后者筛出应胃镜精查者近400人，符合胃癌诊断者17例，检测敏感度约为53%。特异度达到78%，第二轮胃镜精查在这组人群中检出胃癌32例。据此，血清胃蛋白酶原I/II(PGI/PGII)含量检测优于双对比照影，血清PGI含量和PGI/GPII值相结合更适合于作为中国人胃癌初筛和胃部重大疾病普查标准。

发明内容
本发明的主要目的是提供一种敏感度高、特异性强和准确性好的诊断胃病或胃癌，特别是早期胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒；本发明的另一个目的是提供一种制备上述胶乳增强免疫比浊试剂盒的方法；本发明的再一个目的是提供所述试剂盒在诊断胃病或胃癌中的应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明的一种用于诊断胃病或胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于包括稀释液、含有胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的胶乳试剂及空白液；其中所述的胶乳试剂中含有已耦联了胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的不同粒径的聚苯乙烯纳米微球。在本发明中，优选的，所述的稀释液为含有反应增强剂的缓冲液，所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任一种，更优选为磷酸盐缓冲液；所述的反应增强剂为PEG-300、PEG2000或PEG6000中的任一种或几种，优选为PEG6000 ;最优选的所述的稀释液中还含有2mol/L的氯化钠。在本发明中，优选的，所述的胶乳试剂中含有已耦联了胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的粒径为60-90nm和粒径为160_200nm的聚苯乙烯纳米微球。所述的胶乳试剂可以按照以下方法制备得到(I)胶乳前处理取Iml未标记的聚苯乙烯纳米微球加入IOml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液中，离心机IOOOOrpm离心20min,去掉上清液、再用IOml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机IOOOOrpm离心20min，去掉上清并用5ml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液重悬、4°C保存待用；(2)胶乳颗粒标记将步骤⑴处理后胶乳用0. 02M pH6. IMES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml浓度，然后加入Img EDC,混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用0. 02MPH7. 4磷酸缓冲液重悬，加入Img胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的抗体于10mg/ml2ml胶乳液体，室温混匀2-4小时，离心机SOOOrpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，颗粒使用封闭液重悬，并室温混匀I小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于分散液，将标记完成的胶乳颗粒分装成Iml/支，4°C保存；(3)使用上述步骤分别对粒径60-90nm和160_200nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述60-90nm胶乳和所述160_200nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，使60-90nm 胶乳的浓度为 0. 673-0. 720% (w/v)，使 160_200nm 胶乳的浓度为 0. 147-0. 323%(w/v)，混合后进行保存，优选的使用上述流程分别对粒径60-80nm和160_180nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述60-80nm胶乳和所述160_180nm胶乳进行混合，按质量体积百分比计，使60-80nm胶乳浓度为0. 673-0. 708% (w/v)，使160_180nm胶乳浓度为0. 147-0. 235% (w/v)，混合后进行保存；所述的封闭液为含有5g/L BSA的0. 02M PH7. 4的磷酸缓冲液；所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0. 02M PH7. 4的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为lg/L，吐温-20浓度为0. 05% (v/v)，PVP-K30浓度为2g/L，生物防腐剂浓度为0.05% (v/v)，在本发明的一个具体实施例中所述的生物防腐剂为PC-300,购自sigma公司。为了达到更好的检测效果，所述的胃蛋白原I或蛋白酶原II是从人胃粘膜组织中提取的天然蛋白；其提取方法可以是离子交换及凝胶过滤层析法等方法。作为参考，一种从人胃粘膜组织中提取胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的方法，包括(I)收集外科手术切除的胃组织，用磷酸盐缓冲液漂洗，分离胃粘膜，吸干，称重，加入磷酸盐缓冲液，捣碎匀浆，离心，收集上清，沉淀磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)将胃蛋白酶原粗提液加入已经平衡的DEAE-52层析柱中，用PBS缓冲液洗脱层析柱至洗脱液在280nm处的吸光值为0，继续用PBS缓冲液洗脱层析柱，合并洗脱峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰,上样于凝胶层析柱中，用50mmol含0. 05mol/LNa2S04的PBS洗脱，流速3. Oml/min，压力为8Kpa，洗脱曲线为显示4个蛋白洗脱峰，第三个蛋白峰即为胃蛋白酶原I，第四个蛋白峰为胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；(4)采用Q-2阴离子交换层析柱分离胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝胶层析后的第四个洗脱峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透折后上样阴离子层析柱，用浓度为0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脱，流速为lmL/min ;出现三个蛋白峰，其中第I个，2个峰为胃蛋白酶原I，第三峰为胃蛋白酶原II。经过上述方法纯化获得的胃蛋白酶原I的纯度> 98%，比活性为13. 6U/mg ;胃蛋白酶原II的纯度彡96. 8%，比活性为19. 7U/mg。将所制备的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II免疫小鼠制备融合细胞就可进一步得到分泌抗胃蛋白酶抗原I或胃蛋白酶抗原II的单克隆抗体，优选的，所述的单克隆抗体为针对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II表面的不同抗原决定簇的单克隆抗体的混合物。
作为参考，所述胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II单克隆抗体的制备方法，包括(I)融合细胞的制备用50-100 ii g人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II与福氏完全佐剂等体积混合皮下注射免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠，间隔2-3周后，用同样剂量的抗原加强免疫2-3次，末次免疫后后3-4天取尾静脉血检测，当效价达到4000以上时，即准备融合；将经免疫的小鼠处死后，局部消毒剖腹，无菌条件下取脾，制备成脾细胞悬液；融合前2-3天，将每瓶Sp2/0骨髓瘤细胞传至4瓶细胞，取处于对数生长期的细胞用于融合；将脾细胞和SP2/0细胞分别计数后，按7 I的比例加入50ml离心管中混合均匀，离心10分钟，倒尽上清液，使两种细胞混匀成糊状，加入37°C预温的50% PEG 4000，边滴加边搅拌完成细胞融合。(2)融合后的细胞用含20%小牛血清的HAT培养液制备成细胞悬液，分划于192孔细胞培养板中进行选择培养；在选择培养液中培养4天后，其它细胞逐渐消失，只有融合的杂交瘤成簇生长，形成小的细胞集落，8天后，停止使用HAT培养液，改用HT培养液，一周后换用含10%牛血清的DMEM培养液培养；待杂交瘤细胞长满培养孔底部的1/3时，这时吸取培养上清进行筛选。用间接酶联吸附法(ELISA)进行特异性抗体检测，有分泌抗ALB抗原抗体的杂交瘤细胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II为包被抗原，用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛�。�以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的培养上清为阴性对照；选取对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原阳性反应的杂交瘤细胞集落，以有限稀释法进行克隆化培养，选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续按有限稀释法进行2次克隆和扩大培养，得到分泌特异抗体的杂交瘤细胞株；(4)在同系的6周龄BALB/c腹腔注射液体石蜡，约第8天将克隆后分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞注入腹腔(1-2 X IO6细胞/鼠)，待小鼠腹部开始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，杀死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，无菌过滤后，小包装分装后于-20°C冻存，亦可取部分进一步进行纯化；(5)离心除去腹水中的细胞和细胞碎片，加入等体积的饱和硫酸铵到上清液中，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时，使蛋白质充分沉淀，将沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS(pH7. 4)在4°C透析24小时。然后通过DEAE-S印hadexA52层析柱，收集并合并洗脱液中含蛋白的部分，即得到纯化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II单克隆抗体。在本发明的具体实施例中，胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II单克隆抗体除了可通过杂交瘤细胞的方式产生外，还可直接通过商业途径购买得到，在本发明另一个具体实施例中所述的胃蛋白酶原I的单克隆抗体为针对胃蛋白酶原I表面的不同抗原决定簇的单克隆抗体PGI-8003和PGI-8015(Medix，批号为0021636)的混合物，胃蛋白酶原II的单克隆抗体为针对胃蛋白酶原II表面的不同抗原决定簇的单克隆抗体PGII-8103和PGII-8101(Medix，批号为0023880)的混合物。胃蛋白酶原I单克隆抗体及胃蛋白酶原II单克隆抗体还可购买自Applichem公司或Abcam公司，胃蛋白酶原I抗体批号分别为M5537及A1476 ;胃蛋白酶原II抗体批号分别为M5538及A1483，同样可实现本发明的目的。本发明的试剂盒中还可含有标准稀释液、校准品和质控品。优选的，所述的标准稀释液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘 氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任一种，优选为磷酸盐缓冲液。优选的，所述校准品和质控品中含有从人胃粘膜分离的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。以上任一项所述的试剂盒在制备诊断胃病或胃癌。特别是早期胃癌试剂中的应用。本发明采用了从人胃粘膜分离的胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II作为免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原，所用到标准品也是采用从人胃粘膜分离的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II，弥补了采用动物胃蛋白酶原与人的胃蛋白酶原结构不同带来的缺陷，提高了产品诊断的敏感度、特异性和准确性。本试剂盒采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。样品中的PG I或PGII与标记了抗PG I抗体或抗PGII抗体的乳胶颗粒发生特异性的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸光度的变化。此吸光度的变化与样品中的PG I或PGII浓度呈正比。用已知浓度的PG I或PGII标准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的PG I或PGII含量。
本发明通过测定分析物的胃蛋白酶原I (PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)来评估受试者胃粘膜状况，特别适用于诊断粘膜胃变化，例如萎缩性胃炎，并可诊断早期胃癌，所述方法包括从所述受试者的样品中测量胃蛋白酶原I和胃蛋白酶II的浓度值；将分析物浓度测量值与该分析物的预定临界值进行比较，得到受试者特定的比较结果的组合。分析物测量值是否大于、等于或小于各自的临界值，及两个分析物的比值来评估受试者胃粘膜状况，进而得出受试者患胃癌的风险产生的该信息是关于由所得的比较结果作出诊断意见或对治疗或进一步观察和/或检测提出建议，并提示受试者患早期胃癌的风险。


图I为采用PG I标准品浓度做出的标准曲线；图2为使用本发明的试剂盒进行检测的流程示意图。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源Q-2阴离子交换层析柱、DEAE-Sephadex A52 (DEAE-52)层析柱购买自美国GE公司；8周龄的雌性BALB/C小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司；弗氏完全佐剂，生物防腐剂PC-300、2_(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)购买自SIGMA ；10% (w/w)聚苯乙烯纳米微球溶液购买自美国Bangs ;胃蛋白酶原I抗体PGI-8003和PGI-8015购买自Medix批号0021636，胃蛋白酶原II抗体PGII-8103和PGII-8101购买自Medix批号0023880PVP-K30 (PoIyvinylpyrroI idone)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾PFG-6000、EDC (I- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐、吐温_20等购自国药集团；牛血清白蛋白(BSA)购自元亨金马。实施例I胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原11的提取纯化(I)收集外科手术切除的胃组织，用磷酸盐缓冲液漂洗，分离胃粘膜，吸干，称重，加入磷酸盐缓冲液，捣碎匀浆，离心，收集上清，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)将胃蛋白酶原粗提液加入已经平衡的DEAE-52层析柱中，用PBS缓冲液洗脱层析柱至在280nm处，吸光值为0，继续用PBS缓冲液洗脱层析柱，合并洗脱峰，得到含有活性 的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰,上样于凝胶层析柱中，用50mmol含0. 05mol/LNa2S04的PBS洗脱，流速3. Oml/min，压力为8Kpa，洗脱曲线为显示4个蛋白洗脱峰，第三个蛋白峰即为胃蛋白酶原I，第四个蛋白峰为胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；(4)采用Q-2阴离子交换层析柱分离胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝胶层析后的第四个洗脱峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透析后上样阴离子层析柱，用浓度为0. 4mol/L NaCL梯度洗脱，流速为lmL/min ;出现三个蛋白峰，其中第I个，2个峰为胃蛋白酶原I，第三峰为胃蛋白酶原II。经过上述方法纯化获得的胃蛋白酶原I的纯度> 98%，比活性为13. 6U/mg ;胃蛋白酶原II的纯度彡96. 8%，比活性为19. 7U/mg。实施例2抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II单克隆抗体的制备(I)融合细胞的制备用实施例I制备得到的50-100 ii g人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II与弗氏完全佐剂等体积混合皮下注射免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠，间隔2-3周后，用同样剂量的抗原加强免疫2-3次，末次免疫后后3-4天取尾静脉血检测，当效价达到4000以上时，即准备融合；将经免疫的小鼠处死后，局部消毒剖腹，无菌条件下取脾，制备成脾细胞悬液；融合前2-3天，将每瓶Sp2/0骨髓瘤细胞传至4瓶细胞，取处于对数生长期的细胞用于融合；将脾细胞和SP2/0细胞分别计数后，按7 I的比例加入50ml离心管中混合均匀，离心10分钟，倒尽上清液，使两种细胞混匀成糊状，加入37°C预温的50% PEG4000，边滴加边搅拌完成细胞融合。(2)融合后的细胞用含20%小牛血清的HAT培养液制备成细胞悬液，分划于192孔细胞培养板中进行选择培养；在选择培养液中培养4天后，其它细胞逐渐消失，只有融合的杂交瘤成簇生长，形成小的细胞集落，8天后，停止使用HAT培养液，改用HT培养液，一周后换用含10%牛血清的DMEM培养液培养；待杂交瘤细胞长满培养孔底部的1/3时，这时吸取培养上清进行筛选。用间接酶联吸附法(ELISA)进行特异性抗体检测，有分泌抗ALB抗原抗体的杂交瘤细胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II为包被抗原，用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的培养上清为阴性对照；选取对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原阳性反应的杂交瘤细胞集落，以有限稀释法进行克隆化培养，选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续按有限稀释法进行2次克隆和扩大培养，得到分泌特异抗体的杂交瘤细胞株；
(4)在同系的6周龄BALB/c腹腔注射液体石蜡，约第8天将克隆后分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞注入腹腔(1-2 X IO6细胞/鼠)，待小鼠腹部开始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次后，杀死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，无菌过滤后，小包装分装后于-20°C冻存，亦可取部分进一步进行纯化；(5)离心除去腹水中的细胞和细胞碎片，加入等体积的饱和硫酸铵到上清液中，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时，使蛋白质充分沉淀，将沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS(pH7. 4)在4°C透析24小时。然后通过DEAE-S印hadexA52层析柱，收集并合并洗脱液中含蛋白的部分，即得到纯化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II单克隆抗体。实施例3试剂盒的组装(以PG II为例)I缓冲液配置I. I稀释液(Rl)的配制将下表中试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水混匀，测定pH值为7. 4，定容IOOOml。
权利要求
1.一种用于诊断胃病或胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于包括稀释液、含有胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的胶乳试剂及空白液； 其中所述的胶乳试剂中含有已耦联了胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的不同粒径的聚苯乙烯纳米微球。
2.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的稀释液为含有反应增强剂的缓冲液，所述的缓冲液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HE PES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任一种，优选为磷酸盐缓冲液；所述的反应增强剂为PEG-300、PEG2000或PEG6000中的任一种或几种，优选为PEG6000 ;更优选的所述的稀释液中还含有2mol/L的氯化钠。
3.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的胶乳试剂中含有已耦联了胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的粒径为60-90nm和粒径为160_200nm的聚苯乙烯纳米微球。
4.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的胶乳试剂按照以下方法制备得到 (1)胶乳前处理 取Iml未标记的聚苯乙烯纳米微球加入IOml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液中，离心机IOOOOrpm离心20min,去掉上清液、再用IOml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液重悬颗粒，离心机IOOOOrpm离心20min，去掉上清并用5ml 0. 02M pH7. 4磷酸缓冲液重悬、4°C保存待用； (2)胶乳颗粒标记 将步骤(I)处理后胶乳用0. 02M pH6. IMES缓冲液将胶乳颗粒稀释成10mg/ml浓度，然后加入Img EDC,混匀活化15分钟，离心8000rpm弃去上清，并用0. 02MPH7. 4磷酸缓冲液重悬，加入Img胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的抗体于10mg/ml2ml胶乳液体中，室温混匀2-4小时，离心机8000rpm离心15分钟，将上清分离到另外的容器中备用，颗粒使用封闭液重悬，并室温混匀I小时，离心机8000rpm离心15min，沉淀复溶于分散液，将标记完成的胶乳颗粒分装成Iml/支，4°C保存； (3)使用上述步骤分别对粒径60-90nm和160_200nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述60-90nm胶乳和所述160-200nm胶乳进行混合,按质量体积百分比计，使60_90nm胶乳的浓度为0. 673-0. 720%，使160-200nm胶乳的浓度为0. 147-0. 323%，混合后进行保存，优选的使用上述流程分别对粒径60-80nm和160_180nm的胶乳进行分别标记，标记结束后将所述60-80nm胶乳和所述160_180nm胶乳进行混合,按质量体积百分比计，使60_80nm胶乳浓度为0. 673-0. 708%，使160-180nm胶乳浓度为0. 147-0. 235%，混合后进行保存； 所述的封闭液为含有5g/L BSA的0. 02M PH7. 4的磷酸缓冲液； 所述的分散液由BSA，吐温-20、PVP-K30以及生物防腐剂通过0. 02M PH7. 4的磷酸缓冲液配制而成，其中BSA浓度为lg/L，吐温-20浓度为0. 05% (v/v)，PVP-K30浓度为2g/L,生物防腐剂浓度为0. 05% (v/v)。
5.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是从人胃粘膜组织中提取得到的天然蛋白，优选的，所述的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II是按照以下方法从人胃粘膜组织中提取得到 (I)收集外科手术切除的胃组织，用磷酸盐缓冲液漂洗，分离胃粘膜，吸干，称重，加入磷酸盐缓冲液，捣碎匀浆，离心，收集上清，沉淀磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，合并上清液，得到胃蛋白酶原粗提液； (2)将胃蛋白酶原粗提液加入已经平衡的DEAE-52层析柱中，用PBS缓冲液洗脱层析柱至洗脱液在280nm处的吸光值为O，继续用PBS缓冲液洗脱层析柱，合并洗脱峰，得到含有活性的胃蛋白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰，上样于凝胶层析柱中，用50mmol含0.05mol/LNa2S04的PBS洗脱，流速3. Oml/min，压力为8Kpa，洗脱曲线为显示4个蛋白洗脱峰，第三个蛋白峰即为胃蛋白酶原I，第四个蛋白峰为胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II 的混合物； (4)采用Q-2阴离子交换层析柱分离胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝胶层析后的第四个洗脱峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透折后上样阴离子层析柱，用浓度为0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脱，流速为lmL/min ;出现三个蛋白峰，其中第I个，2个峰为胃蛋白酶原I，第三峰为胃蛋白酶原II。
6.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体为单克隆抗体，优选的，所述的单克隆抗体为针对胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II表面的不同抗原决定簇的单克隆抗体的混合物。
7.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于还含有标准稀释液、校准品和质控品。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的标准稀释液为Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液或HEPPS缓冲液中的任一种，优选为磷酸盐缓冲液。
9.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述校准品和质控品中含有从人胃粘膜分离的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备诊断胃病或胃癌试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种诊断胃病或胃癌的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒的组成包括稀释液、抗胃蛋白酶原I的抗体或抗胃蛋白酶原II的抗体的胶乳试剂和空白液，还可包括校准品和质控品。其中所述的胶乳试剂中含有已耦联了胃蛋白酶原I的抗体或胃蛋白酶原II的抗体的不同粒径的聚苯乙烯纳米微球。单一使用粒径低于100nm的胶乳则出现检测灵敏度达不到要求，单一使用粒径为200nm左右的胶乳则线性范围较�。�故使用单一粒径胶乳无法同时兼顾检测灵敏度和线性范围，使用本发明的复合胶乳进行标记后，可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，对胃病或胃癌的检测来说具有检测快速、敏感度高、特异性强和准确性好等优点。
文档编号G01N33/573GK102645537SQ201210127509
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者金鑫 申请人:北京美康生物技术研究中心