专利名称：纯化血清白蛋白及免疫学测定方法
技术领域：
本发明涉及批次差少的纯化血清白蛋白、及使用该纯化血清白蛋白的反应性高、 非特异性反应少的免疫学测定方法。
背景技术：
作为血液、尿等中所含的微量物质的测定方法，采用免疫学测定方法。免疫学测定 方法基于抗原抗体反应的特异性强结合，即使从各种物质混合存在的试样中，也能够特异 性地、灵敏性良好地测定目标物质。但是，近年来，测定血液中的癌标记物、病毒等抗原、抗细菌或病毒的抗体等极微 量成分的需求增高，迫切要求免疫学测定方法具有更高的灵敏性。作为实现免疫学测定方法的高灵敏性的尝试，提出了例如在测定试剂中添加反 应促进剂的方法(专利文献1)、在反应体系中大量添加惰性蛋白的方法(专利文献2)、在 不溶性载体上固定抗原或抗体并用免疫学上为惰性的蛋白等进行封闭时通过加热使封闭 剂变性的方法(专利文献3)等。但是，专利文献1所述的添加反应促进剂的方法中，存在有时诱发非特异性反应 的问题。另一方面，专利文献2、3所述的方法中，通常使用血清来源的白蛋白作为用于防 止非特异性反应的封闭剂。但是，血清白蛋白存在由于批次差有时反应性显著差异、或不能 充分得到效果的问题。专利文献1 日本特开平4-122858号公报专利文献2 日本特开2000-46828号公报专利文献3 日本特开平10-197530号公报
发明内容
鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供批次差少的纯化血清白蛋白、及使用该纯 化血清白蛋白的反应性高、非特异性反应少的免疫学测定方法。本发明之一为一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶 性载体的悬浮液，其中，以制成水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长 下测定的吸光度为9. OmAbs以下的组分为主成分。本发明之二为一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶 性载体的悬浮液，其中，以按Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下的组分为主成分。以下，详细说明本发明。本发明人等进行了深入研究，结果发现，使用以制成1 %水溶液时使用光程长为 1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定的吸光度为9. OmAbs以下的组分、或者按Imol计胆 红素结合量为0. 9mmol以下的组分为主成分的纯化血清白蛋白，作为封闭剂和/或不溶性 载体的悬浮液时，可以进行几乎没有批次差、反应性高、非特异性反应少的免疫学测定，从而完成了本发明。关于其理由目前尚未明确。血液中的血清白蛋白通常吸附胆红素(黄色色素成 分)、游离脂肪酸等，发挥对它们进行转运的作用。推测以往的血清白蛋白的批次差可能是 由于这些吸附物的有无及量比引起的。满足本发明之一、二的条件的组分是吸附物极少的 组分，通过使用以该组分为主成分的纯化血清白蛋白，推测可能可以实现反应性高、非特异 性反应少的免疫学测定。本发明之一的纯化血清白蛋白，以制成水溶液时使用光程长为1.0cm的石英 池在463nm的波长下测定的吸光度为9. OmAbs以下的组分为主成分。优选以制成水溶 液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定的吸光度为8. OmAbs以下的组分 为主成分的纯化血清白蛋白，更优选以制成水溶液时使用光程长为1.0cm的石英池在 463nm的波长下测定的吸光度为7. OmAbs以下的组分为主成分的纯化血清白蛋白。血清白蛋白的这样的组分，是胆红素(黄色色素成分、吸收波长438nm (BSA结合型 胆红素的吸收波长为463nm))等的吸附极少的组分，将以这样的组分为主成分的本发明的 纯化血清白蛋白用于封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液时，可以进行几乎没有批次差、反 应性高、非特异性反应少的免疫学测定。另外，“作为主成分”是指，优选仅由上述组分构成，但是在不损害本发明的目标效 果的范围内可以混入其它组分。容许混入的其它组分的量比因组分而异。127T.U.下的波长700nm下的吸光度变 化量可以维持0. 06Abs以上的比例由表5及
图1求出。例如，在制成1 %水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定的 吸光度超过9. OmAbs且为13. 5mAbs的组分的情况下，可以混入至总量的45重量％左右。例如，在制成1 %水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定的 吸光度超过9. OmAbs且为20. OmAbs以下的组分的情况下，可以混入至总量的15重量％左
右ο例如，在制成1 %水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定 的吸光度超过9. OmAbs且为26. OmAbs以下的组分的情况下，可以混入至总量的5重量％左
右ο另外，本说明书中，T.U.是利用密螺旋体(tr印onema)抗体测定试剂盒Mediace TPLA (积水医疗公司制)测定的抗密螺旋体抗体效价的单位TITER UNITS的简称。测定WHO 标准品(梅毒病人血清国际标准品[第一批国际标准制备品]、1958年建立)时，1T.U.= 2mIU。另夕卜，将10T.U.以上的作为阳性。本发明之二的纯化血清白蛋白，以按Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下的组分 为主成分。优选以按Imol计胆红素结合量为0. Smmol以下的组分为主成分的纯化血清白 蛋白，更优选以按Imol计胆红素结合量为0. 7mmol以下的组分为主成分的纯化血清白蛋 白。在将以血清白蛋白的这样的组分为主成分的本发明的纯化血清白蛋白用于封闭剂和/ 或不溶性载体的悬浮液时，可以进行几乎没有批次差、反应性高、非特异性反应少的免疫学 测定。另外，“作为主成分”是指，优选仅由上述组分构成，但是在不损害本发明的目标效 果的范围内可以混入其它组分。
另外，血清白蛋白的每Imol的胆红素结合量，例如可以通过使用了胆红素测定试 剂(积水医疗公司制、“Autosera BIL-2","AutoseraD-BIL^")的偶氮胆红素法进行测定。容许混入的其它组分的量比因组分而异。127T.U.下的波长700nm下的吸光度变 化量可以维持0. 06Abs以上的比例由表5及图1求出。例如，在以Imol计胆红素结合量超过0. 9mmol且为1. 5mmol以下的组分的情况
下，可以混入至总量的45重量％左右。例如，在以Imol计胆红素结合量超过0. 9mmol且为2. Ommol以下的组分的情况
下，可以混入至总量的15重量％左右。例如，在以Imol计胆红素结合量超过0. 9mmol且为2. 7mmol以下的组分的情况
下，可以混入至总量的5重量％左右。上述制成1 %水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测定的吸 光度为9. OmAbs以下的组分、或者以Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下的组分，例如，可 以通过在阴离子交换层析纯化中用150mM以下的盐浓度的洗脱液洗脱而得到。作为本发明的纯化血清白蛋白的原料的血清白蛋白，为动物血清来源的白蛋白， 具体而言，例如优选人、牛、马、羊等大型哺乳动物的血清来源的白蛋白。其中，从廉价且可 以大量获得的观点考虑，特别优选牛血清来源的血清白蛋白。另外，上述血清白蛋白，在进行阴离子交换层析纯化前，优选通过Cohn法、热休克 法等进行粗纯化。上述阴离子交换层析纯化中使用的层析柱的载体没有特别限制，例如，可以举 出弱阴离子性的 DEAE Separose Fast Flow、ANX Separose4Fast Flow、强阴离子性的 Q Separose Fast Flow、Q Sepharose XL 等。上述阴离子交换层析纯化中使用的层析柱的载体的粒径的优选下限为ΙΟμπι，优 选上限为200 μ m。上述层析柱的载体的粒径小于10 μ m时，背压升高，有时不得不使纯化时 的流速减缓。上述层析柱的载体的粒径超过200 μ m时，有时分离性能变差。上述层析柱的 载体的粒径的更优选下限为45 μ m,更优选上限为165 μ m。上述阴离子交换层析纯化中使用的层析柱，例如可以使用HiPr印16/10DEAE FF、 HiPr印 16/10ANX FF (高分辨率)、HiPr印 16/10Q FF(均为 GE Healthcare 公司制)等市售
P
BFI ο上述阴离子交换层析纯化中使血清白蛋白结合到层析柱载体上时使用的缓冲液 (以下也称结合液)没有特别限制，例如，可以举出磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液寸。上述缓冲液的浓度通常在5 150mM的范围内用。上述缓冲液的pH优选为4 9、更优选5 8。作为上述阴离子交换层析纯化中使用的洗脱液，可以举出盐浓度为150mM以下的 洗脱液，例如可以举出在磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液等中添加盐使盐浓度为 150mM以下的洗脱液。上述盐没有特别限制，例如，可以举出氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)等。上述洗脱液的pH优选为4 9、更优选5 8。其中，通常使用在与结合液相同的缓冲液中添加盐而得到的洗脱液。
对利用上述阴离子交换层析的纯化方法的一个优选例进行说明。首先，制备在结合液(例如50mMTris-HCl缓冲液(pH7. 5))中添加血清白蛋白而 得到的溶液。然后，将该溶液添加到用结合液平衡后的阴离子交换层析柱上，在结合液流过的 同时使血清白蛋白吸附到阴离子交换层析柱上。然后，流过盐浓度为150mM以下的洗脱液将血清白蛋白洗脱，得到纯化血清白蛋白。通过上述阴离子交换层析纯化得到的纯化血清白蛋白，可以进一步通过透析法、 凝胶过滤法等进行纯化。本发明的纯化血清白蛋白的批次差极少。如果使用本发明的纯化血清白蛋白作为免疫学测定方法中的封闭剂或不溶性载 体的悬浮液，则可以进行反应性高、非特异性反应少的免疫学测定。本发明的另一方面是使用本发明的纯化血清白蛋白而得到的免疫学测定试剂。本发明的另一方面是一种免疫学测定方法，利用了抗原抗体反应，其中，使用本发 明的纯化血清白蛋白作为封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液。本发明的另一方面是一种用于免疫学测定的固相制备用试剂，其以本发明的纯化 血清白蛋白为主成分。本发明的纯化血清白蛋白通过凝胶过滤纯化后的单体，用于进一步提高免疫学测 定试剂的反应性。进一步详细说明本发明的免疫学测定方法。作为本发明的免疫学测定方法的对象的被测物质，例如可以举出生物试样中的抗 原或抗体。具体可以举出例如肝炎(乙型、丙型)来源的抗原或抗体、HIV抗原或抗体、梅 毒来源的抗体、甲胎蛋白等癌标记物、胰岛素等激素、内分泌素等。其中，以抗梅毒抗原的抗梅毒螺旋体抗体作为被测物质时特别有效。上述抗梅毒螺旋体抗体测定系统中使用的抗原，可以是菌体破碎物，也可以是纯 化物。另外，也可以由一种以上通过基因重组技术人工合成的物质组合而成。本发明的免疫学测定方法没有特别限制，优选使用在不溶性载体上负载有抗原或 抗体的材料的方法。上述不溶性载体没有特别限制，例如，可以举出有机高分子粉末、微生物、血细胞、 细胞膜片等。其中优选有机高分子粉末。上述有机高分子粉末没有特别限制，例如，可以举出天然高分子粉末、合成高分子 粉末等。上述天然高分子粉末没有特别限制，例如，可以举出不溶性琼脂糖、纤维素、不溶 性葡聚糖等。上述合成高分子粉末没有特别限制，例如，可以举出聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸 (盐)共聚物、苯乙烯_甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈_ 丁二烯_苯乙烯共聚物、氯乙烯_丙烯 酸酯共聚物、乙酸乙酯_丙烯酸酯共聚物等。另外，上述不溶性载体也可以使用表面引入有磺酸、羧基等的不溶性载体。上述不溶性载体特别优选使合成高分子粉末均勻悬浮而得到的胶乳粒子。
上述胶乳粒子的粒径没有特别限制，优选的下限为0.05 μ m、优选的上限为 1. 5 μ m。上述胶乳粒子的粒径小于0. 05 μ m时，凝聚引起的光学变化量�。惺钡貌坏讲舛� 所需的高灵敏度。上述胶乳粒子的粒径超过1. 5μπι时，胶乳粒子的凝聚引起的光学变化量 超过可测定范围，有时测定范围变小。上述胶乳粒子的粒径的更优选下限为0. 1 μ m，更优选 上限为0.8 μ m。在不溶性载体上负载抗原或抗体的方法没有特别限制，可以使用利用物理、化学 结合进行负载的现有公知的方法。在本发明的免疫学测定方法中，本发明的纯化血清白蛋白对于在上述不溶性载体 (胶乳粒子)上负载有抗原或抗体的材料作为封闭剂使用，或者作为在上述不溶性载体上 负载有抗原或抗体的材料的悬浮液使用。在这样得到的负载有抗原或抗体的胶乳粒子悬浮液中添加样本，并反应一定时 间。通过光学测定或目测观察反应后胶乳粒子上负载的抗原或抗体与样本中的被测物质的 抗原抗体反应所引起的凝聚的程度，由此可以测定样本中的被测物质。上述凝聚程度的光学测定方法没有特别限制，通过所使用的不溶性载体的粒子的 大小、浓度的选择、反应时间的设定，测定散射光强度、吸收光度、透射光强度等的增减。另 外，也可以组合使用这些方法。进行上述测定时的光的波长优选为300 900nm。上述的光学测定方法中使用的装置，可以举出能够检测散射光强度、透射光强度、 吸光度等的光学设备，只要是通常使用的生化学自动分析仪则任何一种均可以使用。上述凝聚程度的目测观察方法，通�？梢允褂媒竞徒喝榱Ｗ有∫旱娜� 液在判定板上混合，晃动混合液后，判断有无凝聚的方法等。另外，关于凝聚程度的观察，除 了目测的方法以外，也可以使用用摄像机等拍摄凝聚状态后进行图像处理的方法。根据本发明，可以提供批次差少的纯化血清白蛋白、及使用了该纯化血清白蛋白 的反应性高、非特异性反应少的免疫学测定方法。
具体实施例方式以下，举出实施例进一步详细说明本发明的方式，但本发明不限于这些实施例。(实施例1)(1)纯化血清白蛋白的制备在结合液(50mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5))中添加市售的牛血清白蛋白 (Serologicals公司制、“Cohn Fraction V”、以下也称为“未纯化BSA”、批次83)，制备15% 未纯化BSA溶液。将得到的15%未纯化BSA溶液5mL添加到用结合液平衡后的市售的阴离子交换层 析柱(GE Healthcare 公司制、“DEAE Sepharose FF”480mL/ “XK50”)上，使结合液以 4mL/ 分钟流过的同时使BSA吸附到层析柱上。然后，在结合液中混合2M的氯化钠溶液得到氯化 钠浓度为80mM的洗脱液，使该洗脱液以IOmL/分钟的流速流过，得到以SOmM盐浓度的洗 脱液洗脱的白蛋白组分。另外，与此不同地，在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓 度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/分钟的流速流过，得到在混合开始后73. 3 74. 5分钟 (盐浓度69. 6 72. OmM的组分)洗脱的白蛋白组分。另外，关于所得白蛋白组分的盐浓度，考虑层析柱的容量，表示从层析柱上洗脱的白蛋白溶液中的氯化钠浓度。将所得组分溶液在IOOmM的磷酸缓冲液(pH7. 4)中透析，制备成1 %溶液。对所得 的纯化血清白蛋白的溶液，使用标准池(GL Science公司制、“S10-UV”、光程长1.0cm) 测定波长463nm下的吸光度，结果分别为1. 3mAbs、5. ImAbs0另外，关于所得的纯化血清白蛋白，通过使用胆红素测定试剂(积水医疗公司制、 "Autosera BIL_2”、“Autosera D-BIL-2”)的偶氮胆红素法来测定平均Imol BSA的胆红素 结合量，结果为0. ImmoUO. 5mmol。以下，也将它们分别称为“纯化BSA(1.3mAbs/0. lmmol)”、“纯化 BSA(5. ImAbs/O. 5mmol)”。(2)梅毒螺旋体抗原负载胶乳液的制备将在IOOmM磷酸缓冲液(pH7. 4)中以150 μ g/mL的蛋白浓度溶解的梅毒螺旋体抗 原液400 μ L添加到平均粒径0. 4 μ m的聚苯乙烯胶乳(固体成分10 (w/v) %、积水化学工业 公司制)100yL中，在4°C搅拌1小时。然后，添加纯化BSA(5. ImAbs/O. 5mmol)溶液2mL，并搅拌1小时。将得到 的液体在10 °C以13000rpm离心分离10分钟，将所得沉淀物添加到纯化BSA溶液 (1. 3mAbs/0. lmmol) 4mL中，使胶乳悬浮，由此制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。(实施例2)在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/ 分钟的流速流过，得到在混合开始后87. 7 88. 9分钟(盐浓度98. 4 100. SmM的组分) 洗脱的纯化BSA(0. 9mAbs/0. lmmol)溶液，除了使用所得纯化BSA溶液作为封闭剂以外，与 实施例1同样地制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。(实施例3)在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/ 分钟的流速流过，得到在混合开始后102. 1 103. 3分钟(盐浓度127. 2 129. 6mM的组 分)洗脱的纯化BSA(3. 3mAbs/0. 3mmol)溶液，除了使用所得纯化BSA溶液作为封闭剂以 外，与实施例1同样地制备被堵螺旋体抗原负载胶乳液。(比较例1)除了将BSA溶液在不进行阴离子交换层析纯化的情况下(以下称为未纯化BSA) 使用以外，与实施例1同样地制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。另外，对于未纯化BSA的1 %溶液，与实施例1同样测定的波长463nm下的吸光度 为9. 8mAbs，每Imol BSA的胆红素结合量为1. Ommol。(比较例2)在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/ 分钟的流速流过，得到在混合开始后116. 5 117. 7分钟(盐浓度156. 0 158. 4mM的组 分)洗脱的纯化BSA(9. 8mAbs/l. Ommol)溶液，除了使用所得纯化BSA溶液作为封闭剂以 外，与实施例1同样地制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。(比较例3)在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/ 分钟的流速流过，得到在混合开始后130. 9 132. 1分钟(盐浓度184. 8 187. 2mM的组分)洗脱的纯化BSA(17. 9mAbs/l. 9mmol)溶液，除了使用所得纯化BSA溶液作为封闭剂以 外，与实施例1同样地制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。(比较例4)在结合液中混合2M的氯化钠溶液使氯化钠浓度每1分钟增加2mM，并且以IOmL/ 分钟的流速流过，得到在混合开始后145. 3 146. 5分钟(盐浓度213. 6 216. OmM的组 分)洗脱的纯化BSA(24. 9mAbs/2. 6mmol)溶液，除了使用所得纯化BSA溶液作为封闭剂以 外，与实施例1同样地制备梅毒螺旋体抗原负载胶乳液。(评价)使用实施例1 3、比较例1 4制备的梅毒螺旋体抗原负载胶乳液，通过下述方 法进行评价。(1)抗梅毒螺旋体抗体标准液的测定取梅毒阳性标准血清(积水医疗公司制、5个浓度)15 μ L作为抗梅毒螺旋体抗 体标准液，在其中混合样本稀释液(在含有1 % BSA的IOOmM磷酸缓冲液(ρΗ7. 4)中添加 0. 2 的Lipidure (日油公司制)所得的溶液)150 μ L，并在37°C保持适当时间。在 所得溶液中添加梅毒螺旋体抗原负载胶乳液50 μ L并搅拌后，测定约80秒至300秒之间的 波长700nm下的吸光度的变化量，作为吸光度变化量(AAbs)。另外，测定使用自动分析装置日立7170型。结果如表1所示。
(2)阴性样本测定除了使用生理盐水及阴性样本1 10作为样本以外，与
权利要求
一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液中，其特征在于，以制成1％水溶液时使用光程长为1.0cm的石英池在463nm的波长下测定的吸光度为9.0mAbs以下的组分为主成分。
2.一种免疫学测定试剂，其特征在于，使用以制成水溶液时使用光程长为1. Ocm的 石英池在463nm的波长下测定的吸光度为9. OmAbs以下的组分为主成分的纯化血清白蛋白 而得到。
3.一种免疫学测定方法，利用了抗原抗体反应，其特征在于，在封闭剂和/或不溶性载 体的悬浮液中，使用以制成1 %水溶液时使用光程长为1. Ocm的石英池在463nm的波长下测 定的吸光度为9. OmAbs以下的组分为主成分的纯化血清白蛋白。
4.一种用于免疫学测定的固相制备用试剂，其特征在于，以权利要求1所述的纯化血 清白蛋白为主成分。
5.一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液 中，其特征在于，以按Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下的组分为主成分。
6.一种免疫学测定试剂，其特征在于，使用以按Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下 的组分为主成分的纯化血清白蛋白而得到。
7.一种免疫学测定方法，利用了抗原抗体反应，其特征在于，在封闭剂和/或不溶性载 体的悬浮液中，使用以按Imol计胆红素结合量为0. 9mmol以下的组分为主成分的纯化血清 白蛋白。
8.一种用于免疫学测定的固相制备用试剂，其特征在于，以权利要求5所述的纯化血 清白蛋白为主成分。
全文摘要
本发明的目的在于提供批次差少的纯化血清白蛋白、及使用该纯化血清白蛋白的反应性高、非特异性反应少的免疫学测定方法。本发明为一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液，其中，以制成1％水溶液时使用光程长为1.0cm的石英池在463nm的波长下测定的吸光度为9.0mAbs以下的组分为主成分。
文档编号G01N33/543GK101978268SQ200980109240
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月31日
发明者原康之, 吉川胜己, 川本道子, 赤峰隆之 申请人:积水医疗株式会社
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