专利名称：氧化还原酶标记的电化学检测生物活性物质的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用氧化还原酶标记电化学测量生物活性物质的方法，具体涉及一种通过使用氧化还原酶标记的抗体与固载在电极上的作为要检测的生物活性物质的抗原快速结合以进行电化学检测的方法及其检测装置。
背景技术：
常用的酶联免疫吸附试验(ELISA)中的双抗体(原)夹心法为检测抗原(体)的常见方法，该方法应用针对抗原两个不同决定簇的两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原，但该种方法使用的耗材昂贵，检测成本较高，且生物活性物质分离鉴定试验周期长。
发明内容
为了解决ELISA法存在的耗材昂贵检测成本较高的问题，本发明提供一种使用氧化还原酶标记的测量生物活性物质的电化学测试方法，包括将样品中可能含有的欲检测的作为抗原的生物活性物质固载在电极表面上；进行氧化还原酶标记的与欲检测的生物活性物质相对应的抗体和固载在电极上的待测样品可能含有的生物活性物质特异性识别结合步骤；洗去非特异性结合的氧化还原酶标记的所述抗体制得工作电极；和将由该工作电极和参比电极构成的测试电极组插入到所述氧化还原酶对应的催化底物中，测量有无标记的氧化还原酶与反应槽中的催化底物反应而产生的电信号，进而判断有无欲测试的生物活性物质的存在。
本发明另外还提供一种基于该测试方法的检测装置，包括由表面可能固载有氧化还原酶标记的抗体抗原复合物的工作电极和参比电极组成的测试电极组；与该氧化还原酶对应的催化底物反应槽；和电信号检测装置。
由于本发明的检测方法中所使用的测试设备和使用的耗材价格便宜，明显降低了测试的成本。另外本发明通过使用电泳法使氧化还原酶标记的抗体和固载在电极上的欲检测的生物活性物质特异性结合，明显的缩短了检测的周期，提高了测试效率。本发明还提供一种能够进行多通道测试的电极矩阵，提高了测试的测试效率，该电极矩阵由相互平行的至少2个以上的测试电极组排列形成的。本发明的测试装置可以进一步包括数据采集和处理装置以更精确和直观地显示测得的电信号，其中多通道数据采集卡通过由数据传输排线检测并收集多个测试电极组产生的电信号，由分析软件进行数据分析后将电信号显示于屏幕上。使用本发明的检测生物活性物质的电化学方法具有检测成本低、速度快的优点。
以下附图用于说明本发明的具体实施方式
，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1A表示本发明的工作电极16和参比电极15的示意图。
图1B表示图1A中部分A处工作电极16表面上固载的抗原与氧化还原酶标记的抗体特异性结合后的经放大的结构示意图。
图2表示在有欲检测的生物活性物质的存在时，本发明检测出的与时间相对应的电信号图谱。
图3是表示在催化底物溶液中加入硅油和氨基乙醇对所检测的电信号图谱的影响图。
图4是用于本发明的测试方法的电化学检测装置的示意图。
具体实施例方式
以下将结合附图对本发明作详细描述。
对于本发明，将用于将可能含有欲测定的生物活性物质的样品固定在工作电极上的方法可以采用非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶等固定到载体表面的吸附法，以及利用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些基团反应，形成共价的化学键，从而使酶分子结合到载体上的共价键合法。本发明优选用丝素蛋白固载可能含有欲检测的生物活性性物质。丝素蛋白是蚕丝经过95％乙醇或无水乙醇浸泡洗涤后再放入溴化锂中溶解所得的粘稠液体，是一种天然的生物胶水，用它和检测或待测的作为生物活性物质的抗原等量混合，然后经过涂抹而固定在电极表面，固定条件温和。使用该方法能够保持生物活性物质天然的构象，大大减少其活性的丧失，增加其利用效率。应该指出只要满足能够牢固地将生物活性物质固载在工作电极16上，也可以采用其它的固载方法而不会降低本发明的实施效果，如果采用本发明所述的电泳步骤，所采用的固载方法应能够提供在进行电泳时所需要的不易解离这一要求。
将氧化还原酶标记的与欲检测的生物活性物质相对应的抗体与固载在电极上的样品中可能含有的生物活性物质特异性结合的方式，可以采用ELISA法的常规结合方法。
对于本发明优选采用本发明下述的电泳法使其进行特异性结合步骤。将抗欲测定的生物活性物质的经氧化还原酶标记的抗体与双浓度巴比妥缓冲液以及蒸馏水以适当体积比进行稀释，作为电泳溶液。由于欲检测的生物活性物质有特定的等电点，调节巴比妥缓冲液在适当pH值，使被检测的生物活性物质所带的电荷较少。将固载有待测样品的电极接负极，另插一个接正极的铂电极作为辅助电极，形成一个回路，则抗欲测定的生物活性物质的经氧化还原酶标记的抗体在溶液中向负极泳动。因样品中可能含有的欲检测的生物活性物质已被固定，不易解离，其电泳速度较为缓慢，并在电渗作用影响下，由正极向负极移动。所以，如果固载的样品中含有欲测试的生物活性物质(抗原)，经氧化还原酶标记的抗体能与固载在电极上的抗原快速识别结合。由于在电场中限制了经氧化还原酶标记的抗体的自由扩散，从而提高了测试的灵敏度，且大幅度缩短了抗体和抗原的特异性结合的时间，从而整体上缩短了检测的时间，提高了效率。另外，可以根据生物活性物质的种类以及抗生物活性物质的氧化还原酶标记的抗体的活性，调整溶液成分和电�。铀倏乖固宓姆从κ奔�。例如采用不同pH值和不同离子浓度的缓冲液，本发明中电泳溶液的pH值优选4-10和离子浓度优选0.01-0.1mol/l，电泳温度优选10-40℃。抗体分子上抗原结合部位具有与抗原形状相当的分子空间，其中的抗体结合点和抗原决定簇足够接近时，借助离子键、氢键和范德华力的作用将抗体与其抗原特异性结合在一起形成抗体抗原复合物。所固载的抗原在与相应的抗体结合时，自身的立体结构和物性发生变化，但这个变化比较小。
图1B为制得的固载有欲检测的抗原和氧化还原酶标记的抗体复合物的工作电极16的图1A中的A部分的放大示意图。在工作电极16的表面10上固载有丝素蛋白11，欲检测的生物活性物质(抗原)13结合在丝素蛋白11上，氧化还原酶12标记的抗体14特异性地和生物活性物质(抗原)相结合在一起形成抗原和氧化还原酶标记的抗体的复合物。
将进行完特异性结合步骤后的可能含有特异性结合的抗体抗原复合物的电极浸入PBS缓冲液中，均匀搅拌一段时间，洗去非特异性结合的氧化还原酶标记的抗体，中间换液两次，再用去离子水洗去电极表面的无机离子，制得可能固载有欲检测的抗原和氧化还原酶标记的抗体复合物的工作电极16，待用。由于经过了洗涤步骤之后，工作电极上不会存在非特异性结合的氧化还原酶标记地抗体的存在，因此如果待测样品中没有欲检测的生物活性物质(抗原)，则经过特异性结合步骤之后的固载有待测样品的电极表面上不会有欲检测的抗原和氧化还原酶标记的抗体的复合物的存在，反之则有欲检测的抗原和氧化还原酶标记的抗体的复合物的存在。
将该工作电极16和作为参比电极15的铂电极组成一个测试电极组，置于和氧化还原酶相对应的催化底物的反应槽中，使用电信号检测装置进行电化学检测，以检测在工作电极16和参比电极15之间可能产生的电信号。从上面的描述中能明显知道，如果检测出有显著电信号的存在，就说明是工作电极上的氧化还原酶催化与其相对应的催化底物发生了电化学反应，也即工作电极上有特异性结合的抗体抗原复合物的存在，即说明待测样品中有欲检测的生物活性物质(抗原)的存在。
实施本发明方法的电化学测试装置可以是采用常用的如伏安法等可以来检测催化底物在氧化还原酶催化下反应产生的电信号的测试装置，可以不需要数据采集装置和相应的分析软件而直接从如电压表或电流表等测试装置上直接观测有无明显电信号的产生。本发明优选采用下述方法使用数据采集卡来进行电化学检测，以更直观和准确地检测产生的电信号。
采用常见的方法将工作电极组和参比铂电极电学连接到数据采集卡上。但优选将工作电极组和参比铂电极的后端以一预定的间隔电学连接或接插在数据传输排线的标准接口上，数据传输排线另一端的标准插口与数据采集卡的接口相连，该数据传输排线为市场可买到的电脑上常用的排线，其插口处有许多间隔相等的小孔，铂丝可以插入并不会掉下来，如使用其他电极如石墨电极等较粗或较细的电极可以通过用合适如铜等的导线缠绕后插接到数据传输排线的标准接口上，并保持与水平面垂直及互相平行。数据传输排线的另一端的另一标准接口与数据采集卡的插口相匹配，插接后使工作电极组与数据采集卡电学连接。且插接上的工作电极16和参比电极15可以拆卸下来，进行清洗后重复使用。标准接口使数据传输排线和数据采集卡相连接，如图4所示，工作电极16以及参比铂电极与接口的水平面保持垂直。数据采集卡及其标准接口可从深圳市研祥智能科技股份有限公司购得，型号为PCL-812PG，该种型号的数据采集卡有8个通道，既能进行单通道测试，也能同时进行多通道测试，其采集方法和步骤可按照其说明书的要求操作。应该指出，本发明中使用的数据采集卡具有能够检测与其相连接的工作电极16和参比电极15之间的电压，即具有电压检测功能，如果连接有多组工作电极16和参比电极15可以同时进行多通道的电压检测。本发明也可以采用其他与上述型号的数据采集卡的基本原理相同的数据采集卡，并不影响测定的技术效果。
在测试之前，将由制得的工作电极16与作为参比电极15的铂金电极组成的测试电极组一起浸入反应槽中的PBS里一定时间，使初始电压值稳定。再将适量的催化底物加入PBS中，其中催化底物的浓度可在0.01％-1％，并要求使底物浓度相对于氧化还原酶量饱和，且不能抑制酶的催化活性，具体浓度按实际情况而定。采用伏安法检测该氧化还原对在相应的氧化还原酶催化下的氧化还原反应产生的电信号，使用上述的数据采集卡采集电信号后传入电脑并经过数据分析得出的测试结果。将测得的电信号显示在屏幕上，如有响应电信号的出现则表明有欲测的生物活性物质的存在，反之则没有欲测的生物活性物质的存在。为了更直观和精确地观测所产生的显著电信号，本发明使用相应的分析软件分析数据采集卡收集的数据通过电脑屏幕显示出来。本发明的从深圳市研祥智能科技股份有限公司购得的数据采集卡本身自带有数据分析软件，可以使用该分析软件对测试结果进行分析。但另外根据本发明的测试方法的特点以及所采用的数据采集卡的数据采集方式，也可以在该软件的基础上了进行编程，使所开发的软件用于本发明的分析之用。使用上述的本发明的测试方法的最低检测浓度1.0×10-11mol/L，响应时间为10s左右。
图2为本发明通过电化学方法测得的经分析软件处理后的电压信号与时间对应关系图。显示的电压信号包括噪音、一般电信号和显著电信号，噪音值的电压在-30±10mV，而响应电信号值在-195±10mV至-430±10mV，比率为6.5/14.33。表明检测效果明显，抗干扰能力强。
依照本发明的测试方法，可以在含催化底物的反应槽中加入适量的乙二胺四乙胺(EDTA)，以增强氧化还原酶与催化底物的结合能力。加入适量的氨基乙醇可以减少噪音，这是因为氨基乙醇可以减少反应过程中的非特异性结合，降低背景噪音，从而提高了检测的灵敏度。另外因为硅油是生理惰性的，介电性能好，所以加入适量的硅油可以增强电信号。
图3为响应电压值与硅油、氨基乙醇剂量关系图谱，表示在底物反应槽中加入硅油以及氨基乙醇对改善测试得到的电信号的效果对比图。其中图的右边表格中的符号+表示有对应物质的存在，符号-表示没有对应物质的存在。从图中可以看出经放大后有噪音，加入硅油可使反应体系的介电常数增加。加入氨基乙醇可使工作电极16表面的非特异性结合的位点减少，以降低检测的背景噪音。
在以上的实施方式中，可以用铂电极、石墨电极、玻碳电极、玻璃电极、锑电极等金属电极，但本发明优选铂电极。
上面所述的测试步骤中，也可以使用按照下述的多通道测试电极矩阵来代替由单一的工作电极16和参比电极15组成的测试电极组来进行电信号的多通道检测。该多通道电极矩阵由两个以上的测试电极组构成，所述测试电极组同样也由按照上面所述步骤制得的固载有氧化还原酶标记的抗体抗原复合物的工作电极16和参比电极组成。其中工作电极16和参比电极15可以通过常用的方法电学连接到数据采集卡的接口上，为了操作方便也可以将工作电极和参比电极以合适的间距通过固定板等固定。但本发明优选以下述方法和数据采集卡电学连接。将工作电极16和参比电极15以一预定的间隔接插在数据传输排线的标准接口上，且测试电极组与接口的水平面保持垂直，测试电极组之间的间距相等，测试电极组的间距可以根据反应槽的大小确定，测试电极组之间互相平行，数据传输排线另一端的标准插口与数据采集卡的接口相连。数据采集卡中配制的电压检测装置相应地检测每一个测试电极组的工作电极16和参比电极15间形成的电压差信号，并采集后传给分析软件。每一个测试电极组数据占用采集卡的一个通道，如可以使用8个测试电极组构成2×4测试电极组矩阵，8个测试电极组分别连接数据采集卡的8个通道。但如果数据采集卡能够提供足够的通道数，可以根据需要扩增测试电极组矩阵的大�。�4×4、8×8等。该种由测试电极组构成的电极矩阵便于洗涤以及重新涂膜和检测，且在进行电化学检测时能够同时多通道检测出多个电信号，提高了检测的效率。以上的数据采集卡可以使用上述的深圳市研祥智能科技股份有限公司型号为PCL-812PG的数据采集卡。
图4为用于本发明描述的检测生物活性物质的方法的测试装置的一种实施方式的示意图。数据传输排线1的标准接口3由可升降的固定装置9固定。一个固定装置9沿着其移动的柱状体8垂直固定在底座上，固定装置9将标准接口3固定在水平位置，其中标准接口3上插接有与标准接口3面垂直的单一的测试电极组4或者测试电极组矩阵。底物反应槽5置于底座上，且与标准接口3上插接的测试电极组4相对应。标准接口3通过数据传输排线1的导线和安装在计算机内的数据采集卡相连接。欲进行检测时，使标准接口3的固定装置9下降到能使插接在标准接口3上的可能固载有氧化还原酶标记的抗体抗原复合物的工作电极16和参比电极15组成的测试电极组或者由该种测试电极组组成的测试电极组矩阵与底物反应槽5中的底物溶液相接触，通过数据收集卡检测并采集电极组之间的电压差信号，传输给计算机，计算机运用相应的分析软件进行分析处理后，将电信号显示在计算机屏幕上，通过判断有无响应的显著电信号的存在来检测有无欲测试的生物活性物质的存在。
本发明的测试方法可检测兔IgG、沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的O7单抗和鸡白痢等，其测试范围广。
使用本发明测试方法，即使按照铂丝(尺寸为_0.4mm×1cm)以16根计，150-200人民币，且可重复利用；数据采集卡1500-3000人民币；所用的酶标抗体及其它试剂的量是ELISA的五分之一，电脑4000人民币左右。而用于ELISA测试法用的荧光标记的酶为千元左右，ELISA还要用到以增加荧光强度便于检测一抗二抗甚至三抗等，增加开支。用于荧光检测的读取器(ELISA Reader)需48000左右人民币，进口的全自动荧光检测的读取器价格可高达上百万美元。因此本测试方法能够很明显地节约测试成本。此外，ELISA测试中要用到供氧体常用的如邻苯二胺和四甲基联苯胺等供氢体具有强烈的致癌作用，具有较高的操作危险性。此外，通过本发明的具体实施方式
可以看出，由于本测试方法中采用了电泳步骤和基于自动检测和分析的电化学测试技术，使得本发明方法的定性检测生物活性物质的时间降低为1小时左右，比ELISA方法所需的检测时间1.5-24小时有明显降低。
下面以实施例进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1将尺寸为_0.4mm×1cm的铂金电极用蒸馏水清洗后晾干，将4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4缓冲液中制成含抗原的溶液的待测样品。兔IgG是抽取兔血清，室温离心10000rpm，5分钟，取上清而得的。将抗原溶液与丝素蛋白溶液等体积混合后，涂膜该铂电极面，在室温下自然凉干成膜。其中丝素蛋白是蚕丝经过95％乙醇或无水乙醇浸泡洗涤后再放入溴化锂中溶解所得的粘稠液体。
将辣根过氧化物酶标记的购于华美生物工程公司的山羊抗兔IgG。与双浓度巴比妥缓冲液以及蒸馏水以体积比为2∶2∶1进行稀释，配成pH8.6，C＝0.05mol/l双浓度巴比妥缓冲液作为电泳溶液，将固定有抗原兔IgG的铂电极接负极，另插一个接正极的铂电极作为辅助电极，形成一个回路，37℃恒温，电泳仪恒流0.5mA，电泳30min，则抗体在溶液中向负极泳动，与固定在铂电极上的兔IgG结合。
将结合了酶标抗体的铂电极浸入pH7.4 PBS缓冲液中，均匀搅拌10min，洗去非特异性结合的酶标抗体，中间换液两次，再用去离子水洗去传感器表面的无机离子，制得工作铂电极。
将工作铂电极和一个作为参比电极15的铂电极插接入数据传输排线的标准接口板的插口处，标准接口板由固定装置固定在水平位置，数据传输排线与数据采集卡相连。接通计算机电源，调整数据采集卡的测试范围至-500mv到+500mv之间。打开深圳市研祥智能科技股份有限公司购得的型号为PCL-812PG的数据采集卡本身自带分析软件。向下调整固定装置的位置，使工作铂电极浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反应槽内，将测试电极组浸入两分钟待使初始电压值稳定后，将0.05％(质量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2产生电子，其反应公式为反应30分钟，使其反应充分，抗体上标记的辣根过氧化物酶催化H2O2发生氧化还原反应产生电信号。在此过程中，与计算机相连的数据采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作电极与参比电极间传送来的电信号，分析软件读取数据采集卡的电压值进行处理，将响应电信号显示在屏幕上。通过该方法的经过分析处理后，最后形成结论检测到明显的电信号，存在欲检测的物质。检测全过程少于90分钟。
实施例2将尺寸为_0.4mm×1cm的16个铂金电极用蒸馏水清洗后晾干备用。将4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4缓冲液中制成含有抗原溶液的待测样品，兔IgG是抽取兔血清，室温离心10000rpm，5分钟，取上清而得的。将抗原溶液与丝素蛋白溶液等体积混合后，涂膜上述8个铂电极的表面，在室温下自然凉干成膜。其中丝素蛋白是蚕丝经过95％乙醇或无水乙醇浸泡洗涤后再放入溴化锂中溶解所得的粘稠液体。
将辣根过氧化物酶标记的购于华美生物工程公司的山羊抗兔IgG与双浓度巴比妥缓冲液以及蒸馏水以体积比为2∶2∶1进行稀释，配成pH8.6，C＝0.05mol/l双浓度巴比妥缓冲液作为电泳溶液，将固定有抗原兔IgG的8个铂电极接负极，另外的8个铂电极接正极作为参比电极，形成回路，37℃恒温，电泳仪恒流0.5mA，电泳30min，则酶标抗体在溶液中向负极泳动，与固定在铂电极上的兔IgG结合。
将结合了酶标抗体的铂电极浸入pH7.4PBS缓冲液中，均匀搅拌10min，洗去非特异性结合的酶标抗体，中间换液两次，再用去离子水洗去传感器表面的无机离子，制得8个工作铂电极。
将每个工作电极分别和一个作为参比电极的铂电极构成8个测试电极组，将该8个测试电极组按一预定的间距插接入数据传输排线的标准接口板的插口处，并与深圳市研祥智能科技股份有限公司购得的型号为PCL-812PG的数据采集卡相连，组成2×4测试电极组矩阵，每一个测试电极组对应于数据采集卡的一个通道。标准接口板由固定装置固定在水平位置。接通计算机电源，调整数据采集卡的测试范围至-500mv到+500mv之间。打开该数据采集卡本身自带分析软件。向下调整固定装置的位置，使工作电极16浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反应槽内，将测试电极组浸入两分钟待使初始电压值稳定后，将0.05％(质量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2产生电子，其反应公式为等待30分钟，使其充分反应，抗体上标记的辣根过氧化物酶催化H2O2发生氧化还原反应产生电信号。在此过程中，与计算机相连的数据采集卡的8个通道可以每秒10至100次的速率同时采集8个测试电极组传送来的电信号，分析软件读取数据采集卡的电压值进行处理，将8个通道测得的电信号经处理后显示在屏幕上。可以8个通道上都有响应电信号出现。检测全过程少于90分钟。最后形成结论检测到显著电信号，存在欲检测的物质。
实施例3将尺寸为_0.4mm×1cm的16个铂金电极用蒸馏水清洗后晾干备用。将2.7×104个/ml沙门氏菌溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4缓冲液中制成含抗原溶液的待测样品，将此样品溶液与丝素蛋白溶液等体积混合后，涂膜上述8个铂电极的表面，在室温下自然凉干成膜。其中丝素蛋白是蚕丝经过95％乙醇或无水乙醇浸泡洗涤后再放入溴化锂中溶解所得的粘稠液体。
将辣根过氧化物酶标记的法国巴斯德研究所提供的沙门氏菌抗体与双浓度巴比妥缓冲液以及蒸馏水以体积比为2∶2∶1进行稀释，配成pH8.6，C＝0.05mol/l双浓度巴比妥缓冲液作为电泳溶液，将固定有抗原沙门氏菌的8个铂电极接负极，另外的8个铂电极接正极的作为辅助电极，形成回路，37℃恒温，电泳仪恒流0.37mA，电泳35min，则抗体在溶液中向负极泳动，与固定在铂电极上的沙门氏菌结合。
将结合了抗体的铂电极浸入pH7.4 PBS缓冲液中，均匀搅拌10min，洗去非特异性结合的酶标抗体，中间换液两次，再用去离子水洗去传感器表面的无机离子，制得8个工作铂电极。
将每个工作电极分别和作为参比电极的铂电极构成8个测试电极组，将该8个测试电极组按一预定的间距插接入数据传输排线的标准接口板的插口处，并与深圳市研祥智能科技股份有限公司购得的型号为PCL-812PG的数据采集卡相连，组成2×4测试电极组矩阵，每一个测试电极组对应于数据采集卡的一个通道。标准接口板由固定装置固定在水平位置。接通计算机电源，调整数据采集卡的测试范围至-500mv到+500mv之间。打开该数据采集卡本身自带分析软件。向下调整固定装置的位置，使工作电极16浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反应槽内，将测试电极组浸入两分钟待使初始电压值稳定后，将0.05％(质量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2产生电子，其反应公式为等待30分钟，使其充分反应，抗体上标记的辣根过氧化物酶催化H2O2发生氧化还原反应产生电信号。在此过程中，与计算机相连的数据采集卡的8个通道可以每秒10至100次的速率同时采集8个测试电极组传送来的电信号，分析软件读取数据采集卡的电压值进行处理，将8个通道测得的电信号经处理后显示在屏幕上。可以8个通道上都有响应电信号出现。检测全过程少于90分钟。最后形成结论检测到显著电信号，存在欲检测的物质。
实施例4
将尺寸为20mm×_6mm的光谱纯石墨电极用蒸馏水清洗后晾干，将4.1×10-7mol/L兔IgG溶于200uLpH7.6的NaOH-KH2PO4缓冲液中制成含有抗原溶液的待测样品。兔IgG是抽取兔血清，室温离心10000rpm，5分钟，取上清而得的。将此溶液与丝素蛋白溶液等体积混合后，涂膜该石墨电极表面，在室温下自然凉干成膜。其中丝素蛋白是蚕丝经过95％乙醇或无水乙醇浸泡洗涤后再放入溴化锂中溶解所得的粘稠液体。
将辣根过氧化物酶标记的购于华美生物工程公司的山羊抗兔IgG与双浓度巴比妥缓冲液以及蒸馏水以体积比为2∶2∶1进行稀释，配成pH8.6，C＝0.05mol/l双浓度巴比妥缓冲液作为电泳溶液，将固定有抗原兔IgG的石墨电极接负极，另插一个接正极的铂电极作为辅助电极，形成一个回路，37℃恒温，电泳仪恒流0.5mA，电泳30min，则抗体在溶液中向负极泳动，与固定在石墨电极上的兔IgG结合。
将结合了抗体的石墨电极浸入pH7.4 PBS缓冲液中，均匀搅拌10min，洗去非特异性结合的酶标抗体，中间换液两次，再用去离子水洗去传感器表面的无机离子，制得工作石墨电极。
将工作石墨电极通过导线缠绕后由导线插入标准接口，以及将一个作为参比电极的铂电极插接入数据传输排线的标准接口板的插口处，标准接口板由固定装置固定在水平位置，数据传输排线与数据采集卡相连。接通计算机电源，调整数据采集卡的测试范围至-500mv到+500mv之间。打开深圳市研祥智能科技股份有限公司购得的型号为PCL-812PG的数据采集卡本身自带分析软件。向下调整固定装置的位置，使测试电极组浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反应槽内，浸入两分钟使初始电压值稳定后，将0.05％(质量百分比)的H2O2加入PBS中，HRP催化H2O2产生电子，其反应公式为反应30分钟，使其反应充分，抗体上标记的辣根过氧化物酶催化H2O2发生氧化还原反应产生电信号。在此过程中，与计算机相连的数据采集卡每秒10至100次的速率采集工作电极16传送来的电信号，分析软件读取数据采集卡的电压值进行处理，将响应电信号显示在屏幕上。通过该方法的经过分析处理后。最后形成结论检测到显著电信号，存在欲检测的物质。检测全过程少于90分钟。
权利要求
1.一种使用氧化还原酶标记的测量生物活性物质的电化学测试方法，包括将样品中可能含有的欲检测的作为抗原的生物活性物质固载在电极表面上；进行氧化还原酶标记的与欲检测的生物活性物质相对应的抗体和固载在电极上的待测样品中可能含有的生物活性物质特异性识别结合步骤；洗去非特异性识别结合的氧化还原酶标记的所述抗体制得工作电极；和将由该工作电极和参比电极构成的测试电极组插入到所述氧化还原酶对应的催化底物中，测量有无标记的氧化还原酶与反应槽中的催化底物反应而产生的电信号，进而判断有无欲测试的生物活性物质的存在。
2.如权利要求1所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于所述的特异性识别结合采用电泳法。
3.如权利要求1所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于所述测试电极组为由相互平行的至少2个以上的测试电极组排列形成的能够进行多通道测试的电极组矩阵。
4.如权利要求1所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于使用与计算机相联的数据采集卡测试和采集反应产生的电信号。
5.如权利要求4所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于工作电极和参比电极电学连接在接数据采集卡的数据传输排线的标准接口上，且可以拆卸。
6.如权利要求1所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于固载采用丝素蛋白和待测的样品混合后涂抹在电极上。
7.如权利要求2所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于所述电泳的电泳溶液的pH值4-10，离子浓度为0.01-0.1mol/l。
8.如权利要求1所述的测量生物活性物质的电化学测试方法，其特征在于催化底物的反应槽中至少含有乙二胺四乙酸、氨基乙醇和硅油中的至少一种。
9.一种用于权利要求1-8所述的任一种电化学测试方法的测试装置，包括由表面可能固载有氧化还原酶标记的抗体抗原复合物的工作电极和参比电极组成的测试电极组；与该氧化还原酶对应的催化底物反应槽；和电信号检测装置。
10.如权利要求9所述的测试装置，其特征在于进一步包括数据采集装置和处理装置。
全文摘要
一种使用氧化还原酶标记的测量生物活性物质的电化学检测方法，以解决解决ELISA法存在的检测成本较高的问题，该检测方法包括将样品中可能含有的欲检测的作为抗原的生物活性物质固载在电极表面上；进行氧化还原酶标记的与欲检测的生物活性物质相对应的抗体和固载在电极上的待测样品可能含有的生物活性物质特异性识别结合步骤；洗去非特异性结合的氧化还原酶标记的所述抗体制得工作电极；和将由该工作电极和参比电极构成的测试电极组插入到所述氧化还原酶对应的催化底物中，测量有无标记的氧化还原酶与反应槽中的催化底物反应而产生的电信号，进而判断有无欲测试的生物活性物质的存在。本发明另外还提供一种基于该测试方法的检测装置。
文档编号G01N33/561GK1447114SQ03115418
公开日2003年10月8日 申请日期2003年2月14日 优先权日2003年2月14日
发明者李伟, 陈石燕, 潘宁, 李幼荣, 黄文尉, 刘凯, 徐炳文 申请人:李伟, 陈石燕
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