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专利名称：现场用高灵敏度免疫检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域，特别是涉及一种现场用高灵敏度免疫检测方法及试齐U盒。
背景技术：
目前，可用于现场免疫检测的产品有免疫层析检测试纸条。现行检测抗体用的免疫层析试纸条是“单份”测定，没有同时测定阳性对照和阴性对照，而且试纸条上的质控线 (C线)实际上仅是测定一抗的存在，至于一抗有否失活是测不出来的，因此，免疫层析检测试纸条的质控线(C线)不能完全用于评价试纸条质量的好坏，免疫层析检测试纸条的检测结果也不能完全用于评价假阳性或假阴性；其次，免疫层析检测试纸条的弱点是检测灵敏度低。所以在免疫检测技术中需要一种检测灵敏、并且可对假阳性或假阴性进行现场检测的方法。

发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种现场用高灵敏度免疫检测方法及试剂品.ο
为实现以上的目的，本发明采用以下技术方案
现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，由测试条、反应液、阳性对照液、阴性对照液、 显色液、液滴瓶组成；其特征在于测试条放置于试剂盒内，反应液、阳性对照液、阴性对照液、显色液分别装在相应的液滴瓶内；其中该试剂盒还可以选择性包含洗涤液，终止液和塑料吸管中的一种。
所述的测试条含有多个反应槽，可用于同时测定阳性对照，阴性对照以及一个或一个以上的待测样品，如聚苯乙烯。
所述的液滴瓶瓶口设有内盖和外盖，内盖有通道，通道上装有滤膜，外盖盖在内盖上，液滴瓶的口径一致，每滴液40-60微升。
所述的滤膜孔径为0. 1-lOOu。
所述的反应槽是事先经抗原(如溶于PBS缓冲液的l-20ug/ml灭活轮状病毒) 包被后封闭液(如溶于PBS缓冲液的2% BSA)封闭过的。
所述的反应液含有预先标记好的标记抗体，可特异性地识别待测抗体而不影响待测抗体与抗原结合，如溶于PBS缓冲液的BSA和抗人IgG探针-H (购于Clolumbia Bio 公司)。
所述的标记抗体是一种能直接或间接产生肉眼可见颜色的酶或胶体金(如碱性磷酸酶，过氧化氢酶)；
所述的阳性对照液含特异性抗体能识别包被在反应槽中的抗原，如溶于PBS缓冲液的BSA和抗轮状病毒抗体。
所述的阴性对照液含有阴性血清(如溶于PBS缓冲液的1 % BSA和无免疫过和未感染过待查病毒的正常人血清)，该阴性血清不能识别包被在反应槽中抗原。
所述的显色液是反应液中的抗体标记(如过氧化氢酶)的底物(如TMB)。
所述的液滴瓶的口径一致，每滴液40-60微升，误差小于3微升。
现场用高灵敏度免疫检测方法，包括以下步骤
1)、加样反应取一测试条，在每个反应槽边上作记号，如1，2，. . . 8 ；在各反应槽中加入5滴反应液，再分别在反应槽1和反应槽2中加入2滴阳性对照液和阴性对照液，其它反应槽中加入2滴待测样品，轻晃混勻后室温下静置10-30分钟。
2)、洗涤倒掉反应槽中液体并用过滤水(或自来水)冲洗反应槽5次或以上；每次冲洗后，将反应槽倒向摔在吸水纸(如卫生纸)上以除去反应槽内水珠。
3)、显色在每个反应槽内加入6滴显色液，轻晃测试条并观察反应槽中颜色变化，直至阳性反应槽内有清晰的颜色出现。
4)、结果分析比较各反应槽(阳性对照，阴性对照和各样品)的颜色深浅程度以确定该被检样品是阳性还是阴性，正常情况下，阳性对照显深蓝色，阴性对照不显色或浅蓝色；如果被检样品的颜色明显比阴性对照深，说明该被检样品为阳性；如果被检样品的颜色与阴性对照相同或更浅说明该被检样品为阴性。如果被检样品的颜色比阴性对照稍深说明该被检样品为拟似阳性。
本发明专利优点是实现了在一次现场检测实验中，能同时测定样品，阳性对照和阴性对照，避免了使用免疫层析试纸条时可能隐藏的假阳性和假失效的结果，从而能正确地界定检测结果及有效性。


图1为本发明试剂盒结构示意图中标记测试条1、反应液2、阳性对照液3、阴性对照液4、显色液5、液滴瓶6。
具体实施例方式
为了加深对本发明的理解，本发明针对轮状病毒感染抗体场用高灵敏度免疫检测方法进行速测。
1.原材料及试剂制备
稀释液将1克BSA (牛血清蛋白，购于SIGMA公司)溶于100毫升PBS缓冲液，便制得BSA/PBS，无菌过滤后置于冰箱备用。
反应液用上述稀释液将过氧化氢酶-酶标100X抗人IgG抗体探针-H，(购于 Clolumbia Bio公司)稀释成IX，无菌过滤后装在所述的液滴瓶里，置于冰箱备用。
测试条将轮状病毒抗原用IOOmM Tris-HCl (pH8)缓冲液稀释至Ι-lOug/ml)，取 100微升于8-孔槽测试条的槽中，静置1小时或以上；洗槽后用上述稀释液封闭1小时或以上，再洗槽后，于45度。C烘干，用铝箔袋真空包装，置于冰箱备用。
阳性对照兔抗轮状病毒抗体，将该抗体用稀释液稀释1千倍，无菌过滤后装在滴瓶(1毫升/瓶)里，置于冰箱备用。
阴性对照将未接种过轮状病毒疫苗的正常人血清，将该血清用稀释液稀释1千倍，无菌过滤后装在滴瓶(1毫升/瓶)里，置于冰箱备用。
待测样品1 接种过轮状病毒疫苗的儿童人血清；
待测样品2 未接种过轮状病毒疫苗的正常人血清；
显色液TMB显色液(购于Columbia Bio公司)，无菌过滤后装在本发明所述的滴瓶里，置于冰箱备用。
2.检测方法
1)、加样取一测试条，在各反应槽中加入5滴反应液；自上而下，分别在反应槽1 和2中加入2滴阳性对照液，反应槽3和4中加入2滴阴性对照液，在反应槽5和6中加入待测样品1，在反应槽7和8中和待测样品2，轻晃混勻后室温下静置20分钟。
2)、洗槽倒掉反应槽中液体并用自来水冲洗反应槽5次；每次冲洗后，将反应槽倒向摔在吸水纸(卫生纸)上以除去反应槽内水珠。
3)、显色在每个反应槽内加入6滴显色液，轻晃测试条并观察反应槽中颜色变化，直至阳性反应槽内有清晰的颜色出现，
4)、判断结果比较各反应槽(阳性对照，阴性对照和各样品)的颜色深浅程度以确定该被检样品是阳性还是阴性。
检测结果阳性对照显深蓝色，阴性对照不显色；被检样品1的颜色明显比阴性对照深，说明该被检样品为阳性；被检样品2的颜色与阴性对照相同说明该被检样品为阴性。
本发明现场用高灵敏度免疫检测方法及试剂盒，具有结构简单，使用方便，不需要仪器就能检测，检测灵敏度高比原有免疫层析试纸条高出十倍以上等优点。
权利要求
1.现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，由测试条、反应液、阳性对照液、阴性对照液、显色液、液滴瓶组成；其特征在于测试条放置于试剂盒内，反应液、阳性对照液、阴性对照液、 显色液分别装在相应的液滴瓶内。
2.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的测试条含有多个反应槽。
3.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的液滴瓶瓶口设有内盖和外盖，内盖有通道，通道上装有滤膜，外盖盖在内盖上，液滴瓶的口径一致，每滴液40-60微升。
4.根据权利要求2所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的反应槽是事先经抗原包被后封闭液封闭过的。
5.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的反应液含有预先标记好的标记抗体。
6.根据权利要求5所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的标记抗体是一种能直接或间接产生肉眼可见颜色的酶或胶体金。
7.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照液含特异性抗体。
8.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照液含有阴性血清。
9.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测试剂盒，其特征在于所述的显色液是反应液中的抗体标记的底物。
10.根据权利要求1所述的现场用高灵敏度免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤1)、加样反应取一测试条，在每个反应槽边上作记号，如1，2，...8;在各反应槽中加入5滴反应液，再分别在反应槽1和反应槽2中加入2滴阳性对照液和阴性对照液，其它反应槽中加入2滴待测样品，轻晃混勻后室温下静置10-30分钟。2)、洗涤倒掉反应槽中液体并用过滤水(或自来水)冲洗反应槽5次或以上；每次冲洗后，将反应槽倒向摔在吸水纸(如卫生纸)上以除去反应槽内水珠。3)、显色在每个反应槽内加入6滴显色液，轻晃测试条并观察反应槽中颜色变化，直至阳性反应槽内有清晰的颜色出现。4)、结果分析比较各反应槽(阳性对照，阴性对照和各样品)的颜色深浅程度以确定该被检样品是阳性还是阴性，正常情况下，阳性对照显深蓝色，阴性对照不显色或浅蓝色； 如果被检样品的颜色明显比阴性对照深，说明该被检样品为阳性；如果被检样品的颜色与阴性对照相同或更浅说明该被检样品为阴性。如果被检样品的颜色比阴性对照稍深说明该被检样品为拟似阳性。
全文摘要
本发明公开了现场用高灵敏度免疫检测方法及试剂盒，测试条放置于试剂盒内，反应液、阳性对照液、阴性对照液、显色液分别装在相应的液滴瓶内，测试条含有多个反应槽；液滴瓶瓶口设有内盖和外盖，内盖有通道，通道上装有滤膜，外盖盖在内盖上，液滴瓶的口径一致，每滴液40-60微升；反应液含有预先标记好的标记抗体；阳性对照液含特异性抗体；阴性对照液含有阴性血清；显色液是反应液中的抗体标记的底物；本发明通过加样反应、洗涤、显色、结果分析步骤，实现了在一次现场检测实验中，能同时测定样品，阳性对照和阴性对照。
文档编号G01N33/543GK102539749SQ20121003468
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者肖瑶, 邹潮 申请人:江阴康奈尔生物科技有限公司